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基于XcmⅠ的T载体及其在合成生物学中的应用
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作者 段仰凯 梁飞燕 +1 位作者 谈晓明 吕雪峰 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期956-965,共10页
为了节约成本和提高实验效率,以商用p MD18-T载体为基础,构建获得了p FL-XS-T载体,其具有符合Biobrick标准的串联XbaⅠ-XcmⅠ-XcmⅠ-SpeⅠ克隆序列,通过对XcmⅠ的酶切处理即可以通过TA克隆方便地克隆PCR片段。克隆验证实验结果表明,经Xc... 为了节约成本和提高实验效率,以商用p MD18-T载体为基础,构建获得了p FL-XS-T载体,其具有符合Biobrick标准的串联XbaⅠ-XcmⅠ-XcmⅠ-SpeⅠ克隆序列,通过对XcmⅠ的酶切处理即可以通过TA克隆方便地克隆PCR片段。克隆验证实验结果表明,经XcmⅠ处理的该载体可以与PCR片段进行TA连接,连接效率及阳性率均可以满足实验室要求并且可以得到Biobrick标准质粒。此外,该载体不仅可以与其余Biobrick标准元件进行串联,还可以作为功能DNA元件的筛选载体。 展开更多
关键词 Biobrick标准 TA克隆 合成生物学
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运用BioBrick组装策略共表达CYP108N7及其氧化还原伴侣
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作者 丁照云 郭超 +1 位作者 刘艳 吴中柳 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期466-471,共6页
细胞色素P450单加氧酶(简称P450,CYP)是功能强大的单加氧酶超家族,可以催化多种化学法难以实现的氧化反应.实验室前期挖掘的P450新酶CYP108N7,能够利用菠菜铁氧化还原蛋白(Fdx)和铁氧化还原蛋白还原酶(FdR)作为非天然氧化还原伴侣进行... 细胞色素P450单加氧酶(简称P450,CYP)是功能强大的单加氧酶超家族,可以催化多种化学法难以实现的氧化反应.实验室前期挖掘的P450新酶CYP108N7,能够利用菠菜铁氧化还原蛋白(Fdx)和铁氧化还原蛋白还原酶(FdR)作为非天然氧化还原伴侣进行电子传递,并在双质粒系统中实现共表达.本研究拟简化表达体系,重新构建单个质粒的全细胞表达系统.利用BioBrick组装策略,将CYP108N7、Fdx和FdR基因模块化并排列重组,成功构建了编码上述3条基因的、6种排列结构的表达质粒,将其在大肠杆菌中异源表达后获得全细胞催化剂.这6种全细胞的粗酶液的CO差谱都显示出P450酶的典型吸收特征;全细胞在催化苯甲硫醚不对称氧化反应时,都能以优异的立体选择性得到S-苯甲亚砜(>99%ee).其中,催化效率最高全细胞来自以Fdx-FdR-CYP108N7方式排列的质粒N7S6.本研究应用BioBrick组装策略极大地简化了多组分CYP108N7酶的共表达质粒的构建和优化工作,可为后续该酶的分子进化奠定基础.(图6表1参31) 展开更多
关键词 BioBrick 细胞色素P450 硫醚氧化 不对称催化 共表达
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类食品乳杆菌LBM 12001基于CRISPR/Cas9技术多基因编辑平台的构建
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作者 黄宗潇 侯倩 +2 位作者 徐岩 黄卫宁 穆晓清 《食品与发酵工业》 2026年第3期11-19,共9页
作为传统发酵食品的核心功能菌株,类食品乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)的代谢调控网络解析常受限于低效的遗传操作体系。该研究旨在开发一种高效、无痕的CRISPR/Cas9基因编辑平台,以解决类食品乳杆菌多基因编辑的技术瓶颈。通... 作为传统发酵食品的核心功能菌株,类食品乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)的代谢调控网络解析常受限于低效的遗传操作体系。该研究旨在开发一种高效、无痕的CRISPR/Cas9基因编辑平台,以解决类食品乳杆菌多基因编辑的技术瓶颈。通过优化质粒大小以及引入λ-Red重组酶辅助同源重组,构建了双质粒系统(pCRI01/pCRI02)。实验结果表明,该系统显著提升了转化效率[单基因敲除转化子达(63±11)个,阳性突变率75%],并实现了三基因同步敲除[转化子(57±8)个,突变率(46±7)%]。创新性整合BioBricks模块化组装、温度敏感型复制子及自靶向诱导型sgRNA技术,使多基因编辑周期缩短40%以上。该体系突破了传统方法的效率限制,成功实现多基因无痕编辑,为构建类食品乳杆菌高效细胞工厂提供了关键性技术支撑。 展开更多
关键词 类食品乳杆菌 CRISPR/Cas9 多基因编辑 λ-Red重组酶 biobricks组装
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