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BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定 被引量:9
1
作者 李青 吴雄文 +4 位作者 熊敏 翁秀芳 卢小玲 梁智辉 龚非力 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期557-560,共4页
目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证... 目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。 展开更多
关键词 bira 生物素化 HLA-A2-肽复合物
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生物素连接酶BirA及其突变体在病原与宿主互作研究中的应用进展
2
作者 张含煜 李鹏飞 +5 位作者 廖浙屿 张梦佳 孙玉梅 张敏 何启盖 李文涛 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期1981-1996,共16页
蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋... 蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋白质相互作用的方法,邻近标记技术具有灵敏度高、特异性强和背景低等优势,被广泛应用于病原与宿主间蛋白质的相互作用研究中。本文对近些年生物素连接酶BirA及其突变体的发展和应用进行了综述,阐述了几种经典生物素连接酶的作用原理,以期进一步明确基于BirA及其突变体的邻近标记技术在病原-宿主间蛋白质相互作用鉴定中的重要作用。 展开更多
关键词 蛋白质 相互作用 邻近标记 bira 生物素
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重组BirA酶的原核表达及其活性鉴定
3
作者 赵爽佳 鲍如梦 +2 位作者 唐海科 杨洪鸣 唐金宝 《药物生物技术》 CAS 2015年第6期489-491,共3页
构建含有r TEV酶切位点的原核表达载体p UC18-His-Bir A,利用E.coli DH5α表达重组Bir A酶,并通过酶切获得不含His标签肽的Bir A酶。PCR方式扩增Bir A基因片段重组至质粒p UC18,构建原核表达载体p UC18-His-Bir A并转化E.coli DH5α;采... 构建含有r TEV酶切位点的原核表达载体p UC18-His-Bir A,利用E.coli DH5α表达重组Bir A酶,并通过酶切获得不含His标签肽的Bir A酶。PCR方式扩增Bir A基因片段重组至质粒p UC18,构建原核表达载体p UC18-His-Bir A并转化E.coli DH5α;采用冻融法释放菌体蛋白,SDS-PAGE分析目的蛋白的存在形式;冻融上清经金属离子亲和色谱纯化获得目的蛋白His-Bir A酶,利用r TEV酶切除His标签肽,并采用HABA方法进行Bir A酶活鉴定分析。经双酶切验证、基因测序结果表明重组载体构建正确,SDS-PAGE结果显示表达产物可溶部分比例约占50%;利用r TEV酶将标签切除,经HABA测定该酶相对酶活性可达4 365 U/μg。该研究通过构建p UC18-His-Bir A质粒表达载体,实现了重组Bir A酶较高比例的可溶性表达。表达产物经r TEV酶酶切后具有较高的酶活性,为实现Bir A酶的经济、高效制备奠定了一定的实验基础。 展开更多
关键词 重组bira 表达 酶活性
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PIRELLI 泰国BIRA赛道测试 RAGON
4
作者 李德沛 贺国容 《科技资讯》 2004年第16期148-151,共4页
紧追 P ZERO 的升级新选择如果您的年纪够长,应该会记得市场在10年前,一般市售车的原厂轮胎规格几乎都只有13英寸,以 HONDA CIVIC(本田思域)为例,基本升级规格是185/60/14,就目前的水准看来真的是小得可怜,但在当时已经是非常不得了。... 紧追 P ZERO 的升级新选择如果您的年纪够长,应该会记得市场在10年前,一般市售车的原厂轮胎规格几乎都只有13英寸,以 HONDA CIVIC(本田思域)为例,基本升级规格是185/60/14,就目前的水准看来真的是小得可怜,但在当时已经是非常不得了。时至今日,195/50/15已经成为 CIVIC 的基本规格,205/45/16才算是升级规格,这个演进的事实证实了过去 INCH UP"+1"的升级观念已经进化到"+2",而且已经不再局限在特定车款,举凡轿车、跑车、SUV,甚至是日系 K Car 的车主都大有人改。可是,升级轮毂不难。 展开更多
关键词 思域 轮胎规格 bira PIRELLI RAGON 急加速 专业汽车 阿尔法罗密欧 抓地力 悬挂系统
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A Real-Time and Dynamic Biological Information Retrieval and Analysis System(BIRAS)
5
作者 QiZhou HongZhang +1 位作者 MeiyingGeng ChenggangZhang 《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》 SCIE CAS CSCD 2003年第1期74-77,共4页
The aim of this study is to design a biological information retrieval and analysis system (BIRAS) based on the Internet. Using the specific network protocol, BIRAS system could send and receive information from the En... The aim of this study is to design a biological information retrieval and analysis system (BIRAS) based on the Internet. Using the specific network protocol, BIRAS system could send and receive information from the Entrez search and retrieval system maintained by National Center for Biotechnology Information (NCBI) in USA. The literatures, nucleotide sequence, protein sequences, and other resources according to the user-defined term could then be retrieved and sent to the user by pop up message or by E-mail informing automatically using BIRAS system. All the information retrieving and analyzing processes are done in real-time. As a robust system for intelligently and dynamically retrieving and analyzing on the user-defined information, it is believed that BIRAS would be extensively used to retrieve specific information from large amount of biological databases in now days. The program is available on request from the corresponding author. 展开更多
关键词 real-time information retrieval sequence analysis ENTREZ biraS
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可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化 被引量:10
6
作者 翁秀芳 陈浩 +4 位作者 吴雄文 梁智辉 韩军艳 黄亚非 龚非力 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期265-268,共4页
目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作... 目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作用下进行生物素化 ,使生物素结合到HLA A2 抗原肽复合物中的H链C端。利用特异性抗体 (mAbW6 / 32和兔抗人 β2m抗体 )及链霉亲合素进行ELISA和Westernblot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 :折叠复合物中 ,主要含有HLAH链聚合体、HLA A2 肽复合物单体及 β2m3种成分 ,其中H链聚合体与HLA A2单体可生物素化。结论 :成功地获得生物素化的HLA A2 抗原肽复合物单体 ,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础 ,也为过程复杂的HLA 展开更多
关键词 HLA—A2-抗原肽复合物 生物素化 bira
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烟台黑猪SLA-I重链基因末端生物素修饰及表达 被引量:7
7
作者 刘筏 杨金刚 +2 位作者 翟晓鑫 董宋鹏 高凤山 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期191-195,共5页
为构建烟台黑猪SLA-2重链基因偶合生物素化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide,BSP)并研究其在pET-28a(+)中的表达,设计烟台黑猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增烟台黑猪SLA-2-YTH-BSP复合基因,并克隆至pMD 19-T Simple Vectorp,经酶... 为构建烟台黑猪SLA-2重链基因偶合生物素化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide,BSP)并研究其在pET-28a(+)中的表达,设计烟台黑猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增烟台黑猪SLA-2-YTH-BSP复合基因,并克隆至pMD 19-T Simple Vectorp,经酶切鉴定后将SLA-2-YTH-BSP复合基因与表达系统pET-28a(+)链接,并转化到BL21(Rosseta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。表达蛋白经过Ni-NTA亲和纯化,并经SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。PCR结果显示SLA-2-BSP大小为900 bp,并成功克隆到pMD 19-T Simple Vector,酶切鉴定大小为876 bp,该基因链接到pET-28a(+)并转化到BL21(Rosseta)菌,经诱导表达和SDS-PAGE检测目的蛋白的大小为32.4 kD。目的蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达到90%以上。成功构建烟台黑猪SLA-I重链偶合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的pET-28a(+)的重组表达系,为下一步的SLA-I类分子四聚体研究鉴定基础。 展开更多
关键词 烟台黑猪 SLA-2 重链基因 生物素化酶bira底物肽 纯化
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生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备 被引量:3
8
作者 卢小玲 吴雄文 +3 位作者 翁秀芳 李青 梁智辉 龚非力 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期78-81,共4页
目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在Bir... 目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人2β微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化。结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。 展开更多
关键词 HLA—A*2402-抗原肽复合物 生物素化 bira
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一种新型的生物素诱导的真核基因表达调控系统的建立 被引量:1
9
作者 叶玲玲 刘红 +3 位作者 李世崇 王启伟 蓝三春 陈昭烈 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1256-1265,共10页
为建立一种适用于生物制药工业和基因治疗领域的基因表达调控系统,构建枯草芽胞杆菌生物素连接酶(BS-BirA)与转录激活结构域的融合蛋白,以其表达载体为调控载体;在弱化的CMV启动子上游连接BS-BirA特异的操纵子序列,获得响应载体,从而得... 为建立一种适用于生物制药工业和基因治疗领域的基因表达调控系统,构建枯草芽胞杆菌生物素连接酶(BS-BirA)与转录激活结构域的融合蛋白,以其表达载体为调控载体;在弱化的CMV启动子上游连接BS-BirA特异的操纵子序列,获得响应载体,从而得到响应于生物素的真核基因表达调控系统BS-Biotin-On。以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因对该系统进行考察,结果表明,与现有的类似调控系统相比,该系统具有良好的诱导率;可通过调节培养体系中生物素的浓度,实现对目的基因表达水平快速、较高效的调节。上述结果表明,BS-Biotin-On系统可能为外源基因的调控表达提供新的选择。 展开更多
关键词 生物素 基因表达调控系统 诱导率 bira
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sHLA-A*0201-抗原肽四聚体的构建与功能检测 被引量:1
10
作者 翁秀芳 吴雄文 +4 位作者 梁智辉 蔡蕾 费世江 陈国安 龚非力 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期244-247,251,共5页
目的:构建有功能的sHLA-A*0201-抗原肽四聚体,建立一套HLAⅠ类分子/抗原肽的四聚体制备技术。方法:利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A*0201-LMP2A426-434复合物分子,并在BirA酶的作用下生物素化,与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4... 目的:构建有功能的sHLA-A*0201-抗原肽四聚体,建立一套HLAⅠ类分子/抗原肽的四聚体制备技术。方法:利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A*0201-LMP2A426-434复合物分子,并在BirA酶的作用下生物素化,与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4∶1结合而形成HLA-A*0201-LMP2A426-434四聚体。获得的四聚体对长期混合淋巴细胞培养中增殖的抗原特异性CTL进行检测,同时用细胞毒实验验证。结果:荧光标记的亲和素与生物素化的HLA-A*0201-抗原肽复合物分子正确结合,制备的四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的特异性T细胞结合。结论:从结构与功能上证实成功地获得有功能的HLA-A*0201-抗原肽复合物四聚体。为进一步研究T细胞识别机制与功能奠定了基础,也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体制备提供了可行的免疫学监控方法。 展开更多
关键词 HLA-A*0201-抗原肽复合物 生物素化 bira HLA-A*0201-抗原肽四聚体 抗原特异性CTL
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基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法 被引量:1
11
作者 李丹丹 李英 +3 位作者 吴小桃 鲁云霞 王学军 王升启 《生物技术通讯》 CAS 2011年第5期647-650,666,共5页
目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGF... 目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。 展开更多
关键词 Avi-tag 增强型绿色荧光蛋白 bira 人胚肾细胞 亲和纯化
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可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化
12
作者 卢小玲 吴雄文 +3 位作者 翁秀芳 李青 梁智辉 龚非力 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期155-158,162,共5页
目的研究可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法将原核高效表达的可溶性HLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白(β2m)与HLA-A*2402限制性抗原肽Epstein-Barr病毒(EBV)即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进... 目的研究可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法将原核高效表达的可溶性HLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白(β2m)与HLA-A*2402限制性抗原肽Epstein-Barr病毒(EBV)即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠,形成HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体,并在BirA酶的作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-pBRLF1复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体。利用特异单抗(W6/32和兔抗人β2m抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA-A*2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞(aAPCs)诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化。应用HLA-A*2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA-A*2402-pBRLF1四聚体。结论HLA-A*2402-pBRLF1四聚体构建成功,为特异性CTL的检测提供了有力的工具。 展开更多
关键词 HLA—A*2402-pBRLF1复合物 生物素化 bira 四聚体
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HLA-A*0201/BSP融合基因的构建与表达
13
作者 娄加陶 范列英 +4 位作者 张玉芳 侯彦强 周演武 耿红莲 仲人前 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第12期1332-1334,共3页
目的:克隆表达HLA-A*0201 α链胞外区与BirA酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)的融合蛋白。方法:采用PCR技术从人HLA-A*0201 α链cDNA库中克隆基因的胞外区,拼接可生物素化的BSP片段序列后,经双酶切插入载体pET28a(+)后在E.coli BL2... 目的:克隆表达HLA-A*0201 α链胞外区与BirA酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)的融合蛋白。方法:采用PCR技术从人HLA-A*0201 α链cDNA库中克隆基因的胞外区,拼接可生物素化的BSP片段序列后,经双酶切插入载体pET28a(+)后在E.coli BL21(DE3)诱导高效表达,并对表达产物进行纯化与复性。结果:成功地扩增出HLA-A*0201/BSP基因并测序证实,构建了融合表达载体pET-HLA-A*0201,并获表达与纯化。结论:成功构建了HLA-A*0201/BSP融合基因,为进一步体外构建特定的HLA-A*0201四聚体,标记相应特异性CD8+T细胞提供物质基础。 展开更多
关键词 HLA-A*0201α链胞外区 bira酶底物肽 融合基因 基因表达
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活细胞内亚细胞结构蛋白质组学研究新技术——几种邻近标记策略的应用及比较 被引量:5
14
作者 杜阳春 唐菁兰 +1 位作者 王友军 张晓嫣 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2019年第7期641-653,共13页
真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的... 真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的生物学功能及作用机制,并为研究细胞器相互作用提供基础.但由于无膜细胞器或膜接触位点很难分离纯化,传统的生化方法难以系统解析其中的蛋白质组.最近报道的几种基于酶类的蛋白质邻近标记技术,则为系统分析上述空间受限的蛋白质组这一难题提供了有效的解决方案.通过将能催化产生活性自由基(最常见的是生物素及其衍生物的自由基)的酶连接到目标蛋白上,可对其邻近的蛋白质组进行共价标记,从而使后者的分离和鉴定成为可能,并可以运用于活细胞中的动态标记.我们在此综述了几种最新的邻近标记策略的原理及应用,并对它们的优势与局限性进行了比较,以期为细胞器互作的蛋白质组学研究提供参考. 展开更多
关键词 细胞器蛋白质组 膜接触位点 亚细胞区室 蛋白质相互作用 邻近标记 bira APEX BioID TurboID
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可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化 被引量:3
15
作者 钱亚云 刘静 +3 位作者 张伟 潘兴元 龚卫娟 季明春 《实用临床医药杂志》 CAS 2008年第4期1-4,共4页
目的构建可生物素化的H-2Kd-BSP融合基因的表达载体,原核表达H-2Kd-BSP融合蛋白,以制备H-2Kd-肽四聚体。方法采用RT-PCR技术从小鼠SP2/0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2Kd基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP)后,插入pET-... 目的构建可生物素化的H-2Kd-BSP融合基因的表达载体,原核表达H-2Kd-BSP融合蛋白,以制备H-2Kd-肽四聚体。方法采用RT-PCR技术从小鼠SP2/0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2Kd基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP)后,插入pET-22b高效表达载体多克隆位点,诱导表达后对表达产物进行纯化,用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白。结果成功构建pET-H-2Kd原核表达载体,测序证实H-2Kd-BSP融合基因序列正确。pET-H-2Kd原核表达载体可在大肠杆菌BL21中高效诱导表达H-2Kd-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的36%,主要以包涵体形式表达;经反复洗涤纯化,纯化蛋白纯度可达90%以上。纯化蛋白可被H-2Kd分子特异性单克隆抗体SF1-1.1所识别。结论可生物素化H-2Kd-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2Kd-肽四聚体奠定了实验基础。 展开更多
关键词 H-2K^d H-2K^d—BSP融合蛋白 可生物素化序列
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生物素化FOXM1真核表达体系的构建及鉴定
16
作者 邹红春 谭桂湘 谭拥军 《生命科学研究》 CAS CSCD 2016年第1期16-20,共5页
建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir ... 建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。 展开更多
关键词 生物素化FOXM1 bira生物素连接酶 HEK 293T细胞 亲和纯化 蛋白印迹
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高频等位基因HLA-A* 1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定 被引量:1
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作者 李丰耀 徐丽慧 +3 位作者 迟晓云 查庆兵 贾仟涛 何贤辉 《暨南大学学报(自然科学与医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期509-514,共6页
目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,... 目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。 展开更多
关键词 免疫学 高频等位基因HLA-A*1101 生物素化酶底物肽 融合蛋白 原核表达 包涵体
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HLA-A*0201-BSP融合基因的构建与原核表达 被引量:1
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作者 孙万军 杜建芳 +6 位作者 徐东刚 邹民吉 王金凤 蔡欣 王颖 王嘉玺 艾辉胜 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2006年第5期976-980,共5页
克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区是制备HLA-A*0201-肽四聚体的先决条件。本研究构建重组HLA-A*0201-BSP融合基因的表达载体,以制备HLA-A2四聚体。根据已报道的序列设计特异引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从已鉴定... 克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区是制备HLA-A*0201-肽四聚体的先决条件。本研究构建重组HLA-A*0201-BSP融合基因的表达载体,以制备HLA-A2四聚体。根据已报道的序列设计特异引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从已鉴定为HLA-A*0201基因型的健康人白细胞中克隆HLA-A*0201重链胞外区的基因,拼接上依赖生物素-蛋白连接酶(biotin-proteinligase,BirA)的可生物素化序列(BirAsubstratepep-tide,BSP),构建HLA-A*0201-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果表明:成功扩增出HLA-A*0201-BSP融合基因并测序证实,构建的pBV220-HLA-A*0201-BSP可在大肠杆菌DH5α中高效表达HLA-A*0201-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的28%,以包涵体的形式表达,经洗涤、变性后,以SepharcylS-300HR(S-300)柱层析纯化,纯度可达90%以上。结论:获得了高效表达HLA-A*0201-BSP的大肠杆菌工程菌株,建立了简便有效的包涵体纯化方法,为制备HLA-A*0201-肽四聚体奠定了基础。 展开更多
关键词 HLA—A*0201 HLA—A*0201-BSP融合基因 HLA—A2四聚体 可生物素化序列
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荷包猪SLA-1重链四聚体前体链的构建及表达研究 被引量:1
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作者 高花 郭杨 +2 位作者 翟晓鑫 张宗辉 高凤山 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第12期3453-3458,共6页
试验旨在构建荷包猪猪白细胞抗原1(swine lymphocyte antigen 1,SLA-1)重链四聚体前体链并研究其在表达载体pET-21a(+)中蛋白的表达情况。以SLA-1全基因序列为模板,结合表达载体的特点设计引物,利用PCR扩增技术在SLA-1-HB01胞外区序列C... 试验旨在构建荷包猪猪白细胞抗原1(swine lymphocyte antigen 1,SLA-1)重链四聚体前体链并研究其在表达载体pET-21a(+)中蛋白的表达情况。以SLA-1全基因序列为模板,结合表达载体的特点设计引物,利用PCR扩增技术在SLA-1-HB01胞外区序列C-末端加载上可生物素酰化序列(BirA substrate peptide,BSP)。将PCR扩增产物SLA-1-HB01-BSP克隆到pEASY T1载体上,筛选出阳性克隆菌SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,经双酶切后进一步与表达载体pET-21a(+)连接,再转化到E.coli BL21感受态细胞中构建pET-21a(+)/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,通过IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测蛋白的大小及表达情况,提取包涵体检测蛋白的纯度。PCR扩增结果显示,SLA-1-HB01-BSP大小为898bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆至pEASY T1载体构建克隆菌,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,插入的目的基因片段大小为876bp。阳性克隆菌株与pET-21a(+)表达载体经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后进行连接,转化E coli BL21感受态细胞后获得pET-21a(+)/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小为31.4ku。进一步检测分析发现,目的蛋白以包涵体形式存在,且蛋白纯度达到80%以上。本研究成功构建了荷包猪SLA-1-HB01重链四聚体前体链的pET-21a(+)重组表达体系,为下一步进行猪SLAⅠ类分子四聚体的检测奠定基础。 展开更多
关键词 荷包猪 猪白细胞抗原1 四聚体 可生物素酰化序列
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灰色关联分析在黄磷生产中的应用 被引量:1
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作者 申明金 张运陶 《四川师范学院学报(自然科学版)》 2002年第2期170-173,共4页
运用灰色关联分析 ,对什邡磷化工厂黄磷生产中炉渣磷含量的影响因素作了分析 ,指出铁是影响炉渣磷含量的第一位因素 。
关键词 黄磷生产 灰色关联分析 磷矿石 关联度 炉渣 磷含量 影响因素 氧化钙
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