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Research on the Construction of Bacterial Artificial Chromosome Vector DNA and the Potentials in Application
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作者 崔红玉 王亚萍 +5 位作者 徐明举 薛永志 石星明 兰德松 王云峰 童光志 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2008年第2期70-75,共6页
[ Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119- Bluelox BAC. [ Method ] With selecting a proper single restriction site, seque... [ Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119- Bluelox BAC. [ Method ] With selecting a proper single restriction site, sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector. [ Result] The gene sequence of BAC vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection. [ Conclusion] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAC vector, besides that it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library. 展开更多
关键词 bacterial artificial chromosome bac High-copy plasmid bac vector Single-copy plasmid
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一种BAC载体的构建及其在CYP2A6单倍型分析中的应用
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作者 赵芳玲 綦钰莹 +1 位作者 蔡剑平 戴大鹏 《医学研究杂志》 2024年第2期24-28,111,共6页
目的构建大片段基因克隆用高拷贝BAC质粒载体以用于CYP2A6基因的单倍型分析。方法利用退火程序生成包含多克隆位点的寡核苷酸,分别连接入HindⅢ/BamHⅠ双酶切后的pGEM-3Z载体及pBeloBAC11载体,随后使用HindⅢ单酶切中间载体并连接,利用... 目的构建大片段基因克隆用高拷贝BAC质粒载体以用于CYP2A6基因的单倍型分析。方法利用退火程序生成包含多克隆位点的寡核苷酸,分别连接入HindⅢ/BamHⅠ双酶切后的pGEM-3Z载体及pBeloBAC11载体,随后使用HindⅢ单酶切中间载体并连接,利用蓝白斑筛选获得头尾串联的高拷贝BAC载体pBAC-BJH。利用STI PCR的方法扩增CYP2A6基因全长,经切胶纯化后利用BstBⅠ与MluⅠ双酶切,并与同样双酶切的pBAC-BJH载体连接,转化大肠杆菌以获得包含新突变355A>T的全长Bac克隆用于单倍型测序分析。结果成功构建了增加7个多克隆酶切位点的高拷贝BAC载体pBAC-BJH。该载体具有拷贝数高、可选酶切位点多等优势。利用该载体对CYP2A6的基因分型结果显示,新突变体携带22C>T、51A>G、355A>T,3个SNP单倍型为CGT。结论成功构建了方便用于大片段基因克隆的载体pBAC-BJH,该载体可用于p450基因的单倍型分析及其他大片段基因克隆分析。 展开更多
关键词 高拷贝 bac载体 CYP2A6 单倍型分析
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关于细菌人工染色体(BAC)文库载体DNA制备的研究 被引量:9
3
作者 姜涛 刘越 +1 位作者 孔秀英 贾继增 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第12期1126-1131,共6页
细菌人工染色体 (BAC)文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAC文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备。制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切、脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料 ,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷... 细菌人工染色体 (BAC)文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAC文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备。制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切、脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料 ,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷 ,并结合凝胶回收纯化技术 ,制备了可用于进一步构建BAC文库的线性载体DNA。并在此基础上 ,确定了制备BAC载体DNA的适宜条件 ,其中包括确定适宜限制内切酶用量及酶切时间 ,脱磷酶种类及浓度和凝胶回收纯化线性载体DNA等关键步骤。 展开更多
关键词 细菌人工染色体 bac 文库 载体DNA 制备 酶切 脱磷 凝胶回收纯化
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基于BAC重组酶系统构建莱航鸡多位点基因打靶载体的研究 被引量:4
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作者 唐冬生 李芳 +4 位作者 蒋泓 胡大林 张细权 李月琴 周天鸿 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期241-245,共5页
以莱航鸡重复的rDNA基因间的间隔序列为靶位点,利用BAC重组酶系统构建含人干扰素基因的多位点基因打靶载体,为建立莱航鸡多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GID表达载体。将BAC-TDN筛选载体和pYLV... 以莱航鸡重复的rDNA基因间的间隔序列为靶位点,利用BAC重组酶系统构建含人干扰素基因的多位点基因打靶载体,为建立莱航鸡多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GID表达载体。将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GID表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过其Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GID质粒,采用归位内切酶I-SceⅠ切除pYLVS质粒骨架,利用接头LS使之环化,构建成莱航鸡大容量多位点基因打靶载体BAC-TDN-GID。每次克隆均经酶切或PCR、测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向。以该载体为材料的多位点基因打靶技术将提高基因定点整合效率,解决外源基因不能稳定表达、安全性等部分问题,突破了DNA重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。 展开更多
关键词 基因打靶 多位点 载体 细菌人工染色体 重组酶系统 莱航鸡 重复序列
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一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法 被引量:1
5
作者 崔红玉 王亚萍 +5 位作者 徐明举 薛永志 石星明 兰德松 王云峰 童光志 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第23期9890-9892,9950,共4页
[目的]简便有效地解决BAC载体序列因单一拷贝数带来的制备以及下游亚克隆操作的困难。[方法]选择适当的单一酶切位点,将单拷贝BAC载体质粒序列全部插入高拷贝质粒pUC119载体的适当位点。[结果]BAC载体基本功能基因序列在新质粒pUC119-BA... [目的]简便有效地解决BAC载体序列因单一拷贝数带来的制备以及下游亚克隆操作的困难。[方法]选择适当的单一酶切位点,将单拷贝BAC载体质粒序列全部插入高拷贝质粒pUC119载体的适当位点。[结果]BAC载体基本功能基因序列在新质粒pUC119-BAC中失去了单一拷贝数控制功能,以高拷贝形式进行复制,利用单一酶切,可将BAC载体基本功能基因序列完整切下来,自连后重新恢复严格的单拷贝控制功能。[结论]利用高拷贝pUC119-BAC质粒,实现了BAC载体的基本功能基因序列高拷贝的复制和扩增,可以方便地用于分子克隆化重组病毒转移载体的构建或BAC文库的构建。 展开更多
关键词 细菌人工染色体(bac) 高拷贝质粒 bac载体 单拷贝质粒
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Bac-to-Bac系统的研究进展及在家蚕中的应用 被引量:3
6
作者 吴小锋 岳万福 +2 位作者 刘剑梅 李广立 缪云根 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期146-150,共5页
Bac-to-Bac策略是目前昆虫杆状病毒表达系统获取重组杆状病毒最为方便、快捷的途径之一。以Bac-to-Bac系统面向的苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcMNPV)表达系统、家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统、棉铃虫杆状病毒(HaNPV)表达系统等3个主要子系统... Bac-to-Bac策略是目前昆虫杆状病毒表达系统获取重组杆状病毒最为方便、快捷的途径之一。以Bac-to-Bac系统面向的苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcMNPV)表达系统、家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统、棉铃虫杆状病毒(HaNPV)表达系统等3个主要子系统为对象,从宿主域逐渐扩大、蛋白的表达水平不断提高、筛选和纯化更为简便高效以及在家蚕中应用的状况等角度,对Bac-to-Bac系统的发展及功能、特点等进行了阐述。 展开更多
关键词 bac—to-bac系统 杆状病毒表达载体系统 家蚕
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大肠杆菌链霉菌假单胞菌穿梭表达BAC载体的构建 被引量:1
7
作者 黄慧颖 宋杰 尚广东 《南京师大学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期104-108,共5页
异源表达生理活性物质的生物合成基因簇是药物研发领域的一个重要的方向,它可通过异源表达来研究基因功能,获得目标化合物或对现有的化合物进行结构改造.生物合成基因簇一般较大,常规的DNA载体由于容量不足、拷贝数较低或不能在不同的... 异源表达生理活性物质的生物合成基因簇是药物研发领域的一个重要的方向,它可通过异源表达来研究基因功能,获得目标化合物或对现有的化合物进行结构改造.生物合成基因簇一般较大,常规的DNA载体由于容量不足、拷贝数较低或不能在不同的异源宿主间穿梭表达而难以对其进行操作.本研究运用重组工程策略和常规的克隆手段,将多个异源表达所必须的功能基因克隆至常用的构建BAC文库的载体pECBAC1,获得了一个可在大肠杆菌链霉菌假单胞菌3个常见的异源表达宿主间进行穿梭表达的BAC载体. 展开更多
关键词 bac载体 重组工程 穿梭表达
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一种改进的用高拷贝质粒制备BAC载体的新方法 被引量:2
8
作者 邓代永 杨继良 +3 位作者 宣劲松 张明哲 翁曼丽 王斌 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2003年第7期29-33,共5页
介绍了一种改进的使用高拷贝质粒制备BAC载体的简便有效的方法 ,我们同时使用从高拷贝质粒 pCUGIBAC1制备的和用传统方法从单拷贝质粒 pIndigoBAC 5制备的两种载体 ,比较了这两种载体与玉米大片段DNA连接所构建的BAC文库。结果表明在使... 介绍了一种改进的使用高拷贝质粒制备BAC载体的简便有效的方法 ,我们同时使用从高拷贝质粒 pCUGIBAC1制备的和用传统方法从单拷贝质粒 pIndigoBAC 5制备的两种载体 ,比较了这两种载体与玉米大片段DNA连接所构建的BAC文库。结果表明在使用这两种BAC载体构建的BAC文库中 ,所获得的转化体数目 ,及在BAC克隆中插入的DNA片段的大小和BAC克隆的稳定性等方面都相同 ,从而证明本文所介绍的从高拷贝质粒 pCUGIBAC1来制备BAC载体是一种更方便的方法 。 展开更多
关键词 高拷贝质粒 细菌人工染色体 载体 制备方法 DNA 转化体 克隆稳定性 bac文库
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基因组文库的构建和池化筛选 被引量:3
9
作者 陈献伟 娜日苏 +5 位作者 朱超 王会 雷娜 高剑峰 关伟军 马月辉 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期11-15,共5页
作为物种保护策略的重要部分,建立濒危畜禽的基因组文库,可有效保存濒危畜禽种质资源。BAC(bacterialartificial chromosome)文库具有高容量、遗传特性稳定和嵌合体少等优点,因而被用于畜禽基因组文库的构建。对BAC文库的构建方法和文... 作为物种保护策略的重要部分,建立濒危畜禽的基因组文库,可有效保存濒危畜禽种质资源。BAC(bacterialartificial chromosome)文库具有高容量、遗传特性稳定和嵌合体少等优点,因而被用于畜禽基因组文库的构建。对BAC文库的构建方法和文库池化筛选系统作一综述。 展开更多
关键词 bac载体 基因组文库 池化 筛选
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基于Kohonen和BP神经网络的文本学习算法 被引量:6
10
作者 傅忠谦 王新跃 +2 位作者 周佩玲 彭虎 陶小丽 《计算机工程与应用》 CSCD 北大核心 2001年第1期76-78,共3页
介绍了基于Kohonen和BP神经网络结合的Internet网上文本学习算法。它采用向量空间模型对文本进行编码,利用 Kohonen网络的自组织特性和BP网络的非线性特性进行学习。经过训练,算法能够有效地对输入文本进... 介绍了基于Kohonen和BP神经网络结合的Internet网上文本学习算法。它采用向量空间模型对文本进行编码,利用 Kohonen网络的自组织特性和BP网络的非线性特性进行学习。经过训练,算法能够有效地对输入文本进行判断,给出一个评价等级,标识出文本和用户兴趣的相关程度,从而为基于Internet的信息过滤、智能浏览等处理提供基础。 展开更多
关键词 KOHONEN神经网络 BP神经网络 INTERNET网 信息检
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白蜡虫蜡酯合酶在昆虫细胞Sf9中的表达 被引量:2
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作者 亓倩 于淑惠 +4 位作者 孙涛 王雪庆 刘博文 杨璞 陈晓鸣 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2016年第2期191-195,共5页
[目的]本研究欲利用Bac-to-Bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS。[方法]将WS编码序列克隆到质粒p FastBac^(TM)HT B后,转化大肠杆菌DH10Bac^(TM),经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒r Bacmid/Epel WS。将r Bacmid/EpelWS转染Sf9细胞。[结果]... [目的]本研究欲利用Bac-to-Bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS。[方法]将WS编码序列克隆到质粒p FastBac^(TM)HT B后,转化大肠杆菌DH10Bac^(TM),经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒r Bacmid/Epel WS。将r Bacmid/EpelWS转染Sf9细胞。[结果]免疫荧光标记检测表明:WS在受感染细胞的细胞质中表达。[结论]本研究成功表达了白蜡虫WS,为白蜡虫WS的生化特性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 白蜡虫 蜡酯合酶 载体构建 bac-to-bac表达系统 Sf9细胞系
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细菌人工染色体载体的发展和应用 被引量:1
12
作者 陈献伟 王会 +2 位作者 雷娜 关伟军 马月辉 《现代生物医学进展》 CAS 2009年第9期1745-1748,1700,共5页
细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)是在大肠杆菌F质粒的基础上建成的高容量、低拷贝的质粒载体。BAC载体已广泛应用于基因组文库的构建及筛选、基因组测序、新基因的发现、图位克隆、BAC微阵列、转基因和动物品种资... 细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)是在大肠杆菌F质粒的基础上建成的高容量、低拷贝的质粒载体。BAC载体已广泛应用于基因组文库的构建及筛选、基因组测序、新基因的发现、图位克隆、BAC微阵列、转基因和动物品种资源保存等方面。本文综述了BAC载体的发展及其应用。 展开更多
关键词 bac载体 文库构建 基因组测序 转基因 动物品种资源保存
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日本血吸虫SjPP基因重组杆状病毒的构建和在昆虫细胞中的表达 被引量:3
13
作者 姚利晓 陶丽红 +3 位作者 杨冠珍 吴祥甫 蔡幼民 林矫矫 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期124-127,共4页
目的在昆虫细胞中表达获得可溶性的日本血吸虫SjPP重组蛋白。方法提取日本血吸虫成虫总RNA,通过RT-PCR扩增出SjPP基因的编码区序列,将其定向克隆到供体质粒pFastBac HT-B中,构建重组杆状病毒供体质粒pFastBac-SjPP,转化入大肠埃希菌DH10... 目的在昆虫细胞中表达获得可溶性的日本血吸虫SjPP重组蛋白。方法提取日本血吸虫成虫总RNA,通过RT-PCR扩增出SjPP基因的编码区序列,将其定向克隆到供体质粒pFastBac HT-B中,构建重组杆状病毒供体质粒pFastBac-SjPP,转化入大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组杆粒Bacmid-SjPP,用阳离子脂质体法转染粉纹夜蛾(TN5B1-4)细胞。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况。结果构建了含日本血吸虫SjPP基因的重组杆粒Bacmid-SjPP,转染TN5B1-4细胞后,获得有感染力的重组杆状病毒,并在TN5B1-4细胞中成功表达SjPP蛋白。该重组蛋白可被抗SjPP蛋白的兔血清识别。结论成功构建SjPP基因重组杆状病毒,并在TN5B1-4细胞中表达,该蛋白具有良好的抗原性。 展开更多
关键词 日本血吸虫 SjPP bac-to-bac杆状病毒表达系统
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日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定 被引量:3
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作者 胡少敏 王海 +2 位作者 阮志燕 余新炳 吴忠道 《热带医学杂志》 CAS 2005年第1期8-11,60,共5页
目的利用杆状病毒-昆虫细胞系统构建日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)Sj16基因重组杆状病毒。方法从日本血吸虫尾蚴提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Sj16基因全编码区序列,将其克隆到载体pET30a(+)中,通过PCR将Sj16基因连同pET30a(+)多... 目的利用杆状病毒-昆虫细胞系统构建日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)Sj16基因重组杆状病毒。方法从日本血吸虫尾蚴提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Sj16基因全编码区序列,将其克隆到载体pET30a(+)中,通过PCR将Sj16基因连同pET30a(+)多克隆位点下游的6×His·Tag一起扩增出来,插入donor载体pFastBacHTa中,构建重组杆状病毒donor载体pFastBacHTa-Sj16-His,转化大肠杆菌DH10Bac-GFP进行转座,提取重组Bacmid,用Lipofectin法转染昆虫细胞Sf9使其包装成有感染性的重组杆状病毒。结果构建了含日本血吸虫Sj16基因的重组Bacmid-GFP-Sj16-His,转染Sf9细胞后,获得了有感染力的重组杆状病毒。结论成功构建了日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒,为下一步重组Sj16蛋白表达和Sj16基因功能研究打下了基础。 展开更多
关键词 日本血吸虫 Sj16 杆状病毒 bac—to-bac杆状病毒表达载体系统
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细菌人工染色体载体系统在反向遗传学中的应用研究进展 被引量:1
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作者 丛彦龙 孙玉章 丁壮 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第8期81-84,共4页
细菌人工染色体是近十几年来发展起来的一种新型DNA克隆载体系统,具有操作简单、遗传稳定、容量大等明显的优势。论文主要综述了细菌人工染色体载体系统在基础研究、基因治疗及病毒载体疫苗等反向遗传学方面的研究进展。
关键词 细菌人工染色体(bac) 载体系统 反向遗传学
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昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体 被引量:1
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作者 李泰明 潘俊杰 +1 位作者 祁静 张春 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1230-1238,共9页
AAV-ITR基因表达微载体是只含有腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)倒置末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)、基因表达顺式元件和目的基因,而不含有其他外源DNA序列的双链或单链DNA。本研究利用杆状病毒表达系统,制备得... AAV-ITR基因表达微载体是只含有腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)倒置末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)、基因表达顺式元件和目的基因,而不含有其他外源DNA序列的双链或单链DNA。本研究利用杆状病毒表达系统,制备得到两种重组杆状病毒Bac-ITR-EGFP和Bac-inrep,并将二者的P3代病毒共同感染昆虫细胞Spodoptera frugiperda(Sf9),抽提小分子量DNA,获得AAV-ITR-EGFP基因表达微载体,2×107的Sf9细胞抽提可以得到100μg AAV-ITR-EGFP基因表达微载体,核酸电泳显示AAV-ITR-EGFP基因表达微载体主要以单体和二聚体的形式存在。将AAV-ITR-EGFP基因表达微载体通过polyethylenimine(PEI)转染HEK 293T细胞,24 h后荧光显微镜观察有EGFP表达,48 h后达到高峰,转化效率达到65%。 展开更多
关键词 基因治疗 基因表达微载体 杆状病毒表达系统 非病毒载体
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人工染色体载体系统的研究进展 被引量:1
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作者 姚春馨 吴成军 +1 位作者 程在全 黄兴奇 《云南农业大学学报》 CAS CSCD 2006年第2期135-141,共7页
酵母人工染色体(YACs),细菌人工染色体(BACs),噬菌体P1衍生的人工染色体(P1 s),细菌人工染色体双元载体(B IBACs),具有转化能力的载体系统(TACs),哺乳动物人工染色体(MACs)和人工游离基因染色体(HAECs)等人工染色体载体系统,是近年来不... 酵母人工染色体(YACs),细菌人工染色体(BACs),噬菌体P1衍生的人工染色体(P1 s),细菌人工染色体双元载体(B IBACs),具有转化能力的载体系统(TACs),哺乳动物人工染色体(MACs)和人工游离基因染色体(HAECs)等人工染色体载体系统,是近年来不断发展起来的DNA克隆载体系统。作为一种重要的分子生物学技术,人工染色体载体系统在生物基因组测序分析,基因的结构与功能,表达与调控,定位与分离以及遗传病的基因治疗等研究领域得到了广泛的应用。本文着重介绍细菌人工染色体载体系统(BACs)的结构,功能及发展应用情况,同时比较和介绍了YACs,PACs,PBCs,B IBACs,TACs,MACs和HAECs等人工染色体载体系统的特点。 展开更多
关键词 人工染色体 研究进展 YACs bacS
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细菌人工染色体基因组文库的构建及应用 被引量:2
18
作者 任斐 《河南科技学院学报》 2010年第1期44-48,共5页
细菌人工染色体(BAC)载体由于稳定复制、嵌合体少、分离纯化简单、转化效率高等优点,在构建基因组文库中得到了广泛的应用.BAC基因组文库构建的一般过程,主要有载体和高分子量DNA的制备、大片段DNA和载体的连接、重组载体转化受体感受... 细菌人工染色体(BAC)载体由于稳定复制、嵌合体少、分离纯化简单、转化效率高等优点,在构建基因组文库中得到了广泛的应用.BAC基因组文库构建的一般过程,主要有载体和高分子量DNA的制备、大片段DNA和载体的连接、重组载体转化受体感受态细胞、阳性克隆的挑取、文库质量的鉴定等.BAC基因组文库在基因克隆、基因组物理图谱的构建、基因组测序、比较基因组学的研究中有着十分广泛的应用.随着BAC载体的发展和更多生物BAC文库的构建,BAC基因组文库将会对基因组学研究产生重要的影响. 展开更多
关键词 bac载体 基因组文库 图位克隆 物理图谱
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适用于链霉菌大片段基因组DNA克隆和异源表达的细菌人工染色体(BAC)载体的构建及应用 被引量:11
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作者 黄胜 李娜 +1 位作者 周俊 何璟 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期30-37,共8页
【目的】很多链霉菌来源的天然产物的生物合成基因簇往往很大,用传统的cosmid载体很难完整的克隆和异源表达。本研究通过载体改造,成功构建出一个新的细菌人工染色体(BAC)载体,用于链霉菌来源的天然产物生物合成基因簇的克隆及异源表达... 【目的】很多链霉菌来源的天然产物的生物合成基因簇往往很大,用传统的cosmid载体很难完整的克隆和异源表达。本研究通过载体改造,成功构建出一个新的细菌人工染色体(BAC)载体,用于链霉菌来源的天然产物生物合成基因簇的克隆及异源表达实验。【方法】从复合型载体pCUGIBAC1出发,通过λRED介导的PCR-targeting方法,用链霉素抗性基因替换掉原有的氯霉素抗性基因标记,同时插入链霉菌中常用的安普拉霉素抗性标记、转移起始位点oriT、φC31整合酶基因int、整合位点attP等元件。【结果】成功构建出可装载链霉菌大片段DNA的BAC载体pMSBBACs。使用pMSBBACs构建出链霉菌U27的基因组BAC文库,平均插入片段大小为100 kb。选取其中一个大小为140 kb的BAC质粒进行功能验证,实验证明通过接合转移和原生质体转化的方法都能够将这个大型BAC质粒导入链霉菌模式菌株,并通过位点特异性重组整合到染色体中进行异源表达。【结论】BAC载体pMSBBACs可成功用于放线菌大片段基因组DNA的克隆和异源表达实验。 展开更多
关键词 细菌人工染色体(bac)载体 天然产物 生物合成基因簇 链霉菌 异源表达
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大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体的构建及功能验证
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作者 戴素琴 周围 +7 位作者 邢玉华 刘体颜 谭俊杰 曲国龙 王微 刘刚 陈惠鹏 张部昌 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期591-597,共7页
目的构建可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的穿梭型BAC载体,以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后,转移至链霉菌中进行异源表达。方法从原始B载体pBeloBAC11出发,利用pKD46介导的Red同源重组技术,将一段包含接合... 目的构建可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的穿梭型BAC载体,以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后,转移至链霉菌中进行异源表达。方法从原始B载体pBeloBAC11出发,利用pKD46介导的Red同源重组技术,将一段包含接合转移元件oriT、定点整合元件attp-int和安普霉素抗性基因Am的DNA片段替换其上的氯霉素抗性基因,该DNA片段通过PCR扩增得到,两端为待替换氯霉素抗性基因上下游55 bp的同源臂,替换后的载体通过酶切连入链霉菌组成型启动子ermEP1P2和绿色荧光蛋白(GFP)基因以验证其接合和整合功能。结果原载体pBeloBAC11的氯霉素抗性基因被成功替换,得到载体pBTIBAC1,利用该载体可在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24和1326中表达GFP,在pBTIBAC1上插入新的多克隆位点(MCS)后得到载体pBTIBAC11。结论 pBTIB AC11载体可通过接合转移携带外源基因片段进入链霉菌并整合至其基因组中,同时保留了原有BAC载体的功能元件,为大片段在链霉菌中的异源表达奠定了基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌 链霉菌属 接合转移 整合 RED同源重组 bac载体
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