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双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作 被引量：5
1
作者 崔喜艳 张继晓 +3 位作者 窦瑶 孙小杰 尹悦佳 刘相国 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第7期49-53,59,共6页
【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达... 【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。 展开更多
关键词 SSⅠ PPDK1 双分子荧光互补技术(bifc) 瞬时转化 蛋白质互作
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双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米MAPK5与bZIP72蛋白的相互作用 被引量：2
2
作者 曹建美 《安徽农业科学》 CAS 2016年第14期152-154,161,共4页
[目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5... [目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5与Zmb ZIP72的Bi FC融合载体同时轰击洋葱表皮细胞,细胞核中能发出黄色荧光。[结论]Zm MAPK5与Zmb ZIP72在植物细胞核内相互作用。 展开更多
关键词 ZmMAPK5 ZmbZIP72 双分子荧光互补(bifc) 蛋白互作 ZmMAPK5 ZmbZIP72 Bimolecular FLUORESCENCE COMPLEMENTATION (bifc)
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ZmJAZ与ZmMYC2的BiFC互作研究 被引量：3
3
作者 吕迪 陈茹梅 周晓今 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期77-85,共9页
JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白是茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径中关键的负调控因子,明确JAZ蛋白和MYC2之间的结合关系对整个JA信号通路至关重要。通过qRT-PCR筛选了在籽粒中较特异表达的ZmJAZ4、生殖器官中高表达的ZmJAZ8以及组成... JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白是茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径中关键的负调控因子,明确JAZ蛋白和MYC2之间的结合关系对整个JA信号通路至关重要。通过qRT-PCR筛选了在籽粒中较特异表达的ZmJAZ4、生殖器官中高表达的ZmJAZ8以及组成型表达的ZmJAZ12,利用玉米叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,通过亚细胞定位和双分子荧光互作(bimolecular fluorescence complementation)研究了这些JAZ蛋白的定位以及是否可以与ZmMYC2相互作用。研究结果发现ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12均定位于细胞核,同时BiFC结果显示这些JAZ蛋白都可与ZmMYC2在细胞核中相互作用,证实了ZmJAZ家族蛋白可与JA信号通路关键转录因子ZmMYC2结合的功能,提示它们可通过与ZmMYC2的结合影响其转录调控活性。 展开更多
关键词 茉莉酸 JAZ蛋白 MYC2转录因子 双分子荧光互作(bifc)
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基于Nimble Cloning的新型植物BiFC载体的构建和应用
4
作者 曾妍静 沈文涛 +4 位作者 庹德财 黎小瑛 言普 高新征 周鹏 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第23期7757-7763,共7页
Nimble Cloning是一项新型的分子克隆技术,具有操作简单、使用灵活、克隆效率高、标准化克隆等优点,但Nimble Cloning需要使用配套的表达载体。本研究将pDOE系列的4个整合型BiFC载体上的SfiI位点去除,然后在这4个载体的多克隆位点处插... Nimble Cloning是一项新型的分子克隆技术,具有操作简单、使用灵活、克隆效率高、标准化克隆等优点,但Nimble Cloning需要使用配套的表达载体。本研究将pDOE系列的4个整合型BiFC载体上的SfiI位点去除,然后在这4个载体的多克隆位点处插入NC克隆框,构建了一套适用于Nimble Cloning的新型植物BiFC表达载体,命名为pNC-BiFC-VD系列载体。将pNC-BiFC-VD载体应用到植物蛋白互作研究中,分析了番木瓜eIFiso4E和病毒PRSV的vpg蛋白之间的互作,结果表明番木瓜eIFiso4E和PRSV-vpg在细胞核发生互作。该套新型植物BiFC表达载体有望在植物蛋白互作研究中得到广泛应用。 展开更多
关键词 分子克隆 Nimble Cloning 双分子荧光互补(bifc) 蛋白互作
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利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系 被引量：4
5
作者 严茗 黄兵 +6 位作者 赵其平 韩红玉 朱顺海 赵宗平 陈婷 吕凌 董辉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第4期32-38,共7页
为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E t... 为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 顶膜抗原1 棒状体颈部蛋白2 双分子荧光互补技术 互作蛋白
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双分子荧光互补法(BiFC)精确MICOS复合物精细结构 被引量：1
6
作者 刘文晓 闫朝君 宋质银 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期690-694,共5页
在真核细胞中,线粒体是能量合成与物质代谢的重要场所。线粒体是双层膜细胞器,内膜向内折叠形成嵴,其中MICOS复合物对于线粒体嵴的形成起着重要作用。Mic60、Mic19和Mic10是MICOS复合物核心组成蛋白。采用双分子荧光互补技术(BiFC,bimol... 在真核细胞中,线粒体是能量合成与物质代谢的重要场所。线粒体是双层膜细胞器,内膜向内折叠形成嵴,其中MICOS复合物对于线粒体嵴的形成起着重要作用。Mic60、Mic19和Mic10是MICOS复合物核心组成蛋白。采用双分子荧光互补技术(BiFC,bimolecular fluorescence complementation)方法在活细胞中直接观察研究MICOS复合物中各组成蛋白之间的相互作用关系。发现Mic60可以与Mic19发生较强的相互作用,而Mic60与Mic10的相互作用较弱。 展开更多
关键词 线粒体 MICOS复合物 双分子荧光互补
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玉米中ClassⅠ和ClassⅡNAS蛋白之间的BiFC互作研究
7
作者 肖克 周晓今 +1 位作者 陈茹梅 逄森 《生物技术进展》 2022年第5期728-736,共9页
烟草胺合成酶(nicotianamine synthase,NAS)能够催化合成植物体内铁运输所需的螯合物烟草胺(nicotianamine,NA),在植物维持铁稳态方面发挥重要的作用。玉米、小麦和大麦等禾本科植物的NAS蛋白进化为ClassⅠ和ClassⅡ两个亚家族,可能分... 烟草胺合成酶(nicotianamine synthase,NAS)能够催化合成植物体内铁运输所需的螯合物烟草胺(nicotianamine,NA),在植物维持铁稳态方面发挥重要的作用。玉米、小麦和大麦等禾本科植物的NAS蛋白进化为ClassⅠ和ClassⅡ两个亚家族,可能分别参与调节铁的吸收和运输,其家族成员之间蛋白序列同源性较高,ClassⅡNAS具有特异的N端可变结构域。通过进化分析分析玉米NAS的两个亚家族,以及建模预测两类亚家族代表基因ZmNAS1(ClassⅠ)和ZmNAS3(ClassⅡ)的蛋白结构,结果表明ZmNAS1和ZmNAS3的三维结构高度相似,推测可能通过同源或异源二聚体化发挥功能;进一步通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)分析ZmNAS1和ZmNAS3的相互作用,结果表明,ZmNAS1和ZmNAS3蛋白可以互作,删除N端可变结构域的ZmNAS3ΔN只能与ZmNAS3蛋白互作而不与ZmNAS1互作,推测ZmNAS可以形成同源二聚体,而形成异源二聚体需要ClassⅡ家族蛋白的N端可变结构域。研究结果揭示了玉米中ClassⅡNAS调控铁稳态的机制,其分子机制仍需进一步研究。 展开更多
关键词 玉米 烟草胺合成酶 N端可变结构域 双分子荧光互作
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BiFC-SUMO:人类SUMO化修饰位点及非共价结合底物的大规模筛选策略 被引量：1
8
作者 蒋帅 梁嘉祺 +5 位作者 李嘉文 曾彦儒 谢晨恺 马文宾 谢宇斌 任间 《中国科学：生命科学》 CSCD 北大核心 2024年第9期1663-1676,共14页
小泛素相关修饰(small ubiquitin-related modification,SUMO)是一种翻译后修饰,在多种生理病理过程中发挥关键作用.SUMO蛋白通过共价键和非共价键的方式与靶蛋白相互作用,分别称为SUMO化修饰和SUMO非共价结合.大多数研究关注SUMO化修饰... 小泛素相关修饰(small ubiquitin-related modification,SUMO)是一种翻译后修饰,在多种生理病理过程中发挥关键作用.SUMO蛋白通过共价键和非共价键的方式与靶蛋白相互作用,分别称为SUMO化修饰和SUMO非共价结合.大多数研究关注SUMO化修饰,而对于作用力弱且短暂的SUMO结合,特别是同时检测SUMO化修饰和SUMO结合的研究都十分缺乏.为了克服这一限制,我们基于双分子荧光互补实验(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)和深度学习算法DeepSUMO,开发了一个同时鉴定SUMO化修饰和SUMO非共价结合靶蛋白的高通量流程.通过该流程,成功鉴定了1379个非共价和8457个共价SUMO调控靶蛋白,其中超过70%是首次鉴定到的.本研究结果突出了SUMO化修饰和SUMO非共价结合的关键调控作用,可为未来SUMO作用的研究提供宝贵的资源.DeepSUMO已被开发为一个在线工具(http://deepsumo.renlab.org)供研究者使用. 展开更多
关键词 SUMO 双分子荧光互补 深度学习 翻译后修饰
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盐胁迫下细叶百合酵母文库构建及LpNAC14互作蛋白筛选
9
作者 刘同非 李徐斐 +1 位作者 车海涛 张彦妮 《西北林学院学报》 北大核心 2025年第1期32-41,共10页
本研究旨在探索细叶百合NAC转录因子LpNAC14应答盐胁迫的信号通路,分析其互作蛋白,奠定相关基因功能研究基础。利用盐胁迫下细叶百合的叶片和根,通过Gateway法构建了酵母双杂交cDNA文库,使用2个无自激活活性的LpNAC14基因片段构建诱饵载... 本研究旨在探索细叶百合NAC转录因子LpNAC14应答盐胁迫的信号通路,分析其互作蛋白,奠定相关基因功能研究基础。利用盐胁迫下细叶百合的叶片和根,通过Gateway法构建了酵母双杂交cDNA文库,使用2个无自激活活性的LpNAC14基因片段构建诱饵载体,分别与文库质粒共转化筛选互作蛋白,对筛选到的结果进行回转验证和GO富集分析,选取其中一个转录因子LpDi19-2与LpNAC14进行BiFC验证。结果表明,构建细叶百合酵母文库容量1.12×10^(7) CFU,重组率100%,插入片段平均长度1 000 bp以上。文库共转化初步筛选到19个与LpNAC14互作的蛋白。BiFC验证LpDi19-2与LpNAC14体内互作。研究表明盐胁迫下细叶百合酵母文库质量较高,符合筛选标准,筛选结果可靠性较高,为探究LpNAC14响应盐胁迫机制提供新方向。 展开更多
关键词 细叶百合 cDNA文库 NAC转录因子 盐胁迫 bifc
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GmSZFP互作蛋白的筛选及GmERF7在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能分析
10
作者 齐梦楠 赵玎玲 +6 位作者 张雪妍 张玉洁 王荣纳 刘兵强 闫龙 张洁 王冬梅 《中国农业科学》 北大核心 2025年第14期2739-2750,共12页
【目的】大豆作为一种重要的经济和油料作物,其产量和品质常受大豆花叶病毒病的严重威胁,大豆花叶病毒病由大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)引发。实验室前期筛选到一个差异表达的C2H2型单锌指蛋白基因GmSZFP,在大豆抵抗SMV侵染... 【目的】大豆作为一种重要的经济和油料作物,其产量和品质常受大豆花叶病毒病的严重威胁,大豆花叶病毒病由大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)引发。实验室前期筛选到一个差异表达的C2H2型单锌指蛋白基因GmSZFP,在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。利用酵母双杂交文库筛选其互作蛋白,并探究互作蛋白在大豆与SMV互作过程中的功能,为进一步解析大豆抵御SMV侵染过程中转录因子的调控网络提供理论依据。【方法】以大豆品种冀豆7号、SMV毒株SC-8和N3组成的亲和、不亲和组合为试验材料,利用酵母双杂交文库筛选GmSZFP的潜在互作蛋白,借助酵母双杂交技术(Y2H)和双分子荧光互补试验(BiFC)验证二者的互作关系。运用实时荧光定量PCR(qPCR)和烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术(TRV-VIGS)分析潜在互作蛋白基因的表达特征及其在大豆与SMV互作过程中的功能。【结果】利用酵母双杂交文库筛选到GmSZFP的潜在互作靶蛋白GmERF7,Y2H和BiFC试验证明二者存在互作关系。GmERF7全长393个AA,包含一个AP2/ERF结构域和2个核定位(NLS)结构域;qPCR结果表明,在亲和组合中,GmERF7在接种病毒后4、12和24 h的表达水平显著高于不亲和组合,且在24 h时表达量达到峰值;利用VIGS技术沉默GmERF7,在亲和组合中,大豆叶片的接种部位有明显的胼胝质积累,而对照中几乎看不到胼胝质荧光;并且在接种后14 d,在基因沉默植株的上位叶中未检测到SMV外壳蛋白基因CP的表达,叶片未出现感染SMV症状,而在对照组中检测到CP的表达,并出现花叶、失绿等感病症状。以上结果表明,沉默GmERF7降低了SMV对大豆植株的侵染能力,增强了大豆对SMV的抗性,说明GmERF7负调控大豆的抗病性。【结论】ERF类转录因子GmERF7能够与锌指蛋白GmSZFP互作,在大豆与SMV互作过程中负调控大豆对SMV的抗性。 展开更多
关键词 大豆花叶病毒 GmSZFP GmERF7 互作蛋白 酵母双杂交文库 双分子荧光互补试验
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调控棘孢木霉几丁质酶Tachi2基因的转录因子和蛋白的互作研究
11
作者 曲珊 赵月 +2 位作者 李雅华 郑桂玲 咸洪泉 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期310-319,共10页
【目的】生防菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum)TD3104产生的几丁质酶Tachi2在植物病害防治过程中发挥重要作用,47号转录因子作用于特异响应几丁质诱导的Tachi2基因启动子顺式作用元件。探究47号转录因子与一种新调控蛋白H63的互作关... 【目的】生防菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum)TD3104产生的几丁质酶Tachi2在植物病害防治过程中发挥重要作用,47号转录因子作用于特异响应几丁质诱导的Tachi2基因启动子顺式作用元件。探究47号转录因子与一种新调控蛋白H63的互作关系,为解析几丁质诱导调控基因转录表达机制提供科学依据。【方法】利用酵母双杂交系统对棘孢木霉几丁质酶基因Tachi2中47号转录因子的候选互作蛋白H63进行体内点对点互作鉴定;采用大肠杆菌表达系统分别对H63蛋白与47号转录因子基因进行原核诱导表达,利用亲和层析技术纯化融合蛋白,通过GST pull-down实验进行体外蛋白互作检测;利用农杆菌介导的洋葱表皮细胞亚细胞定位技术和BiFC实验进一步检测细胞内蛋白的相互作用。【结果】H63蛋白与47号转录因子在酵母细胞内存在互作关系;原核表达的重组H63蛋白、47号转录因子大小分别为36 kD和18 kD,二者在体外存在互作关系;成功构建了双分子荧光互补载体,证实H63蛋白与47号转录因子在洋葱内表皮细胞中存在相互作用,并且互作发生在细胞核内。【结论】证实H63蛋白与47号转录因子在细胞内外均存在相互作用,为解析真菌几丁质酶基因的表达调控、几丁质酶在农业和生物医药领域的开发利用奠定理论基础。 展开更多
关键词 棘孢木霉 几丁质酶 转录因子 基因表达 互作蛋白 酵母双杂交 GSTPull-down 双分子荧光互补
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水稻草状矮化病毒外壳蛋白CP自身互作研究
12
作者 胡昱颛 程淑媛 +6 位作者 王全兴 杜磊 张金艺 高欣语 刘冰 蒋军喜 熊桂红 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期32-40,共9页
【目的】明确水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)外壳蛋白CP的自身互作,为揭示CP蛋白在RGSV侵染中的功能提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交(Y2H)技术鉴定RGSV CP与CP蛋白之间的互作。提取感染RGSV水稻叶片的总RNA,通过... 【目的】明确水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)外壳蛋白CP的自身互作,为揭示CP蛋白在RGSV侵染中的功能提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交(Y2H)技术鉴定RGSV CP与CP蛋白之间的互作。提取感染RGSV水稻叶片的总RNA,通过RT-PCR扩增得到CP基因。将CP基因分别构建到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7上,利用菌液PCR鉴定阳性克隆。将酵母质粒组合pGBKT7-CP/pGADT7、pGBKT7-CP/pGADT7-CP、阳性对照pGADT7-T/pGBKT7-53、阴性对照pGADT7-T/pGBKT7-Lam分别转化到酵母感受态细胞Y2HGold中,先后涂布于缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上。通过观察酵母细胞在缺陷培养基上的生长和显色情况鉴定CP蛋白的毒性、自激活活性和自身互作关系。利用亚细胞定位和双分子荧光互补(BiFC)鉴定CP在本氏烟中的定位及互作。将CP构建到植物瞬时表达载体pEarleyGate101(101)、pEarleyGate202-YN(YN)、pEarleyGate202-YC(YC)上,并利用菌液PCR鉴定阳性克隆。将阳性克隆101-CP、YN-CP、YC-CP、空载体YN、YC分别转化到农杆菌GV3101中。将含阳性质粒101-CP的农杆菌单独注射本氏烟叶片;将含阳性质粒YN-CP/YC-CP、阴性对照YN-CP/YC、YN/YC-CP的农杆菌共注射本氏烟叶片;利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的发光和定位。【结果】RT-PCR扩增得到CP基因,其大小为978bp。成功构建酵母表达载体pGBKT7-CP和pGADT7-CP。含质粒pGBKT7-CP/pGADT7、pGBKT7-CP/pGADT7-CP、阳性对照和阴性对照的酵母菌均能在缺陷培养基SD/-Leu/-Trp平板上生长,且含质粒pGBKT7-CP/pGADT7的酵母菌的生长情况与对照一致,说明CP蛋白对酵母菌无毒性。但仅含质粒pGBKT7-CP/pGADT7-CP的酵母菌和阳性对照可在缺陷培养基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal平板上生长并显色,表明CP蛋白无自激活活性,且CP蛋白在酵母细胞中能够自身互作。成功构建CP基因的植物表达载体;亚细胞定位结果显示,CP蛋白主要定位于本氏烟细胞的细胞核和细胞膜上。BiFC结果显示CP存在自身互作,且互作也定位于本氏烟细胞的细胞核和细胞膜。【结论】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁。RGSVCP是该病毒的外壳蛋白,可能在病毒复制、装配、侵染等过程中发挥着重要的作用。通过亚细胞定位、Y2H和BiFC鉴定了RGSVCP的定位和自身互作,为CP蛋白的功能研究提供参考,为解析RGSV的致病机制提供依据。 展开更多
关键词 水稻草状矮化病毒 外壳蛋白 载体构建 酵母双杂交 亚细胞定位 双分子荧光互补 蛋白互作
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DdSOC1基因调控德阳柿成花分子机制
13
作者 万建琦 丁瑜 +4 位作者 任晗 李雯霞 杨勇 黄金盟 关长飞 《果树学报》 北大核心 2025年第2期276-287,共12页
【目的】探究DdSOC1基因调控德阳柿(Diospyros deyangensis)成花的分子机制。【方法】通过生物信息学、基因表达量分析、酵母双杂筛库和双杂互作验证等方法,解析DdSOC1基因在调控成花中的功能。【结果】德阳柿DdSOC1序列和君迁子DlSOC1... 【目的】探究DdSOC1基因调控德阳柿(Diospyros deyangensis)成花的分子机制。【方法】通过生物信息学、基因表达量分析、酵母双杂筛库和双杂互作验证等方法,解析DdSOC1基因在调控成花中的功能。【结果】德阳柿DdSOC1序列和君迁子DlSOC1序列遗传距离较近;在成花诱导过程中,DdSOC1在茎、叶、芽中随开花进程出现差异表达;基于柿酵母文库,筛选获得7个DdSOC1的互作蛋白(MIOX、AGL14、JOINTLESS、GL2、NOVEIN、NBS、UBC7),酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明,DdSOC1和上述7个蛋白均互作;qRT-PCR结果显示,一年生已开花的德阳柿SOC1、AGL14、JOINTLESS、NOVEIN、GL2、UBC7、NBS的表达量,幼叶高于成龄叶;二年生实生苗中,SOC1表达量差异不大,而AGL14、JOINTLESS、GL2、UBC7、MIOX表达量在开花实生苗中的表达量高于未开花实生苗。【结论】DdSOC1及其互作蛋白在德阳柿成花转变中发挥着重要作用,为探究德阳柿短童期分子调控网络提供了更多理论依据。 展开更多
关键词 德阳柿 DdSOC1 互作蛋白 酵母双杂交 双分子荧光互补 实时荧光定量分析
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玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛选 被引量：16
14
作者 雷海英 白凤麟 +1 位作者 段永红 王志军 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期598-606,共9页
为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用SMART技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库;依据ZmCEN基因的CDS序... 为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用SMART技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库;依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物,构建重组诱饵载体(pGBKT7-ZmCEN)转化酵母菌株Y2HGold,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋白(ZmCEN)互作的猎物蛋白。将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b(TON1b)再次验证相互作用,并选取互作蛋白TON1b,采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验证它们在细胞内的互作;并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene ontology(GO)注释分析。结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×107 CFU,文库滴度5.36×108 CFU/mL,符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能,所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证,最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。GO注释显示互作蛋白参与的生物过程有21种。BiFC结果显示,蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系。酵母双杂交系统cDNA文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 ZmCEN SMART技术 CDNA文库 酵母双杂交 bifc GO分析
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基于Gateway技术的低成本植物双分子荧光互补分析系统 被引量：6
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作者 周洁 王栩鸣 +5 位作者 陈斌 陈娟 杨勇 余初浪 严成其 陈剑平 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期1024-1030,共7页
创制基于Gateway重组技术的双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)载体,同时创制低成本低克隆背景的Gateway入门载体。利用入门载体,采用Gateway技术快速将目标基因重组到BiFC目标载体,并采用农杆菌注射侵染... 创制基于Gateway重组技术的双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)载体,同时创制低成本低克隆背景的Gateway入门载体。利用入门载体,采用Gateway技术快速将目标基因重组到BiFC目标载体,并采用农杆菌注射侵染烟草的方法观察荧光互作结果。构建的Gateway入门载体,由于带有ccdB基因,非线性化的载体无法在ccdB敏感菌株中生长,因此消除了载体本身的背景。同时由XcmⅠ酶切后产生的T突出,可以很好地与PCR产物结合,连接效率和普通商业化T载体一致。此外,由于载体可由实验室自行制备且采用了TA克隆,创制入门克隆的成本大大降低。借助该研究改造的BiFC目标载体,目的基因能快速地重组到目的载体用于基因互作鉴定。利用本研究构建的Gateway系统,能够以较低成本快速的进行基因克隆和互作研究。 展开更多
关键词 入门载体 bifc 基因互作 GATEWAY
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双分子荧光互补技术 被引量：15
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作者 樊晋宇 崔宗强 张先恩 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期767-774,共8页
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相... 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新形成能具有活性的荧光蛋白.BiFC方法简单直观,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位相互作用蛋白质的位点.多色BiFC系统共用或与荧光共振能量转移(FRET)技术联用,还可以检测细胞内多个蛋白质的相互作用. 展开更多
关键词 双分子荧光互补(bifc) 蛋白质相互作用 检测 定位
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SSR4蛋白特征的分析及其与猪非典型瘟病毒云南株Mut蛋白的互作
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作者 田鑫 王雯 +4 位作者 钱友俊 刘千歆 邹子恒 杨玉艾 孙永科 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第8期1593-1600,1623,共9页
为了研究猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus,APPV)云南株关键变异基因(APPV-YN-Mut)蛋白与宿主蛋白信号序列受体蛋白4(signal sequence receptor subunit 4,SSR4)之间是否存在直接相互作用,利用ProtParam、PredictProtein、TM... 为了研究猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus,APPV)云南株关键变异基因(APPV-YN-Mut)蛋白与宿主蛋白信号序列受体蛋白4(signal sequence receptor subunit 4,SSR4)之间是否存在直接相互作用,利用ProtParam、PredictProtein、TMHMM等在线软件对SSR4基因表达蛋白的理化性质、空间结构、亚细胞定位等进行分析预测;通过构建重组载体pCMV-Tag4A-SSR4和pET-GST-Mut在体外进行GST pull-down试验;构建重组载体pBiFC-VN173-SSR4和pBiFC-VC155-Mut在细胞内进行双分子荧光互补试验(BiFC),验证APPV-YN-Mut与宿主蛋白SSR4之间是否存在体外和细胞内的直接相互作用。结果显示,SSR4蛋白是疏水性稳定蛋白,无跨膜结构,有信号肽,二级结构主要以无规则卷曲为主,三级结构稳定,主要位于内质网中;GST pull-down和BiFC试验结果显示,APPV-YN-Mut与宿主蛋白SSR4在体外和细胞内都存在直接相互作用。 展开更多
关键词 猪非典型瘟病毒 蛋白互作 双分子荧光互补 GST pull-down
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CsKNAT3亚细胞定位与转录活性分析 被引量：4
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作者 张利国 《分子植物育种》 CAS 北大核心 2023年第11期3568-3571,共4页
为进一步探究CsKNAT3蛋白的功能与作用,本研究采用亚细胞定位,确定CsKNAT3能够定位于细胞核中作为转录因子发挥调节作用,同时采用原生质体瞬时转染确定CsKNAT3能够下调下游基因的表达,为转录抑制因子。研究通过酵母双杂交初步证实了CsKN... 为进一步探究CsKNAT3蛋白的功能与作用,本研究采用亚细胞定位,确定CsKNAT3能够定位于细胞核中作为转录因子发挥调节作用,同时采用原生质体瞬时转染确定CsKNAT3能够下调下游基因的表达,为转录抑制因子。研究通过酵母双杂交初步证实了CsKNAT3与CsATH1存在蛋白互作关系,双分子荧光互补进一步印证了这个蛋白互作,由于CsATH1是一个多效的植物发育调节因子,暗示CsKNAT3可能在植株发育过程中发挥重要调控作用。本研究对揭示KNOX家族蛋白调控植物形态建成分子机理具有重要意义。 展开更多
关键词 CsKNAT3 转录活性 蛋白互作 bifc
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CsBLH7与CsKNAT4蛋白互作调节下胚轴细胞的伸长 被引量：4
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作者 张利国 《江苏农业科学》 北大核心 2022年第6期41-44,共4页
CsBLH7与CsKNAT4分别属于BELL类蛋白与KNOX类蛋白,可能与植物器官形态建成密切相关,但目前几乎没有关于CsBLH7与CsKNAT4蛋白互作的深入研究报道。采用酵母双杂交初步确定CsBLH7与CsKNAT4能够在细胞体内互作,形成BLH7-KNAT4蛋白复合物。... CsBLH7与CsKNAT4分别属于BELL类蛋白与KNOX类蛋白,可能与植物器官形态建成密切相关,但目前几乎没有关于CsBLH7与CsKNAT4蛋白互作的深入研究报道。采用酵母双杂交初步确定CsBLH7与CsKNAT4能够在细胞体内互作,形成BLH7-KNAT4蛋白复合物。双分子荧光互补(BiFC)进一步确定了这种互作关系。原生质体瞬时转染试验结果表明,CsBLH7与CsKNAT4分别为转录抑制因子与转录激活因子。同时,针对35S:CsBLH7、35S:CsKNAT4材料的形态分析结果表明,下胚轴细胞长度分别缩短与伸长,这与它们的转录活性相适应。再者,35S:CsBLH7、35S:CsKNAT4遗传材料的赤霉素合成酶基因分别下调与上调。研究结果表明,BLH7-KNAT4可能是通过调节赤霉素合成来调控下胚轴细胞长度,对揭示CsBLH7和CsKNAT4调控植物形态建成分子机理具有重要意义。 展开更多
关键词 CsBLH7 CsKNAT4 蛋白互作 bifc 下胚轴细胞 转录活性 植物形态建成
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双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展 被引量：1
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作者 陈菁 《生物医学工程研究》 2008年第4期302-306,共5页
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是指两个不发光的荧光蛋白互补片段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧光复合物,恢复荧光特性。基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的蛋白... 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是指两个不发光的荧光蛋白互补片段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧光复合物,恢复荧光特性。基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的蛋白质相互作用研究中得到越来越广泛的应用。我们对双分子荧光互补技术的原理、特性、应用现状、面临的问题及应用前景进行了概述。 展开更多
关键词 双分子荧光互补(bifc) 互补片段 荧光复合物 蛋白质相互作用
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