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A Real-Time and Dynamic Biological Information Retrieval and Analysis System(BIRAS)
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作者 QiZhou HongZhang +1 位作者 MeiyingGeng ChenggangZhang 《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》 SCIE CAS CSCD 2003年第1期74-77,共4页
The aim of this study is to design a biological information retrieval and analysis system (BIRAS) based on the Internet. Using the specific network protocol, BIRAS system could send and receive information from the En... The aim of this study is to design a biological information retrieval and analysis system (BIRAS) based on the Internet. Using the specific network protocol, BIRAS system could send and receive information from the Entrez search and retrieval system maintained by National Center for Biotechnology Information (NCBI) in USA. The literatures, nucleotide sequence, protein sequences, and other resources according to the user-defined term could then be retrieved and sent to the user by pop up message or by E-mail informing automatically using BIRAS system. All the information retrieving and analyzing processes are done in real-time. As a robust system for intelligently and dynamically retrieving and analyzing on the user-defined information, it is believed that BIRAS would be extensively used to retrieve specific information from large amount of biological databases in now days. The program is available on request from the corresponding author. 展开更多
关键词 real-time information retrieval sequence analysis ENTREZ biras
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BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定 被引量:9
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作者 李青 吴雄文 +4 位作者 熊敏 翁秀芳 卢小玲 梁智辉 龚非力 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期557-560,共4页
目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证... 目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。 展开更多
关键词 BirA酶 生物素化 HLA-A2-肽复合物
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可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化 被引量:10
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作者 翁秀芳 陈浩 +4 位作者 吴雄文 梁智辉 韩军艳 黄亚非 龚非力 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期265-268,共4页
目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作... 目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作用下进行生物素化 ,使生物素结合到HLA A2 抗原肽复合物中的H链C端。利用特异性抗体 (mAbW6 / 32和兔抗人 β2m抗体 )及链霉亲合素进行ELISA和Westernblot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 :折叠复合物中 ,主要含有HLAH链聚合体、HLA A2 肽复合物单体及 β2m3种成分 ,其中H链聚合体与HLA A2单体可生物素化。结论 :成功地获得生物素化的HLA A2 抗原肽复合物单体 ,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础 ,也为过程复杂的HLA 展开更多
关键词 HLA—A2-抗原肽复合物 生物素化 BirA酶
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烟台黑猪SLA-I重链基因末端生物素修饰及表达 被引量:7
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作者 刘筏 杨金刚 +2 位作者 翟晓鑫 董宋鹏 高凤山 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期191-195,共5页
为构建烟台黑猪SLA-2重链基因偶合生物素化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide,BSP)并研究其在pET-28a(+)中的表达,设计烟台黑猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增烟台黑猪SLA-2-YTH-BSP复合基因,并克隆至pMD 19-T Simple Vectorp,经酶... 为构建烟台黑猪SLA-2重链基因偶合生物素化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide,BSP)并研究其在pET-28a(+)中的表达,设计烟台黑猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增烟台黑猪SLA-2-YTH-BSP复合基因,并克隆至pMD 19-T Simple Vectorp,经酶切鉴定后将SLA-2-YTH-BSP复合基因与表达系统pET-28a(+)链接,并转化到BL21(Rosseta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。表达蛋白经过Ni-NTA亲和纯化,并经SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。PCR结果显示SLA-2-BSP大小为900 bp,并成功克隆到pMD 19-T Simple Vector,酶切鉴定大小为876 bp,该基因链接到pET-28a(+)并转化到BL21(Rosseta)菌,经诱导表达和SDS-PAGE检测目的蛋白的大小为32.4 kD。目的蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达到90%以上。成功构建烟台黑猪SLA-I重链偶合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的pET-28a(+)的重组表达系,为下一步的SLA-I类分子四聚体研究鉴定基础。 展开更多
关键词 烟台黑猪 SLA-2 重链基因 生物素化酶BirA底物肽 纯化
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生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备 被引量:3
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作者 卢小玲 吴雄文 +3 位作者 翁秀芳 李青 梁智辉 龚非力 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期78-81,共4页
目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在Bir... 目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人2β微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化。结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。 展开更多
关键词 HLA—A*2402-抗原肽复合物 生物素化 BirA酶
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一种新型的生物素诱导的真核基因表达调控系统的建立 被引量:1
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作者 叶玲玲 刘红 +3 位作者 李世崇 王启伟 蓝三春 陈昭烈 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1256-1265,共10页
为建立一种适用于生物制药工业和基因治疗领域的基因表达调控系统,构建枯草芽胞杆菌生物素连接酶(BS-BirA)与转录激活结构域的融合蛋白,以其表达载体为调控载体;在弱化的CMV启动子上游连接BS-BirA特异的操纵子序列,获得响应载体,从而得... 为建立一种适用于生物制药工业和基因治疗领域的基因表达调控系统,构建枯草芽胞杆菌生物素连接酶(BS-BirA)与转录激活结构域的融合蛋白,以其表达载体为调控载体;在弱化的CMV启动子上游连接BS-BirA特异的操纵子序列,获得响应载体,从而得到响应于生物素的真核基因表达调控系统BS-Biotin-On。以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因对该系统进行考察,结果表明,与现有的类似调控系统相比,该系统具有良好的诱导率;可通过调节培养体系中生物素的浓度,实现对目的基因表达水平快速、较高效的调节。上述结果表明,BS-Biotin-On系统可能为外源基因的调控表达提供新的选择。 展开更多
关键词 生物素 基因表达调控系统 诱导率 BirA
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sHLA-A*0201-抗原肽四聚体的构建与功能检测 被引量:1
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作者 翁秀芳 吴雄文 +4 位作者 梁智辉 蔡蕾 费世江 陈国安 龚非力 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期244-247,251,共5页
目的:构建有功能的sHLA-A*0201-抗原肽四聚体,建立一套HLAⅠ类分子/抗原肽的四聚体制备技术。方法:利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A*0201-LMP2A426-434复合物分子,并在BirA酶的作用下生物素化,与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4... 目的:构建有功能的sHLA-A*0201-抗原肽四聚体,建立一套HLAⅠ类分子/抗原肽的四聚体制备技术。方法:利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A*0201-LMP2A426-434复合物分子,并在BirA酶的作用下生物素化,与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4∶1结合而形成HLA-A*0201-LMP2A426-434四聚体。获得的四聚体对长期混合淋巴细胞培养中增殖的抗原特异性CTL进行检测,同时用细胞毒实验验证。结果:荧光标记的亲和素与生物素化的HLA-A*0201-抗原肽复合物分子正确结合,制备的四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的特异性T细胞结合。结论:从结构与功能上证实成功地获得有功能的HLA-A*0201-抗原肽复合物四聚体。为进一步研究T细胞识别机制与功能奠定了基础,也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体制备提供了可行的免疫学监控方法。 展开更多
关键词 HLA-A*0201-抗原肽复合物 生物素化 BirA HLA-A*0201-抗原肽四聚体 抗原特异性CTL
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基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法 被引量:1
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作者 李丹丹 李英 +3 位作者 吴小桃 鲁云霞 王学军 王升启 《生物技术通讯》 CAS 2011年第5期647-650,666,共5页
目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGF... 目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。 展开更多
关键词 Avi-tag 增强型绿色荧光蛋白 BirA酶 人胚肾细胞 亲和纯化
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HLA-A*0201/BSP融合基因的构建与表达
9
作者 娄加陶 范列英 +4 位作者 张玉芳 侯彦强 周演武 耿红莲 仲人前 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第12期1332-1334,共3页
目的:克隆表达HLA-A*0201 α链胞外区与BirA酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)的融合蛋白。方法:采用PCR技术从人HLA-A*0201 α链cDNA库中克隆基因的胞外区,拼接可生物素化的BSP片段序列后,经双酶切插入载体pET28a(+)后在E.coli BL2... 目的:克隆表达HLA-A*0201 α链胞外区与BirA酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)的融合蛋白。方法:采用PCR技术从人HLA-A*0201 α链cDNA库中克隆基因的胞外区,拼接可生物素化的BSP片段序列后,经双酶切插入载体pET28a(+)后在E.coli BL21(DE3)诱导高效表达,并对表达产物进行纯化与复性。结果:成功地扩增出HLA-A*0201/BSP基因并测序证实,构建了融合表达载体pET-HLA-A*0201,并获表达与纯化。结论:成功构建了HLA-A*0201/BSP融合基因,为进一步体外构建特定的HLA-A*0201四聚体,标记相应特异性CD8+T细胞提供物质基础。 展开更多
关键词 HLA-A*0201α链胞外区 BirA酶底物肽 融合基因 基因表达
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可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化
10
作者 卢小玲 吴雄文 +3 位作者 翁秀芳 李青 梁智辉 龚非力 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期155-158,162,共5页
目的研究可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法将原核高效表达的可溶性HLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白(β2m)与HLA-A*2402限制性抗原肽Epstein-Barr病毒(EBV)即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进... 目的研究可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法将原核高效表达的可溶性HLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白(β2m)与HLA-A*2402限制性抗原肽Epstein-Barr病毒(EBV)即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠,形成HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体,并在BirA酶的作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-pBRLF1复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体。利用特异单抗(W6/32和兔抗人β2m抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA-A*2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞(aAPCs)诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化。应用HLA-A*2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA-A*2402-pBRLF1四聚体。结论HLA-A*2402-pBRLF1四聚体构建成功,为特异性CTL的检测提供了有力的工具。 展开更多
关键词 HLA—A*2402-pBRLF1复合物 生物素化 BirA酶 四聚体
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活细胞内亚细胞结构蛋白质组学研究新技术——几种邻近标记策略的应用及比较 被引量:4
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作者 杜阳春 唐菁兰 +1 位作者 王友军 张晓嫣 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2019年第7期641-653,共13页
真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的... 真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的生物学功能及作用机制,并为研究细胞器相互作用提供基础.但由于无膜细胞器或膜接触位点很难分离纯化,传统的生化方法难以系统解析其中的蛋白质组.最近报道的几种基于酶类的蛋白质邻近标记技术,则为系统分析上述空间受限的蛋白质组这一难题提供了有效的解决方案.通过将能催化产生活性自由基(最常见的是生物素及其衍生物的自由基)的酶连接到目标蛋白上,可对其邻近的蛋白质组进行共价标记,从而使后者的分离和鉴定成为可能,并可以运用于活细胞中的动态标记.我们在此综述了几种最新的邻近标记策略的原理及应用,并对它们的优势与局限性进行了比较,以期为细胞器互作的蛋白质组学研究提供参考. 展开更多
关键词 细胞器蛋白质组 膜接触位点 亚细胞区室 蛋白质相互作用 邻近标记 BirA APEX BioID TurboID
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生物素化FOXM1真核表达体系的构建及鉴定
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作者 邹红春 谭桂湘 谭拥军 《生命科学研究》 CAS CSCD 2016年第1期16-20,共5页
建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir ... 建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。 展开更多
关键词 生物素化FOXM1 BirA生物素连接酶 HEK 293T细胞 亲和纯化 蛋白印迹
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生物素连接酶BirA及其突变体在病原与宿主互作研究中的应用进展
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作者 张含煜 李鹏飞 +5 位作者 廖浙屿 张梦佳 孙玉梅 张敏 何启盖 李文涛 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期1981-1996,共16页
蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋... 蛋白质是机体进行生命活动的主要承担者,研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质之间的相互作用对了解蛋白质功能、阐述机体内分子机制至关重要。邻近标记技术是最新发展的能够在活细胞中检测蛋白质相互作用的有效方法之一。相较于传统研究蛋白质相互作用的方法,邻近标记技术具有灵敏度高、特异性强和背景低等优势,被广泛应用于病原与宿主间蛋白质的相互作用研究中。本文对近些年生物素连接酶BirA及其突变体的发展和应用进行了综述,阐述了几种经典生物素连接酶的作用原理,以期进一步明确基于BirA及其突变体的邻近标记技术在病原-宿主间蛋白质相互作用鉴定中的重要作用。 展开更多
关键词 蛋白质 相互作用 邻近标记 BirA 生物素
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重组BirA酶的原核表达及其活性鉴定
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作者 赵爽佳 鲍如梦 +2 位作者 唐海科 杨洪鸣 唐金宝 《药物生物技术》 CAS 2015年第6期489-491,共3页
构建含有r TEV酶切位点的原核表达载体p UC18-His-Bir A,利用E.coli DH5α表达重组Bir A酶,并通过酶切获得不含His标签肽的Bir A酶。PCR方式扩增Bir A基因片段重组至质粒p UC18,构建原核表达载体p UC18-His-Bir A并转化E.coli DH5α;采... 构建含有r TEV酶切位点的原核表达载体p UC18-His-Bir A,利用E.coli DH5α表达重组Bir A酶,并通过酶切获得不含His标签肽的Bir A酶。PCR方式扩增Bir A基因片段重组至质粒p UC18,构建原核表达载体p UC18-His-Bir A并转化E.coli DH5α;采用冻融法释放菌体蛋白,SDS-PAGE分析目的蛋白的存在形式;冻融上清经金属离子亲和色谱纯化获得目的蛋白His-Bir A酶,利用r TEV酶切除His标签肽,并采用HABA方法进行Bir A酶活鉴定分析。经双酶切验证、基因测序结果表明重组载体构建正确,SDS-PAGE结果显示表达产物可溶部分比例约占50%;利用r TEV酶将标签切除,经HABA测定该酶相对酶活性可达4 365 U/μg。该研究通过构建p UC18-His-Bir A质粒表达载体,实现了重组Bir A酶较高比例的可溶性表达。表达产物经r TEV酶酶切后具有较高的酶活性,为实现Bir A酶的经济、高效制备奠定了一定的实验基础。 展开更多
关键词 重组BirA酶 表达 酶活性
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邻近标记技术在弓形虫蛋白质组学研究中的应用进展
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作者 潘明 李龙娇 +1 位作者 葛层层 黄思扬 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第5期101-106,共6页
弓形虫编码数量众多的分泌蛋白,储存在微线体、棒状体和致密颗粒等虫体特有的细胞器中,于虫体入侵宿主细胞前后分泌到不同部位,并在虫体的感染、寄生和致病过程中发挥重要作用,对这些分泌蛋白的鉴定和功能研究是弓形虫致病机制研究中的... 弓形虫编码数量众多的分泌蛋白,储存在微线体、棒状体和致密颗粒等虫体特有的细胞器中,于虫体入侵宿主细胞前后分泌到不同部位,并在虫体的感染、寄生和致病过程中发挥重要作用,对这些分泌蛋白的鉴定和功能研究是弓形虫致病机制研究中的热点和难点。传统的蛋白质组学技术在弓形虫亚细胞器的分离和组分鉴定上存在样品纯化困难和蛋白质组学信息覆盖率低等不足,且该技术在检测瞬时的或较弱的蛋白质相互作用时灵敏性较低。近年来,快速发展的邻近标记技术(PL)克服了传统技术的局限性。PL是将具有特定催化活性的工具酶与诱饵蛋白进行融合,进而添加生物素或生物素苯酚对诱饵蛋白邻近的靶蛋白进行生物素酰化标记的一门技术。该技术整合了酶促反应效率高的优点,可将特定空间内的蛋白进行高效标记,并可检测较弱的蛋白质相互作用,近年来在生物学研究中被广泛使用。本文对基于生物素连接酶(BirA)和抗坏血酸过氧化物酶(APEX)催化的PL在弓形虫蛋白质组学研究中的应用进行阐述,介绍2种标记方法在弓形虫分泌蛋白的挖掘和蛋白质相互作用研究中的贡献,为弓形虫致病机制的研究和弓形虫病的防控提供参考。 展开更多
关键词 邻近标记技术(PL) 弓形虫 蛋白质组学 生物素连接酶(BirA) 抗坏血酸过氧化物酶(APEX)
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PIRELLI 泰国BIRA赛道测试 RAGON
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作者 李德沛 贺国容 《科技资讯》 2004年第16期148-151,共4页
紧追 P ZERO 的升级新选择如果您的年纪够长,应该会记得市场在10年前,一般市售车的原厂轮胎规格几乎都只有13英寸,以 HONDA CIVIC(本田思域)为例,基本升级规格是185/60/14,就目前的水准看来真的是小得可怜,但在当时已经是非常不得了。... 紧追 P ZERO 的升级新选择如果您的年纪够长,应该会记得市场在10年前,一般市售车的原厂轮胎规格几乎都只有13英寸,以 HONDA CIVIC(本田思域)为例,基本升级规格是185/60/14,就目前的水准看来真的是小得可怜,但在当时已经是非常不得了。时至今日,195/50/15已经成为 CIVIC 的基本规格,205/45/16才算是升级规格,这个演进的事实证实了过去 INCH UP"+1"的升级观念已经进化到"+2",而且已经不再局限在特定车款,举凡轿车、跑车、SUV,甚至是日系 K Car 的车主都大有人改。可是,升级轮毂不难。 展开更多
关键词 思域 轮胎规格 BIRA PIRELLI RAGON 急加速 专业汽车 阿尔法罗密欧 抓地力 悬挂系统
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自发生物素化风疹病毒重组诊断抗原的制备 被引量:4
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作者 苏秋东 郭敏卓 +7 位作者 邱丰 贾志远 卢学新 孟庆玲 田瑞光 高燕 毕胜利 伊瑶 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2016年第2期236-240,共5页
目的 获取原核表达过程中自发生物素化的风疹病毒(Rubella Virus,RV)重组抗原E1(RV-E1),并初步评价其抗原性.方法 将2×BirA酶底物(BSP)插入到RV-E1抗原优势表位区域aa 148-295的羧基端,硫氧还蛋白(Thioredoxin,TRX)插入到R... 目的 获取原核表达过程中自发生物素化的风疹病毒(Rubella Virus,RV)重组抗原E1(RV-E1),并初步评价其抗原性.方法 将2×BirA酶底物(BSP)插入到RV-E1抗原优势表位区域aa 148-295的羧基端,硫氧还蛋白(Thioredoxin,TRX)插入到RV-E1的氨基端,密码子优化后全基因合成;在大肠埃希进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化获取生物素化的RV-E1抗原;利用Western Blotting技术对目的蛋白进行鉴定,并建立风疹病毒IgM抗体检测方法,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.结果 获取高度均质的生物素化的可溶性RV-E1抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被RV-E1抗原和TRX抗原单克隆抗体识别,而且可以被标记HRP的链霉亲和素所识别.分别对50份风疹病毒感染阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.结论 RV-E1诊断抗原携带BSP,可以在大肠埃希菌表达过程中自发共价结合生物素分子,并可以作为新型诊断抗原应用于生物素-亲和素ELISA血清学检测中. 展开更多
关键词 BirA酶底物 风疹病毒E1抗原 原核表达 生物素化抗原
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生物素修饰蛋白真核表达载体的构建与应用 被引量:9
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作者 伦新新 胡志嵩 +6 位作者 陈园坤 李昂 张孟德 张明铭 赵晶 杨安钢 阎博 《医学分子生物学杂志》 CAS 2019年第1期1-6,共6页
目的构建生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA,并摸索最适生物素的添加剂量,提高目的蛋白表达水平和生物素修饰效率,从而优化生物素修饰蛋白制备方法。方法采用PCR和引物退火的方法,得到BmA基因片段和Avi-tag序列,而后定向克隆至peDNA^... 目的构建生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA,并摸索最适生物素的添加剂量,提高目的蛋白表达水平和生物素修饰效率,从而优化生物素修饰蛋白制备方法。方法采用PCR和引物退火的方法,得到BmA基因片段和Avi-tag序列,而后定向克隆至peDNA^TM3.1载体骨架上,构建得到生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA。应用PCR方法扩增Her2胞外段-Fc基因片段,定向克隆至载体pAvi-BirA上;将该质粒瞬时转染HEK293F细胞,并在培养液中添加不同剂量的生物素.通过Western印迹检测BirA酶和Her2胞外段-Fc融合蛋白的表达水平以及目的蛋白的生物素修饰效率.结果经PCR鉴定、酶切鉴定和基因测序显示pAvi-BirA载体构建成功.Western印迹结果表明pAvi-BirA载体转染HEK293F细胞后,BirA酶在细胞中表达良好。在IIEK293F细胞中瞬时转染含有Her2胞外段-Fc基因片段的载体后,融合蛋白得到高效表达,并且能够有效进行生物素修饰。随着生物素添加剂量的增加,目的蛋白生物素修饰比例逐渐升高;当生物素母液(5mmol/L)添加剂量为2μl/ml时,蛋白生物素修饰水平不再提高.结论构建了生物素修饰蛋白真核表达载体,优化了生物素修饰蛋白制备方法,为相关领域科学研究提供了可靠的技术基础。 展开更多
关键词 BirA酶 Avi-tag 生物素修饰蛋白 真核表达载体
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