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基于杆状病毒Bac-to-Bac系统的VLP递送mRNA疫苗平台的建立
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作者 马莉莉 王琼娴 +5 位作者 王晓丽 马孙婷 吕立新 徐彬 冯志新 欧阳伟 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第5期41-50,共10页
噬菌体MS2 VLP(噬菌体病毒样颗粒)是不含病毒遗传物质的纳米颗粒,可以自组装成一个二十面体衣壳,适合靶向传递RNA。本研究利用Bac-to-Bac系统(杆状病毒表达系统)生产MS2 VLP包裹的eGFP mRNA。分别设计、合成MS2 VLP的表达框和eGFP mRNA... 噬菌体MS2 VLP(噬菌体病毒样颗粒)是不含病毒遗传物质的纳米颗粒,可以自组装成一个二十面体衣壳,适合靶向传递RNA。本研究利用Bac-to-Bac系统(杆状病毒表达系统)生产MS2 VLP包裹的eGFP mRNA。分别设计、合成MS2 VLP的表达框和eGFP mRNA的表达框,将MS2 VLP的表达框和eGFP mRNA的表达框同时插入pFastBac Dual载体中,获得重组供体质粒pFastBacDual-MS2-eGFP mRNA。转化DH10Bac感受态,通过三抗和蓝白斑(卡拉霉素/庆大霉素/四环素/IPTG/X-Gal)筛选以及PCR鉴定,获得重组的rBacmid-MS2-eGFP mRNA。将rBacmid-MS2-eGFP mRNA转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBacmid-MS2-eGFP mRNA。通过倒置荧光显微镜观察及Western blot检测表明eGFP获得表达。用vBacmid-MS2-eGFP mRNA感染High 5悬浮细胞进行MS2-eGFP mRNA的大量表达,经超速离心纯化,电镜观察可见大量的直径约30 nm的病毒样颗粒(VLP)。提取纯化的MS2 VLP中包裹的mRNA,通过RT-PCR及测序鉴定,结果表明MS2 VLP中包裹的mRNA为eGFP mRNA。将MS2-eGFP mRNA免疫BALB/c小鼠,进行免疫原性研究,通过ELISA测得的抗体效价为1∶819200,表明MS2-eGFP mRNA可以刺激小鼠产生较强的抗原特异性抗体应答。以上结果表明,利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统生产的MS2 VLP可以包裹外源mRNA,并可将外源mRNA递送到小鼠体内产生特异性体液免疫反应。本研究建立了基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的VLP递送mRNA疫苗研究平台,为今后动物传染病的mRNA疫苗研发提供新的参考。 展开更多
关键词 bac-TO-bac MS2 VLP 递送系统 mRNA疫苗
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O_(3)-混凝沉淀-O_(3)/BAC-陶瓷膜联合工艺处理复合污染湖库水中试研究
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作者 段冬 许一帆 +3 位作者 杨文建 郭庆 刘彦伶 夏圣骥 《给水排水》 北大核心 2025年第2期13-19,49,共8页
开展了O_(3)-混凝沉淀-O_(3)/BAC-陶瓷膜联合工艺中试,探究了联合工艺对于长荡湖水处理效果及不同工况条件对跨膜压差的影响。结果表明,该工艺出水浊度可控制在0.1NTU以下,对COD_(Mn)、DOC和UV_(254)的去除率分别为73%、57%和70%,对荧... 开展了O_(3)-混凝沉淀-O_(3)/BAC-陶瓷膜联合工艺中试,探究了联合工艺对于长荡湖水处理效果及不同工况条件对跨膜压差的影响。结果表明,该工艺出水浊度可控制在0.1NTU以下,对COD_(Mn)、DOC和UV_(254)的去除率分别为73%、57%和70%,对荧光物质的去除率为67%~80%,高温季节应注意生物污染。阐明了膜污染机理与进程,为开发处理高浊度、高有机物地表水的陶瓷膜联合工艺提供参考。 展开更多
关键词 饮用水 O_(3)/bac 陶瓷膜 膜污染
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一种新型家蚕核多角体病毒Bac to Bac系统的构建 被引量:7
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作者 邓小昭 朱应 +2 位作者 刁振宇 齐义鹏 周宗安 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第2期155-160,共6页
用家蚕核型多角体病毒的全基因组DNA与AcBacmidDNA共转染家蚕BmN细胞,构建转座一穿梭载体BmBacmid。另一供体质粒以转座方式将乙肝病毒e抗原基因HBeAg整合到BmBacmid的attTn7位点上成为重组rBmHBe。结果表明BmBacmid既能在大肠杆菌中以... 用家蚕核型多角体病毒的全基因组DNA与AcBacmidDNA共转染家蚕BmN细胞,构建转座一穿梭载体BmBacmid。另一供体质粒以转座方式将乙肝病毒e抗原基因HBeAg整合到BmBacmid的attTn7位点上成为重组rBmHBe。结果表明BmBacmid既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制,又能在家蚕BmN细胞和草地夜蛾Sf9细胞中复制,形成感染性病毒粒子。Southernblotting证实重组病毒的构建是正确的。BmN细胞能正确识别与切割HBeAg信号肽序列,SDSPAGE表明HBeAg基因在家蚕细胞中高效表达,ELISA测定培养上清中HBeAg效价达1∶32000,细胞内HBeAg效价为1∶2000,培养液及细胞内的HBcAg含量极低(〈1∶160)。 展开更多
关键词 BMNPV bac to bac策略 表达系统 HBCAG
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长期服役BAC滤池的有机物去除效能与运行优化
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作者 张可佳 赖浩林 +3 位作者 岑程 周沛璇 张孝洪 傅舟跃 《长江科学院院报》 北大核心 2025年第4期87-96,共10页
生物活性炭(BAC)滤池长期服役存在有机物去除效能下降甚至失效的风险。为了探究长期服役BAC滤池的有机物去除效能并提出针对性的运行优化方案,选取了Z市LC水厂服役12 a的BAC滤池作为研究对象,采用总有机碳(Total Organic Carbon,TOC)去... 生物活性炭(BAC)滤池长期服役存在有机物去除效能下降甚至失效的风险。为了探究长期服役BAC滤池的有机物去除效能并提出针对性的运行优化方案,选取了Z市LC水厂服役12 a的BAC滤池作为研究对象,采用总有机碳(Total Organic Carbon,TOC)去除效果对其运行性能进行分析,并从臭氧(Ozone,O_(3))投加量和反冲洗方式等角度探究优化方案。结果表明:LC水厂对于有机物的去除效果存在较大波动,失效的风险较高。生物降解是长期服役BAC滤池去除有机物的主要机制,其贡献率为67%,而吸附作用的贡献率仅为33%;当O_(3)投加量为0.36~0.52 mg O_(3)/mg TOC时,LC水厂BAC滤池的运行性能较优,过低、过高的O_(3)投加量均不利于长期服役BAC滤池运行性能的提高;LC水厂表层和中上层BAC在反冲洗前均存在出水TOC升高的现象,使用含0.5 mg/L有效氯的水进行反冲洗有助于改善长期服役BAC滤池的运行性能。 展开更多
关键词 生物活性炭滤池 长期服役 有机物 去除效能 总有机碳 臭氧投加量 反冲洗方式 运行性能 优化方案
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樟树细菌人工染色体(BAC)文库的构建及质量检测 被引量:3
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作者 伍艳芳 江香梅 +2 位作者 徐海宁 汪信东 章挺 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期2481-2487,共7页
樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl)是一种具有材用、药用、油用、香料和生态环境建设等多种用途的樟科植物代表种。本研究以樟树幼嫩叶片为材料,通过提取高分子量核DNA(HMW-DNA)构建了第一个樟树细菌人工染色体(BAC)文库。该文库一共... 樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl)是一种具有材用、药用、油用、香料和生态环境建设等多种用途的樟科植物代表种。本研究以樟树幼嫩叶片为材料,通过提取高分子量核DNA(HMW-DNA)构建了第一个樟树细菌人工染色体(BAC)文库。该文库一共有36 960个克隆,平均插入片段为120 kb,覆盖樟树全基因组5.7倍左右,空载率小于1%。随机挑选10个BAC克隆进行末端测序说明BAC克隆为正常可用的单克隆。以此为基础,对樟树的BAC文库进行了测序,最终得到287.28 G的数据。樟树基因组BAC文库的构建,为樟树重要功能基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和全基因组测序等研究工作奠定了基础。 展开更多
关键词 bac文库 樟树 脉冲场电泳 bac文库测序
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甜菜夜蛾核多角体病毒BAC-TO-BAC外源基因表达系统的建立 被引量:3
6
作者 杨凯 庞义 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期412-418,共7页
用直接克隆法将miniF lacZ attTn7 kan片段插入甜菜夜蛾核多角体病毒 (Spodopteraexiguamulticapsidnucleopolyhe drovirus,SeMNPV)美国分离株 (SeUS1)基因组的多角体蛋白基因框内 ,miniF是大肠杆菌F因子复制子 ,携带miniF的重组病毒能... 用直接克隆法将miniF lacZ attTn7 kan片段插入甜菜夜蛾核多角体病毒 (Spodopteraexiguamulticapsidnucleopolyhe drovirus,SeMNPV)美国分离株 (SeUS1)基因组的多角体蛋白基因框内 ,miniF是大肠杆菌F因子复制子 ,携带miniF的重组病毒能够在大肠杆菌中低拷贝稳定复制 ,称为bacmid。由于SeUS1由不同的SeMNPV基因型组成 ,每个bacmid携带了一种病毒基因型 ,所有bacmid构成了SeUS1分离株的BAC文库。REN对 111个bacmid分析表明 ,SeUS1分离株中除了包含具有完整SeMNPV遗传信息的基因型外 ,还包括不同类型的缺失基因型。将具有完整SeMNPV基因组的基因型SeBAC10转染昆虫细胞 ,可产生子代病毒 ,故SeBAC10是一种在真核细胞和原核细胞中均能复制的穿梭质粒。因为SeBAC10中多角体蛋白基因 (Seph)被插入失活 ,将Seph作为报告基因通过位点特异性重组方式插入位于LacZ框内转座子Tn7的附着靶位点attTn7,得到重组SeBAC10 (即SeBAC10ph)转染甜菜夜蛾培养细胞Se3 0 1后 ,细胞出现典型的病理变化 ,核中出现多角体 ,证明SeMNPVBAC TO 展开更多
关键词 甜菜夜蛾核多角体病毒 bac-TO-bac外源基因表达系统 bac文库 位点特异性重组 多角体蛋白基因
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Bac-to-Bac TOPO系统表达甲型流感病毒核蛋白及其免疫原性评价
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作者 孙可为 吴业红 +3 位作者 乔永波 尹婷 孙立影 邹墅 《中国生物制品学杂志》 2025年第3期257-263,共7页
目的采用Bac-to-Bac TOPO系统表达甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP),并评价其免疫原性,以期为流感病毒NP疫苗的研究奠定基础。方法PCR法扩增甲型H1N1(A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019_CNIC-1909)流感病毒NP基因,连接至载体pFastBa... 目的采用Bac-to-Bac TOPO系统表达甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP),并评价其免疫原性,以期为流感病毒NP疫苗的研究奠定基础。方法PCR法扩增甲型H1N1(A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019_CNIC-1909)流感病毒NP基因,连接至载体pFastBac^(TM)/CT-TOPO^(TM),转化感受态E.coli One Shot^(TM) Mach1^(TM) T1R,制备供体质粒,进行PCR及测序鉴定;将供体质粒转化感受态E.coli MAX Efficiency^(TM) DH10Bac^(TM),通过蓝白斑筛选阳性单克隆,提取重组杆粒,进行PCR鉴定。将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒,流式细胞术检测病毒滴度。重组杆状病毒经多轮增殖后感染Sf9细胞,获得重组NP,并进行镍离子亲和层析纯化。将重组NP及PBS经皮下分别接种雌性BALB/c小鼠,每组6只,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体水平,流式细胞术检测小鼠脾细胞分泌IFNγ水平,酶联免疫斑点法检测小鼠脾细胞产生CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞水平。末次免疫后2周,用A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019_CNIC-1909流感病毒经小鼠鼻腔进行攻毒,监测攻毒后14 d内小鼠体质量变化及存活情况。结果PCR及测序鉴定结果证明,供体质粒构建正确;PCR鉴定结果证明,重组杆粒构建成功。重组杆状病毒滴度为2.875×10^(8) ivp/mL。重组NP可与鼠抗甲型流感病毒NP单克隆抗体发生特异性结合,纯化后纯度达91.3%。末次免疫后2周,与PBS组比较,NA组小鼠血清特异性抗体滴度(t=0.288,P<0.0001)、小鼠脾细胞产生IFNγ斑点平均数(t=9.235,P<0.0001)、产生CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞数量(t分别为10.870和6.200,P分别为0.0084和0.0250)均明显升高。PBS组小鼠感染病毒5 d后均死亡;NP组小鼠感染病毒5 d后死亡1只,剩余5只小鼠体质量下降但均存活。结论Bac-to-Bac TOPO系统表达的甲型流感病毒NP具有较高的免疫原性,能产生较强的体液和细胞免疫反应,可为小鼠抵御流感病毒感染提供一定的保护。 展开更多
关键词 bac-to-bac TOPO系统 流感病毒 核蛋白 免疫原性 杆状病毒 昆虫细胞
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一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法 被引量:1
8
作者 崔红玉 王亚萍 +5 位作者 徐明举 薛永志 石星明 兰德松 王云峰 童光志 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第23期9890-9892,9950,共4页
[目的]简便有效地解决BAC载体序列因单一拷贝数带来的制备以及下游亚克隆操作的困难。[方法]选择适当的单一酶切位点,将单拷贝BAC载体质粒序列全部插入高拷贝质粒pUC119载体的适当位点。[结果]BAC载体基本功能基因序列在新质粒pUC119-BA... [目的]简便有效地解决BAC载体序列因单一拷贝数带来的制备以及下游亚克隆操作的困难。[方法]选择适当的单一酶切位点,将单拷贝BAC载体质粒序列全部插入高拷贝质粒pUC119载体的适当位点。[结果]BAC载体基本功能基因序列在新质粒pUC119-BAC中失去了单一拷贝数控制功能,以高拷贝形式进行复制,利用单一酶切,可将BAC载体基本功能基因序列完整切下来,自连后重新恢复严格的单拷贝控制功能。[结论]利用高拷贝pUC119-BAC质粒,实现了BAC载体的基本功能基因序列高拷贝的复制和扩增,可以方便地用于分子克隆化重组病毒转移载体的构建或BAC文库的构建。 展开更多
关键词 细菌人工染色体(bac) 高拷贝质粒 bac载体 单拷贝质粒
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Research on the Construction of Bacterial Artificial Chromosome Vector DNA and the Potentials in Application
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作者 崔红玉 王亚萍 +5 位作者 徐明举 薛永志 石星明 兰德松 王云峰 童光志 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2008年第2期70-75,共6页
[ Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119- Bluelox BAC. [ Method ] With selecting a proper single restriction site, seque... [ Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119- Bluelox BAC. [ Method ] With selecting a proper single restriction site, sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector. [ Result] The gene sequence of BAC vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection. [ Conclusion] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAC vector, besides that it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library. 展开更多
关键词 bacterial artificial chromosome bac High-copy plasmid bac vector Single-copy plasmid
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Characterization of bacterial community and iron corrosion in drinking water distribution systems with O3-biological activated carbon treatment 被引量:7
10
作者 Xueci Xing Haibo Wang +1 位作者 Chun Hu Lizhong Liu 《Journal of Environmental Sciences》 SCIE EI CAS CSCD 2018年第7期192-204,共13页
Bacterial community structure and iron corrosion were investigated for simulated drinking water distribution systems(DWDSs) composed of annular reactors incorporating three different treatments: ozone, biologically... Bacterial community structure and iron corrosion were investigated for simulated drinking water distribution systems(DWDSs) composed of annular reactors incorporating three different treatments: ozone, biologically activated carbon and chlorination(O3-BAC-Cl2);ozone and chlorination(O3-Cl2); or chlorination alone(Cl2). The lowest corrosion rate and iron release, along with more Fe3O4 formation, occurred in DWDSs with O3-BAC-Cl2 compared to those without a BAC filter. It was verified that O3-BAC influenced the bacterial community greatly to promote the relative advantage of nitrate-reducing bacteria(NRB)in DWDSs. Moreover, the advantaged NRB induced active Fe(III) reduction coupled to Fe(II) oxidation, enhancing Fe3O4 formation and inhibiting corrosion. In addition, O3-BAC pretreatment could reduce high-molecular-weight fractions of dissolved organic carbon effectively to promote iron particle aggregation and inhibit further iron release. Our findings indicated that the O3-BAC treatment, besides removing organic pollutants in water, was also a good approach for controlling cast iron corrosion and iron release in DWDSs. 展开更多
关键词 bacterial community Nitrate-reducing bacteria(NRB) O3-biological activated carbon(O3-bac Drinking water distribution systems (DWDSs) Corrosion inhibition Iron release
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北方低浊微污染原水O_(3)-BAC深度处理效能及机制
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作者 权晨妍 郭媛 +3 位作者 张昭赫 李家科 刘珊珊 时文歆 《中国给水排水》 北大核心 2025年第23期55-63,共9页
为了探究臭氧-生物活性炭(O_(3)-BAC)深度处理工艺对北方低浊微污染原水的净化效能及其作用机制,选取我国北方某座同步运行常规工艺与O_(3)-BAC深度处理工艺的给水厂作为研究对象,考察了两种工艺在冬季低温、长期低浊和有机微污染的同... 为了探究臭氧-生物活性炭(O_(3)-BAC)深度处理工艺对北方低浊微污染原水的净化效能及其作用机制,选取我国北方某座同步运行常规工艺与O_(3)-BAC深度处理工艺的给水厂作为研究对象,考察了两种工艺在冬季低温、长期低浊和有机微污染的同一水源条件下的净水效果和污染物削减规律,同时分析了细菌群落结构及其变化特征与生物风险。结果表明,O_(3)-BAC深度处理工艺适用于处理我国北方低浊微污染原水,但实际运行效果易受季节更替的影响;在O_(3)-BAC与常规工艺协同作用下,可构建多级屏障以强化对污染物的去除,其中炭滤和砂滤填料上所附着的生物膜在降解有机微污染物中发挥了重要作用,例如Saprospiracea和Blastocatella菌属。 展开更多
关键词 饮用水处理 臭氧-生物活性炭 低浊原水 功能细菌 生物风险
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深海嗜压菌水通道蛋白AqpSS9在Bac-to-Bac家蚕杆状病毒系统中表达 被引量:2
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作者 陈旭 陈健 +4 位作者 黄磊 蔡谨 吕正兵 张耀洲 徐志南 《药物生物技术》 CAS CSCD 2011年第4期283-287,共5页
利用家蚕杆状病毒表达系统合成深海嗜压菌Photobacterium profundum SS9的新型水通道蛋白AqpSS9。首先通过家蚕核型多角体病毒BmNPV的Bac-to-Bac系统构建重组转移载体pFasBac HTB-AqpSS9,将其转化到含穿梭载体Bm-Bacmid的大肠杆菌Bm-DH1... 利用家蚕杆状病毒表达系统合成深海嗜压菌Photobacterium profundum SS9的新型水通道蛋白AqpSS9。首先通过家蚕核型多角体病毒BmNPV的Bac-to-Bac系统构建重组转移载体pFasBac HTB-AqpSS9,将其转化到含穿梭载体Bm-Bacmid的大肠杆菌Bm-DH10Bac中进行转座作用,白斑筛选得到重组穿梭载体Bacmid-AqpSS9。用脂质体介导将Bacmid-AqpSS9转染家蚕BmN细胞,在细胞内包装形成重组的BmNPV病毒rBm AqpSS9。利用SDS-PAGE及Western blot检测重组蛋白AqpSS9在家蚕培养细胞中的表达,结果显示目标蛋白被成功表达。该实验为新型水通道蛋白AqpSS9的进一步应用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 水通道蛋白AqpSS9 bac-to—bac/BMNPV系统 表达 Photobacterium profundum SS9
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高覆盖率水稻BAC库的构建及抗病基因相关克隆的筛选 被引量:25
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作者 王文明 江光怀 +2 位作者 王世全 朱立煌 翟文学 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第2期102-128,共27页
利用含Xa4、xa5和xa13 3个水稻白叶枯病抗性基因的累加系IRBB56构建了一个水稻细菌人工染色体文库。该文库包含55 296个克隆,平均插入片段为132kb。按水稻基因组为450Mb计,该文库覆盖14倍基因组,筛选出任一水稻基因或序列的概率为99.... 利用含Xa4、xa5和xa13 3个水稻白叶枯病抗性基因的累加系IRBB56构建了一个水稻细菌人工染色体文库。该文库包含55 296个克隆,平均插入片段为132kb。按水稻基因组为450Mb计,该文库覆盖14倍基因组,筛选出任一水稻基因或序列的概率为99.99%。用均匀分布的3个叶绿体基因和4个线粒体基因克隆作探针筛选文库,结果显示该文库中含细胞器基因组DNA同源序列的克隆数小于1%。用分布于水稻3条不同染色体、分别与Xa4、xa5和xa13连锁的DNA标记筛选文库,分别检测出11~106个阳性克隆,为克隆这些基因打下了基础。 该文库对水稻基因组的高度覆盖率和较大的插入片段,非常适合于物理作图和基因的分离和克隆。 展开更多
关键词 细菌人工染色体(bac)文库 基因组 克隆 抗病 水稻 抗病基因
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O_3/BAC工艺应用于城市污水深度处理 被引量:15
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作者 蒋以元 杨敏 +3 位作者 张昱 邓荣森 周军 広辻淳二 《中国给水排水》 CAS CSCD 北大核心 2004年第7期92-95,共4页
 为使再生水适合不同用途,对经过混凝沉淀和砂滤处理的再生水进行了臭氧—生物活性炭的深度处理。在臭氧消耗量和反应时间分别为5mg/L和10min,BAC空床停留时间(EBCT)为10min的条件下,臭氧—生物活性炭工艺对CODMn、DOC、UV254和色度平...  为使再生水适合不同用途,对经过混凝沉淀和砂滤处理的再生水进行了臭氧—生物活性炭的深度处理。在臭氧消耗量和反应时间分别为5mg/L和10min,BAC空床停留时间(EBCT)为10min的条件下,臭氧—生物活性炭工艺对CODMn、DOC、UV254和色度平均去除率为32.4%、29.2%、48.6%和80.1%,出水CODMn、DOC、UV254和色度的平均值分别为3.3mg/L、4.0mg/L、0.05cm-1和2.0倍;臭氧生物活性炭工艺出水SDI<4,从而满足了反渗透系统的进水要求。 展开更多
关键词 城市污水 深度处理 再生回用 臭氧氧化 bac SDI
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带BAC质粒的重组伪狂犬病毒的构建及其体外生长特性研究 被引量:16
15
作者 彭金美 王瑜 +4 位作者 田志军 周艳君 陈瑾 安同庆 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期10-15,共6页
本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载... 本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII。将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC。通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度。重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传。本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 Bartha K61株 bac 重组病毒
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关于细菌人工染色体(BAC)文库载体DNA制备的研究 被引量:9
16
作者 姜涛 刘越 +1 位作者 孔秀英 贾继增 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第12期1126-1131,共6页
细菌人工染色体 (BAC)文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAC文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备。制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切、脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料 ,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷... 细菌人工染色体 (BAC)文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAC文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备。制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切、脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料 ,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷 ,并结合凝胶回收纯化技术 ,制备了可用于进一步构建BAC文库的线性载体DNA。并在此基础上 ,确定了制备BAC载体DNA的适宜条件 ,其中包括确定适宜限制内切酶用量及酶切时间 ,脱磷酶种类及浓度和凝胶回收纯化线性载体DNA等关键步骤。 展开更多
关键词 细菌人工染色体 bac 文库 载体DNA 制备 酶切 脱磷 凝胶回收纯化
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琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选 被引量:9
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作者 潘腾飞 潘东明 +2 位作者 姜翠翠 陈桂信 郭志雄 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第18期3791-3797,共7页
【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果... 【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。 展开更多
关键词 琯溪蜜柚 bac文库 粒化 文库筛选
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用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达人生长激素 被引量:10
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作者 耿朝晖 郜鹏 +4 位作者 刘莹 赵东明 张宝珠 俞新大 李建民 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期59-63,共5页
利用Bac to Bac杆状病毒载体表达系统将人生长激素 (humangrowthhormone ,hGH)基因cDNA克隆至转移载体pFastBac1中 ,得到pFastBac hGH ,再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中 ,发生转座作用 ,得到含hGH基因的重组穿梭载体rB... 利用Bac to Bac杆状病毒载体表达系统将人生长激素 (humangrowthhormone ,hGH)基因cDNA克隆至转移载体pFastBac1中 ,得到pFastBac hGH ,再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中 ,发生转座作用 ,得到含hGH基因的重组穿梭载体rBacmid hGH .纯化DNA ,直接转染培养的昆虫细胞Sf9,得到重组病毒rAcV Bac hGH .经酶切PCR及Southern杂交鉴定 ,hGH基因正确地插入病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下 ,SDS PAGE测得产物蛋白分子量为 2 2kD左右 .用免疫化学发光法测得转染上清中hGH表达水平可达 18μg ml ,与用传统的BEVS表达hGH相比 ,转染上清中hGH表达水平提高 4 0 展开更多
关键词 bac-TO-bac系统 昆虫细胞 HGH 基因表达 杆状病毒 生长激素
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狂犬病病毒核蛋白在Bac-To-Bac/AcMNPV杆状病毒系统的表达 被引量:6
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作者 尹伟 徐洁萍 +2 位作者 张金阳 颜焰 周继勇 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期86-89,115,共5页
为真核表达狂犬病病毒的核蛋白,本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因,将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中,构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-NP;通过转染昆虫细胞sf9包装重... 为真核表达狂犬病病毒的核蛋白,本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因,将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中,构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-NP;通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。SDS-PAGE、western blot和间接免疫荧光对表达的蛋白进行鉴定和反应原性分析。分别以重组杆状病毒表达的核蛋白、原核表达核蛋白为包被抗原进行ELISA检测。结果表明,在昆虫细胞中表达的狂犬病病毒重组核蛋白能与鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清特异性结合,其相对分子量约为50.5ku。以重组杆状病毒表达的核蛋白为抗原建立的rNP-ELISA的敏感性、特异性、符合率分别为86.36%,89.83%,90.00%,优于大肠杆菌表达的RV核蛋白。说明杆状病毒系统表达的核蛋白是建立RV核蛋白ELISA抗体检测方法的理想抗原。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 核蛋白基因 bac—To—bac/AcMNPV杆状病毒表达系统.
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奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析 被引量:5
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作者 赵圣国 王加启 +3 位作者 卜登攀 刘开朗 朱雅新 周凌云 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期1015-1021,共7页
【目的】从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选含乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因的克隆子,并对其全长测序和生物信息学分析。【方法】利用PCR序列驱动筛选法,从瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因,鸟枪法测定基因序列后,进行基因注释、比对和系统... 【目的】从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选含乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因的克隆子,并对其全长测序和生物信息学分析。【方法】利用PCR序列驱动筛选法,从瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因,鸟枪法测定基因序列后,进行基因注释、比对和系统发育分析。【结果】筛选得到了含ACCase基因的克隆(U12),其插入片段序列(URE12)全长43 358 bp,GC含量为43.75%,经GeneMark程序预测含有38个基因,经Signature程序预测属于变形菌门。ACCase基因(Acc-32)编码159个氨基酸,与Elusimicrobium minutum的ACCase基因具有41%的相似度,编码蛋白分子量为17.89 kD,等电点为5.27,在距离Acc-32上游的33 kb区域,发现一段能编码ACCase连接酶的基因。Acc-32的结合位点氨基酸残基为GQVICVIEAMKVFNELKA,系统发育分析表明Acc-32属于ε-变形菌纲。【结论】得到了含有ACCase基因的序列片段,并且ACCase基因具有新的结构特征。 展开更多
关键词 瘤胃微生物 bac文库 乙酰CoA羧化酶 基因注释 生物信息学
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