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家蚕抗BmNPV细胞因子的筛选和分析
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作者 王菲 李显扬 +1 位作者 化晓婷 夏庆友 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期789-799,共11页
【目的】探讨家蚕NF-κB类转录因子Bm Relish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当Bm NPV... 【目的】探讨家蚕NF-κB类转录因子Bm Relish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当Bm NPV感染家蚕Bm E细胞后Bm Relish全长形式(Bm Relish-FL)是否转变成其活性形式(Bm Relishact);利用荧光定量PCR检测过表达Bm Relishact的细胞在感染Bm NPV后胞内病毒DNA的相对水平,观测在被荧光标记的Bm NPV(Bm NPV-EGFP)感染后呈现EGFP荧光的细胞数,并与作为对照的未表达Bm Relishact的细胞相比较,以确定Bm Relish是否参与抗病毒免疫;将新鲜细胞通过Transwell细胞共培养体系经过表达Bm Relishact的细胞上清培养液孵育后,定量检测在感染Bm NPV后胞内病毒DNA的相对水平,以探讨过表达Bm Relishact的细胞是否产生并分泌抗病毒细胞因子;通过超滤等方法对过表达Bm Relishact的细胞上清培养液予以初步分离,将滤过液和截留液分别孵育新鲜细胞,定量检测感染Bm NPV后胞内病毒DNA的相对水平,从而确定抗病毒细胞因子的分子量范围;用高温处理滤过液和截留液后再孵育新鲜细胞,定量检测感染Bm NPV后胞内病毒DNA的相对水平以确定抗病毒细胞因子的属性;利用LC-MS/MS对滤过液中的多肽做进一步鉴定和分析。【结果】Bm E细胞被Bm NPV感染后,部分Bm Relish-FL转变成其活性形式Bm Relishact;过表达Bm Relishact的细胞被Bm NPV感染后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于对照细胞,且呈现EGFP荧光的细胞数也较对照少;新鲜细胞经过表达Bm Relishact的细胞上清培养液孵育后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于用对照细胞上清培养液孵育的细胞;用100和3 k D超滤管超滤过表达Bm Relishact的细胞上清培养液后,滤过液仍然具有显著降低所孵育细胞的胞内病毒DNA的相对水平,而截留液无此活性;经高温处理后,该细胞上清培养液不再具有降低所孵育细胞的胞内病毒DNA相对水平的作用;在滤过液中通过质谱鉴定到67个肽段,长度为9—45个氨基酸,富集到32个蛋白质,分子量均>3 k D,其中9个蛋白质含有信号肽。【结论】Bm NPV感染导致Bm Relish的激活;活化的Bm Relish促进细胞产生抗病毒细胞因子并分泌到上清培养液中;该细胞因子具有增强细胞抗病毒能力的活性,为分子量<3 k D的多肽。 展开更多
关键词 家蚕 家蚕核型多角体病毒 bmrelish 细胞因子 抗病毒免疫
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家蚕BmCaspase-8-Like(BmCasp8L)的免疫负调控功能 被引量：1
2
作者 胡杰 王鑫怡 王菲 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第21期4188-4196,共9页
【目的】在个体和细胞水平上探讨家蚕(Bombyx mori)BmCaspase-8-Like(BmCasp8L)的免疫负调控功能,为研究昆虫免疫负调控机制提供参考。【方法】通过RT-PCR技术克隆BmCasp8L并进行结构域预测和进化分析;利用荧光定量PCR检测BmCasp8L在家... 【目的】在个体和细胞水平上探讨家蚕(Bombyx mori)BmCaspase-8-Like(BmCasp8L)的免疫负调控功能,为研究昆虫免疫负调控机制提供参考。【方法】通过RT-PCR技术克隆BmCasp8L并进行结构域预测和进化分析;利用荧光定量PCR检测BmCasp8L在家蚕各龄期、5龄第3天及预蛹期各组织中的时空表达特征和家蚕感染细菌后的免疫诱导表达特征;合成用于RNAi的dsRNA,通过注射dsRNA在个体中降低BmCasp8L的表达水平,并检测对抗菌肽基因表达水平的影响;构建BmCasp8L的细胞表达载体,通过质粒或dsRNA的转染在BmE细胞中过表达BmCasp8L或降低BmCasp8L的表达水平,并利用Western blot或定量PCR予以确认,同时检测抗菌肽基因表达水平的变化及转录因子BmRelish的切割。【结果】BmCasp8L与鳞翅目Caspase-6、哺乳动物Caspase-8同源,其序列与BmDredd、DmDredd N端分别具有61%、42%的相似性,但缺少C端的Caspase结构域。时空表达特征分析表明,BmCasp8L在眠蚕期表达量高于起蚕期,在预蛹期、蛹第7天、蛾第1天表达量明显升高;在5龄第3天幼虫体内,BmCasp8L在血细胞中的表达量明显高于其他组织,而在预蛹期,BmCasp8L主要在丝腺中表达。免疫诱导表达谱显示,5龄第3天家蚕在注射感染黑胸败血芽孢杆菌或粘质沙雷氏菌1 h内,BmCasp8L的表达水平上升,此后逐渐恢复正常。对5龄第2天家蚕注射dsCasp8L或dsEGFP,24 h后通过荧光定量PCR检测到BmCasp8L的表达量在注射dsCasp8L的家蚕中显著下调,而抗菌肽BmCecropinA1的表达水平显著上调。在BmE细胞中过表达BmCasp8L,抗菌肽BmCecropinA1的表达水平与对照相比显著降低,且转录因子BmRelish的切割受到抑制。在细胞中转染dsRNA后,BmCasp8L的表达水平被有效降低,抗菌肽BmCecropinA1的表达水平显著上调。【结论】进化分析、表达特征以及细胞和个体上的功能研究表明BmCasp8L是一个具有免疫负调控作用的分子,通过抑制BmRelish的切割,抑制抗菌肽的表达,从而负调控Imd信号通路,降低BmCasp8L的表达水平则导致抗菌肽表达水平升高,有助于家蚕抵御微生物病原的侵染。 展开更多
关键词 家蚕 免疫负调控 BmCaspase-8-Like(BmCasp8L) 表达特征 抗菌肽 bmrelish
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