布鲁氏菌Bp26蛋白单克隆抗体制备及生物学鉴定 被引量：1

1

作者 罗意 马春慧 +5 位作者 郑福英 李永清 樊晓旭 储岳峰 周沛 许健 《中国农业大学学报》 北大核心 2025年第7期139-149,共11页

为制备布鲁氏菌Bp26蛋白单克隆抗体并对其进行生物学特性鉴定,本研究利用原核表达系统制备Bp26重组蛋白,以纯化的Bp26蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对布鲁氏菌Bp26蛋白的单克隆抗体,采用免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定其特... 为制备布鲁氏菌Bp26蛋白单克隆抗体并对其进行生物学特性鉴定,本研究利用原核表达系统制备Bp26重组蛋白,以纯化的Bp26蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对布鲁氏菌Bp26蛋白的单克隆抗体,采用免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定其特异性,并通过ELISA测定亲和力常数及阻断活性,最后采用斑点杂交试验鉴定抗原识别表位。结果表明:1)成功表达布鲁氏菌Bp26蛋白,其相对分子质量在26 ku左右。2)获得2株Bp26单克隆抗体细胞株(6E8和4C4)。免疫印迹显示,2株Bp26单抗与重组Bp26蛋白和布鲁氏菌菌体Bp26蛋白均有较强的特异性反应;间接免疫荧光试验表明,Bp26单抗能够特异性识别感染巨噬细胞的羊种布鲁氏菌M5-90株,但不能识别感染巨噬细胞的M5-90△Bp26株。ELISA显示,单抗6E8和4C4的亲和力常数分别为2.58×10^(-7)和2.34×10^(-7)mol/L,抗体阻断率均达到80%以上。斑点杂交结果显示,单抗6E8识别表位氨基酸序列为23ASPDMAILNL32,单抗4C4为73GINIQPIYVYPD84。综上,本研究成功制备了针对布鲁氏菌Bp26蛋白不同抗原表位的2种单克隆抗体,其具有较好的特异性、结合力及阻断活性,不仅为进一步探索布鲁氏菌Bp26蛋白的生物学特性奠定基础,而且为布鲁氏菌诊断技术的建立提供技术支持。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26蛋白 单克隆抗体 表位鉴定

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布鲁氏菌BP26蛋白原核表达及双抗原夹心ELISA方法的建立

2

作者 席韬 罗俊聪 +9 位作者 朱昱茜 林永玉 陈婕 张帆 石鑫泰 何印娣 李帅鹏 徐继英 田宏 郑海学 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第5期608-615,共8页

以期建立鉴别检测布鲁氏菌血清抗体的ELISA方法,用于区分BP26基因缺失疫苗免疫。本研究根据NCBI公布的布鲁氏菌M5-90株的参考序列,通过预测BP26的同源性、跨膜区及抗原性等,构建了p ET-28a-BP26和p MAL-c2x-BP26两个载体,利用大肠杆菌... 以期建立鉴别检测布鲁氏菌血清抗体的ELISA方法,用于区分BP26基因缺失疫苗免疫。本研究根据NCBI公布的布鲁氏菌M5-90株的参考序列,通过预测BP26的同源性、跨膜区及抗原性等,构建了p ET-28a-BP26和p MAL-c2x-BP26两个载体,利用大肠杆菌表达蛋白,亲和层析纯化目的蛋白。采用Western-blot方法分析目的蛋白反应活性,以His-BP26作为包被抗原,HRP标记的MBP-BP26作为检测抗原,经过优化,建立了一种双抗原夹心ELISA方法。结果显示,根据统计学分析,双抗原夹心ELISA临界值为0.35;经检验,该方法与口蹄疫病毒-O型、牛结节皮肤病病毒、牛传染性腹泻病毒的抗体阳性血清以及赤羽病病毒多抗均无交叉反应,敏感性可达1∶640;批间及批内变异系数均小于10%。用该方法对40份已知虎红平板凝集试验检测背景的羊血清进行检测,结果检出8份阳性,32份阴性。由此说明,本研究建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,可区分BP26基因缺失疫苗免疫,用于布鲁氏菌病的血清学调查和临床诊断。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26 原核表达 双抗原夹心ELISA

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基于布鲁菌bp26基因LAMP检测方法的建立及优化 被引量：4

3

作者 马世辉 贾沅铮 +5 位作者 王福成 连丽燕 蒋蔚 陈兆国 韩先干 陈伟 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1043-1049,共7页

布鲁菌病严重影响畜牧业发展和公共卫生安全,及时、准确地检测布鲁菌是该病防控的关键。本研究基于布鲁菌bp26基因设计特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,建立布鲁菌LAMP检测方法。为获得最佳反应条件,对镁离子浓度、LAMP引物比例、反... 布鲁菌病严重影响畜牧业发展和公共卫生安全,及时、准确地检测布鲁菌是该病防控的关键。本研究基于布鲁菌bp26基因设计特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,建立布鲁菌LAMP检测方法。为获得最佳反应条件,对镁离子浓度、LAMP引物比例、反应设备等条件进行优化,对建立的LAMP检测方法的灵敏度、特异性进行评价。结果显示,建立的LAMP反应体系中镁离子浓度为8 mmol/L,内外引物比为6∶1时为最佳体系;分别在金属浴、恒温水浴锅、烘箱等不同环境下实验,结果无差异;对大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等8种不同细菌的特异性检测结果显示,该方法特异性良好。在最佳反应条件下,检测灵敏度为10 pg/μL。为获得良好的可视化检测效果,通过对反应体系中不同浓度的锰离子浓度进行优化,结果显示,锰离子浓度为0.1 mmol/L时可以建立最佳可视化效果。本研究建立的布鲁菌LAMP检测方法特异、灵敏、可视化,为布鲁菌的临床快速检测提供了技术支持。 展开更多

关键词 布鲁菌 环介导等温扩增 bp26 可视化检测

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布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备和免疫学评价 被引量：1

4

作者 林海 涂飞 +4 位作者 李楠 孙洋 姜博文 纪雪 刘军 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第6期37-46,共10页

为了构建布鲁氏菌外膜蛋白BP26细菌样颗粒候选疫苗BLPs-BP26,并评价其免疫原性,本试验首先分别扩增羊种布鲁氏菌16M株编码BP26蛋白的整个基因序列和乳酸乳球菌MG1363株编码肽聚糖锚钩蛋白(PA)的整个基因序列,通过重叠延伸PCR技术将bp26... 为了构建布鲁氏菌外膜蛋白BP26细菌样颗粒候选疫苗BLPs-BP26,并评价其免疫原性,本试验首先分别扩增羊种布鲁氏菌16M株编码BP26蛋白的整个基因序列和乳酸乳球菌MG1363株编码肽聚糖锚钩蛋白(PA)的整个基因序列,通过重叠延伸PCR技术将bp26基因与PA基因连接构建融合基因bp26-PA,将融合基因bp26-PA克隆至pET-28a原核表达载体并诱导表达融合蛋白BP26-PA。将表达正确的BP26-PA融合蛋白与细菌样颗粒(BLPs)结合构建BLPs-BP26,通过SDS-PAGE、Western blot、间接免疫荧光和冷冻超薄切片对BLPs-BP26进行鉴定。将BLPs-BP26免疫小鼠,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠特异性IgG抗体水平,实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)分析免疫小鼠脾脏组织中干扰素γ(IFN-γ)和白介素2(IL-2)的基因转录水平,ELISA方法检测免疫小鼠血清中IFN-γ和IL-2的蛋白表达水平。鉴定结果显示,BP26-PA蛋白成功展示在BLPs表面;免疫小鼠试验结果显示,小鼠血清特异性IgG抗体效价最高可达1∶1 024 000;与PBS组相比,BLPs-BP26组免疫小鼠脾脏组织中IFN-γ和IL-2基因的转录水平均极显著升高(P值分别为P<0.000 1和P<0.01),小鼠血清中IFN-γ的表达水平极显著升高(P<0.000 1)。结果表明,BLPs-BP26能刺激小鼠产生高水平的特异性IgG抗体,并可诱导小鼠产生细胞免疫应答。本试验为开发具有良好免疫原性且无安全隐患的布鲁氏菌新型疫苗提供了新的思路。 展开更多

关键词 表面展示技术 布鲁氏菌 bp26蛋白 细菌样颗粒疫苗

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布鲁氏菌Bp26蛋白原核表达的优化与间接ELISA检测方法的建立 被引量：1

5

作者 刘尚博 王振华 +1 位作者 秦建华 郑可 《现代畜牧科技》 2024年第10期27-31,共5页

为原核表达布鲁氏菌Bp26蛋白,利用布鲁氏菌M5-90疫苗株扩增得到Bp26基因片段,克隆构建pET28a-XXA-HRV 3C-Bp26原核表达载体,通过诱导表达和Ni-NTA亲和纯化得到XXA-HRV 3C-Bp26重组蛋白,再使用PreScission Protease酶切得到无标签的Bp26... 为原核表达布鲁氏菌Bp26蛋白,利用布鲁氏菌M5-90疫苗株扩增得到Bp26基因片段,克隆构建pET28a-XXA-HRV 3C-Bp26原核表达载体,通过诱导表达和Ni-NTA亲和纯化得到XXA-HRV 3C-Bp26重组蛋白,再使用PreScission Protease酶切得到无标签的Bp26蛋白。通过SDS-PAGE和Western Blot试验结果,证明成功表达XXA-HRV 3C-Bp26重组蛋白,且蛋白是可溶性表达,并通过酶切获得了无任何标签的Bp26蛋白。以Bp26蛋白做为诊断抗原,初步建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法,通过与商用布鲁氏菌ELISA检测试剂盒对256份羊血清样本进行检测,符合率为93.75%,证明建立的布鲁氏菌间接ELISA检测方法可以做为临床中的一种布鲁氏菌病检测方法。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26蛋白 间接ELISA

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布鲁氏菌外膜蛋白BP26细胞毒性作用的研究 被引量：9

6

作者 陈瑞花 张辉 +6 位作者 唐利燕 孟茹 张豫 王震 李志强 张俊波 陈创夫 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第16期3406-3413,共8页

【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌b... 【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株,用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞,观察细胞形态变化,ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得纯化的BP26蛋白,经SDS-PAGE验证正确,Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp26基因的上下臂插入到自杀载体pGEM-7zf中,电转至布鲁氏菌疫苗株M5-90感受态细胞中,成功筛选出了具有遗传稳定性的bp26基因缺失株。用BP26蛋白与bp26基因缺失株分别侵染HPT-8层细胞,BP26蛋白使细胞变形且贴壁不牢,缺失株导致细胞大量脱落溶解,ELISA检测蛋白侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α和LDH均高于PBS对照组,差异极显著(P<0.01),而细胞因子IL-10的分泌下降。缺失株侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α均高于M5-90对照组,LDH和IL-10均低于M5-90对照组,差异显著(P<0.05)。【结论】成功获得了布鲁氏菌BP26蛋白和M5-90Δbp26缺失株,BP26蛋白可以引起HPT-8细胞的炎性反应,有细胞毒性作用,bp26基因缺失株对HPT-8细胞有损伤作用,bp26基因在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中起重要作用。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26蛋白 bp26缺失株 细胞因子

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布鲁氏菌bp26基因缺失株的构建 被引量：17

7

作者 潘文 王佳莹 +5 位作者 赵明秋 琚春梅 易琳 常艳 虞红娇 陈金顶 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期280-286,共7页

选择含有反向筛选基因sacB标记的pRE112质粒为自杀载体,利用等位基因交换的方法成功敲除了布鲁氏菌弱毒疫苗S19株、S2株、M5株的bp26基因,构建了具有非抗性基因标记的缺失株S19-Δbp26、S2-Δbp26、M5-Δbp26。将构建的重组自杀质粒pRE-... 选择含有反向筛选基因sacB标记的pRE112质粒为自杀载体,利用等位基因交换的方法成功敲除了布鲁氏菌弱毒疫苗S19株、S2株、M5株的bp26基因,构建了具有非抗性基因标记的缺失株S19-Δbp26、S2-Δbp26、M5-Δbp26。将构建的重组自杀质粒pRE-Δbp26(缺失了bp26基因的681个碱基)电转化入布鲁氏菌后,经过5μg/mL氯霉素筛选单交换子和70g/L蔗糖筛选同源重组双交换子,用菌落PCR及DNA测序的方法进行验证。结果表明,bp26基因的缺失改造成功,连续传20代后菌落PCR及DNA测序的结果显示突变株具有遗传稳定性。以pRE112自杀质粒为基础构建无抗性基因标记的布鲁氏菌缺失株为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础,同时Δbp26缺失株的构建可为新型布鲁氏菌疫苗的研制奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26基因 自杀质粒 基因缺失株

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重组布氏杆菌BP26蛋白和OMP31蛋白作为间接ELISA诊断抗原的研究 被引量：13

8

作者 陈伟业 王淑杰 +6 位作者 王永 胡森 王清华 辛九庆 佟有恩 黄克和 步志高 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期518-521,582,共5页

目的传统布氏杆菌病血清学方法因其抗原构成复杂,存在较严重的交叉免疫反应性,导致结果判定困难。BP26及OMP31分别为布氏杆菌细胞周质蛋白及外膜蛋白,在感染牛、绵羊、山羊、犬和人类均为优势免疫原,且在抗原性上具有较好的布氏杆菌种... 目的传统布氏杆菌病血清学方法因其抗原构成复杂,存在较严重的交叉免疫反应性,导致结果判定困难。BP26及OMP31分别为布氏杆菌细胞周质蛋白及外膜蛋白,在感染牛、绵羊、山羊、犬和人类均为优势免疫原,且在抗原性上具有较好的布氏杆菌种属特异性。方法以大肠杆菌表达、纯化的BP26和OMP31重组蛋白为包被抗原,初步建立了检测血清特异抗体的间接ELISA方法,并以现地牛布氏杆菌普查检测血清100份为样本,与传统的试管凝集试验进行了比较研究。结果试管凝集试验血清样本阳性率为15%(15/100);BP26包被抗原ELISA检测判为阳性的12个样本中有11为试管凝集反应阳性,相对阳性率为73.3%,二者阳性符合率为92%(11/12);而采用OMP31为包被抗原,阳性检出率为0(图5)。结论被检测区域阳性牛主要感染布氏杆菌为牛种布氏杆菌(B.abortus天然缺失OMP31基因);BP26作为间接ELISA包被抗原用于牛布氏杆菌血清学检测具有良好的特异性及较好的敏感性。 展开更多

关键词 布氏杆菌bp26 OMP31 间接ELISA 试管凝集试验

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马耳它布氏杆菌bp26基因缺失株的构建及鉴定 被引量：17

9

作者 胡森 郑孝辉 +8 位作者 王加兰 张倩 刘文兴 王喜军 乔祖建 刘林涛 高红霞 王君伟 步志高 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期583-586,共4页

为了建立马耳他布氏杆菌M5-90株弱毒疫苗株与野生株的鉴别诊断,本研究以bp26基因作为重组靶位点,以M5-90为亲本,利用bp26基因ORF外侧序列作为同源序列,将卡那霉素抗性基因(Kanr)整合到细菌基因组中,双交叉重组阳性菌株,经SDS-PAGE和west... 为了建立马耳他布氏杆菌M5-90株弱毒疫苗株与野生株的鉴别诊断,本研究以bp26基因作为重组靶位点,以M5-90为亲本,利用bp26基因ORF外侧序列作为同源序列,将卡那霉素抗性基因(Kanr)整合到细菌基因组中,双交叉重组阳性菌株,经SDS-PAGE和western blot试验表明迁移率约为29ku的BP26蛋白在亲本菌中表达并可被鼠抗BP26高免血清识别,而突变株M5-90-26反应结果为阴性,表明BP26蛋白在突变疫苗株M5-90-26中未表达。M5-90-26具备从血清学角度区分M5-90-26免疫与野生型布氏杆菌感染,对布氏杆菌病防制、监测及净化具有重要的意义。 展开更多

关键词 重组布氏杆菌 M5—90 bp26基因 突变株

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牛布鲁氏菌BP26间接ELISA检测方法的建立 被引量：11

10

作者 左玉柱 王增利 +2 位作者 路广计 王振来 郑丽丽 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期223-226,共4页

为建立检测牛布鲁氏菌(Brucella)血清抗体的间接ELISA方法,本研究将原核表达并纯化的Brucella外膜蛋白BP26作为包被抗原,采用方阵法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,经过对各种反应条件进行优化,建立了牛Brucella间接ELISA抗体检... 为建立检测牛布鲁氏菌(Brucella)血清抗体的间接ELISA方法,本研究将原核表达并纯化的Brucella外膜蛋白BP26作为包被抗原,采用方阵法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,经过对各种反应条件进行优化,建立了牛Brucella间接ELISA抗体检测方法。该方法对其他相关的牛病病原无交叉反应,其组内和组间的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。对100份临床血清样品进行检测,同时将建立的间接ELISA方法与IDEXX公司的同类试剂盒进行比较,符合率为93%。本研究为布鲁氏菌病提供了一种简便的血清学诊断方法。 展开更多

关键词 牛布鲁氏菌 bp26蛋白 间接ELISA

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布鲁氏菌BP26蛋白的表达纯化及其抗原性的研究 被引量：8

11

作者 宫晓炜 景涛 +3 位作者 王国治 李恪梅 王秉翔 傅林锋 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1085-1088,共4页

目的获得布鲁氏菌感染血清学诊断优势抗原BP26重组蛋白。方法应用PCR技术从布鲁氏菌减毒株(104M)中扩增出bp26目的基因片段,将其克隆于表达载体PET30a中,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,用亲和层析纯化BP26重组蛋白,然后分别... 目的获得布鲁氏菌感染血清学诊断优势抗原BP26重组蛋白。方法应用PCR技术从布鲁氏菌减毒株(104M)中扩增出bp26目的基因片段,将其克隆于表达载体PET30a中,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,用亲和层析纯化BP26重组蛋白,然后分别用Western-blot,间接ELISA检测其抗原性。结果DNA测序及酶切鉴定证实PET-30a/bp26原核表达载体构建成功,并在大肠杆菌中高效表达,免疫印迹和间接ELISA实验证明BP26重组蛋白可与布鲁氏菌阳性血清产生特异性结合。结论成功获得了布鲁氏菌中序列全长为696bp,编码232个氨基酸的BP26蛋白,通过血清学反应证实,该蛋白为人和动物布鲁氏菌病临床诊断试剂盒的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26重组蛋白 抗原性

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布鲁氏菌bp26基因的原核表达及BP26-间接ELISA方法的初步建立 被引量：12

12

作者 唐利燕 陈创夫 +2 位作者 王远志 张辉 张红星 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2009年第4期437-440,共4页

为了表达并纯化布鲁氏菌BP26蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。方法:从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆bp26基因,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,纯化BP26蛋白,进行SDS-PAGE、Western-blot检测,将纯化的BP26蛋白包被ELISA板,建立检... 为了表达并纯化布鲁氏菌BP26蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。方法:从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆bp26基因,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,纯化BP26蛋白,进行SDS-PAGE、Western-blot检测,将纯化的BP26蛋白包被ELISA板,建立检测布鲁氏菌病的间接ELISA方法,用该方法检测42份绵羊血清,结果与标准试管凝集试验(SAT)进行比较。结果显示:正确表达并纯化了BP26蛋白,布鲁氏菌标准试管凝集试验检测的阳性率为30.85%(13/42);间接ELISA方法检测的阳性率为35.71%(15/42),二者阳性符合率为86.67%(13/ 15)。结论表达、纯化的BP26蛋白能够与布鲁氏菌阳性血清特异性结合,建立的ELISA方法比SAT方法更敏感。为以后M5-90疫苗株bp26基因缺失苗的应用提供配套性血清学检测奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26蛋白 间接ELISA 标准试管凝集实验

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流产布鲁氏菌bp26和omp10基因的同源性分析 被引量：5

13

作者 王军 王瑞 +1 位作者 申之义 杨莲茹 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期25-30,共6页

利用布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因和omp10基因,对分离的布鲁氏菌和参考布鲁氏菌菌株进行克隆和序列分析,以明确分离的布鲁氏菌和参考布鲁氏菌菌株与基因库中的布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因和omp10基因间的同源性。根据GenBank中的布鲁氏菌bp2... 利用布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因和omp10基因,对分离的布鲁氏菌和参考布鲁氏菌菌株进行克隆和序列分析,以明确分离的布鲁氏菌和参考布鲁氏菌菌株与基因库中的布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因和omp10基因间的同源性。根据GenBank中的布鲁氏菌bp26基因和omp10基因,分别设计合成了1对特异性引物,以提取的分离株布鲁氏菌和2株参考布鲁氏菌的总DNA为模板,通过PCR技术扩增得到了bp26基因和omp10基因,回收纯化后将这2个基因分别连接到pMD18-T载体上,热激发转化受体菌大肠杆菌DH5α,并进行质粒提取、PCR鉴定和测序。结果表明,bp26基因全长为995bp,包含1个由753bp的核苷酸组成的完整开放阅读框,分离菌株的同源性为100%,与参考菌株M5、S2的同源性分别为100%和99.9%,与参考序列S19、870的同源性分别为99.9%和100%;omp10基因全长531bp,包含1个由396bp的核苷酸组成的完整开放阅读框,分离菌株的同源性为100%,与参考菌株M5、S2的同源性均为100%,与参考序列544的同源性为99.7%。证实bp26基因和omp10基因在各种型间的同源性都在99%以上,表明这2个基因在布鲁氏菌属的细菌中是高度保守的。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26基因 omp10基因 同源性 分析

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bp26对布鲁氏菌疫苗株M5免疫应答和免疫保护性的影响 被引量：5

14

作者 曲勍 汪舟佳 +3 位作者 甄清 黄留玉 于雅琴 陈泽良 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期438-442,446,共6页

对目前常用的羊布鲁氏菌减毒活疫苗株M5进行了遗传改造,利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了M5的bp26基因,得到了新的缺失突变株M5Δbp26,并对bp26对疫苗株M5的免疫应答和免疫保护效果的影响进行了初步评价。分别用M5Δbp26和M5免... 对目前常用的羊布鲁氏菌减毒活疫苗株M5进行了遗传改造,利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了M5的bp26基因,得到了新的缺失突变株M5Δbp26,并对bp26对疫苗株M5的免疫应答和免疫保护效果的影响进行了初步评价。分别用M5Δbp26和M5免疫小鼠,与M5比较,M5Δbp26的体液和细胞免疫应答能力均明显减弱,免疫保护效果也显著下降,说明bp26基因的缺失明显影响了M5疫苗株的免疫应答能力及其保护性,即bp26对疫苗株M5的免疫应答和保护效果有一定的影响。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26 免疫保护性

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布鲁氏菌bp26和OMP10基因的原核表达和鉴定 被引量：9

15

作者 陈瑶 李明 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期313-317,共5页

目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的表达、克隆与测序,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP10和bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-... 目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的表达、克隆与测序,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP10和bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-4T-1/bp26,在大肠杆菌中将该蛋白表达。用western-blot分析重组表达的GST-OMP10和GST-bp26的免疫学特性。结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP10和PGEX-4T-1/bp26原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了OMP10和bp26基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。结论布鲁氏菌外膜蛋白OMP10和bp26基因的成功表达,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 外膜蛋白OMP10 外膜蛋白bp26 免疫 诊断

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牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆与原核表达 被引量：3

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作者 左玉柱 王增利 +1 位作者 郑丽丽 张占霞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期91-95,共5页

根据GenBank中登录的牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术,牛流产病例分泌物为模板,扩增bp26的编码基因,得到1条753bp的片段。将其连入Simple-T载体中进行酶切和测序鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+... 根据GenBank中登录的牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术,牛流产病例分泌物为模板,扩增bp26的编码基因,得到1条753bp的片段。将其连入Simple-T载体中进行酶切和测序鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Rosetta(DE3)感受态细胞中,并用IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot检测。结果显示bp26基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为29ku,与预计的蛋白分子质量一致。Western-blot试验证明,该蛋白可以与患牛布氏杆菌的阳性血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性。 展开更多

关键词 bp26基因 克隆 原核表达

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呼和浩特市区牛种布鲁菌bp26和omp10的克隆 被引量：1

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作者 王军 王瑞 +3 位作者 杨莲茹 郭志亮 于翠玲 申之义 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第2期70-75,共6页

为明确试验布鲁菌和参考布鲁菌菌株与基因库中布鲁菌外膜蛋白BP26和OMP10基因间的同源性。利用布鲁菌外膜蛋白bp26和omp10基因,针对试验布鲁菌和参考布鲁菌菌株进行克隆和序列分析。根据GenBank发表的布鲁菌bp26基因和omp10基因,分别设... 为明确试验布鲁菌和参考布鲁菌菌株与基因库中布鲁菌外膜蛋白BP26和OMP10基因间的同源性。利用布鲁菌外膜蛋白bp26和omp10基因,针对试验布鲁菌和参考布鲁菌菌株进行克隆和序列分析。根据GenBank发表的布鲁菌bp26基因和omp10基因,分别设计合成一对特异性引物,以提取的试验布鲁菌和2株参考布鲁菌的总DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增得到bp26和omp10基因,回收纯化后将这两个基因分别连接到pMD18-T载体上,热激发转化受体菌大肠杆菌DH5α,质粒提取、PCR鉴定、测序。结果表明,bp26全长为995 bp,包含一个由753 bp组成的完整开放阅读框,试验菌株的同源性为100%,与参考菌株M5、S2的同源性分别为100%和99.9%,与参考序列S19、870的同源性分别为99.9%和100%。omp10全长531 bp,包含一个由396 bp组成的完整开放阅读框,试验菌株的同源性为100%,与参考菌株M5、S2的同源性均分别为100%,与参考序列544的同源性分别为99.7%。证实bp26基因和omp10基因在各种型间的同源性都在99%以上,表明这两个基因在布鲁菌属是高度保守的。 展开更多

关键词 布鲁菌 bp26 omp10 同源 分析

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布鲁菌bp26基因的原核表达及间接ELISA方法的临床初步应用 被引量：1

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作者 谷海峰 郭港 +2 位作者 刘雪梅 李天惠 李鲁平 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2015年第3期43-47,共5页

构建诊断人布病的优势抗原BP26原核表达载体,并建立以该蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法。人工合成bp26基因片段,构建原核表达载体pET30a-bp26,并转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,Ni柱亲和纯化BP26重组蛋白,间接ELISA检测其... 构建诊断人布病的优势抗原BP26原核表达载体,并建立以该蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法。人工合成bp26基因片段,构建原核表达载体pET30a-bp26,并转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,Ni柱亲和纯化BP26重组蛋白,间接ELISA检测其抗原活性,并优化间接ELISA方法的各个参数,检测临床大量样本,对该方法性能进行评价。PCR鉴定及DNA测序证实pET30a-1bp26重组质粒构建成功,并在0.8mmol/L IPTG 20℃过夜诱导的条件下大量表达,经亲和纯化获得高纯度的可溶性BP26重组蛋白,间接ELISA结果显示该重组蛋白具有抗原活性,优化参数后,该方法的敏感度为70.00%,特异性为94.74%。成功获得高抗原活性的原核表达可溶性BP26重组蛋白,并建立用于临床特异性诊断人类布病的间接ELISA方法。 展开更多

关键词 bp26重组蛋白 间接ELISA 布鲁菌

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羊布鲁杆菌M5-90BP26抗原单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：1

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作者 丘金浪 吴静波 +1 位作者 黎诚耀 王文敬 《中国地方病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期361-364,共4页

目的制备高亲和性的羊布鲁杆菌M5—90BP26抗原单克隆抗体，并对抗体进行鉴定。方法将质粒pET-28a—BP26转化感受态大肠埃希菌（E．coli）BL21（DE3），构建原核表达质粒pET-28a—BP26，用镍离子金属螯合亲和层析法（Ni—NTA）纯化、重组... 目的制备高亲和性的羊布鲁杆菌M5—90BP26抗原单克隆抗体，并对抗体进行鉴定。方法将质粒pET-28a—BP26转化感受态大肠埃希菌（E．coli）BL21（DE3），构建原核表达质粒pET-28a—BP26，用镍离子金属螯合亲和层析法（Ni—NTA）纯化、重组BP26蛋白（rBP26）。将纯化后的rBP26蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合成乳化抗原。按每只100μg／0．1ml在BALB／c小鼠皮下多点注射进行初次免疫；2周后，按每只50μg／0．1ml在小鼠皮下多点注射进行再次免疫。再次免疫后2周，小鼠尾静脉取血测效价，检测免疫效果；在细胞融合前3天，将乳化抗原按每只小鼠50μg腹腔注射加强免疫。将小鼠骨髓瘤SP2／O细胞与脾细胞按1：5比例在聚乙二醇（PEG）1450作用下进行细胞融合，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；10d后取细胞培养上清液，用间接酶联免疫吸附法（ELISA）测定，筛选分泌抗rBP26抗体的杂交瘤细胞；再经过反复3次克隆，筛选出单克隆全阳性的杂交瘤细胞建株，用杂交瘤细胞株制备BP26抗原单克隆抗体，并以初始杂交瘤细胞克隆号命名。利用羊布鲁杆菌M5～90疫苗株制备膜蛋白提取物（NMP），采用免疫印迹法（Western）及斑点间接酶联免疫吸附法（Dot—ELISA）对筛选的单克隆抗体进行免疫学特性鉴定，用单克隆抗体亚型试剂盒进行抗体分型和Kappa（K）和Lambda（入）轻链鉴定。结果成功地获得2株能稳定分泌抗rBP26抗原的高亲和性杂交瘤3C3和5A5单克隆抗体，并能与羊布鲁杆菌M5—90疫苗株上的NMP结合，构建成M5—90BP26抗原单克隆抗体，抗体亚型分别为IgG1和IgG2b，轻链均为K链。结论鉴定结果表明，成功制备2株羊布鲁杆菌BP26抗原的高亲和性单克隆抗体，抗体具有识别M5—90疫苗株的膜蛋白构象表位的能力，优势表位的识别可为羊布鲁杆菌M5—90疫苗株的改造提供实验依据。 展开更多

关键词 布鲁杆菌 羊 膜间质蛋白bp26 抗体 单克隆

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羊种布鲁氏菌BP26蛋白的生物信息学分析 被引量：1

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作者 赵庆亮 卢梅 +4 位作者 谭艳 冉光鑫 王慧颖 赵新霞 盛金良 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第11期1277-1282,共6页

目的采用生物信息学方法预测羊种布鲁氏菌BP26蛋白的抗原表位。方法从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的BP26蛋白的氨基酸序列,利用ExPASy蛋白分析在线软件ProtParam、SOPMA、SWISS MODEL、ProtScale、Signal 5.0、TMHMM 2.0、PSOTR,分析BP2... 目的采用生物信息学方法预测羊种布鲁氏菌BP26蛋白的抗原表位。方法从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的BP26蛋白的氨基酸序列,利用ExPASy蛋白分析在线软件ProtParam、SOPMA、SWISS MODEL、ProtScale、Signal 5.0、TMHMM 2.0、PSOTR,分析BP26蛋白的理化性质,二、三级结构,亲、疏水性,信号肽,跨膜区及亚细胞定位;使用IEDB分析BP26蛋白的B细胞表位;使用PROSITE SCAN分别BP26蛋白的结构域分析。结果BP26蛋白由250个氨基酸组成,分子式为C1152H1898N328O364S12,相对分子质量为26.5×10^3,理论等电点为6.39,不稳定系数为27.93,为稳定蛋白。二级结构以α-螺旋为主,占41.2%;无规卷曲占36.8%,延伸链占17.2%;β-转角占4.8%。预测其三级结构与同源模板S19株BP26蛋白相似性99.55%,16个BP26分子形成一个新颖的通道状结构。BP26蛋白存在1个跨膜区,该跨膜区域位于7-29位氨基酸,可能为信号肽,与信号肽分析结果一致。Signal 5.0分析BP26蛋白在7-29位氨基酸有一个分泌型蛋白信号肽。BP26蛋白包含有14个线性表位,其中以27-42、108-125、224-240位氨基酸区段为BP26蛋白的优势抗原表位区段。BP26蛋白包含2个N-糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化作用位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点,5个N-豆蔻酰基化位点;亚细胞定位分析BP26蛋白为膜周质蛋白。结论生物信息学分析羊种布鲁氏菌BP26蛋白存在多个B细胞抗原表位,可以作为布鲁氏菌诊断和疫苗研究的候选抗原。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26蛋白 抗原表位 生物信息学分析

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