基于非洲猪瘟病毒B646 L和I177L基因双重实时荧光定量PCR鉴别ASFV-G-ΔI177 L疫苗株的检测方法

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作者 郭瑞 韩小改 +2 位作者 娄亚坤 杨楠 任宝红 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第12期52-57,共6页

为建立一种可鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株与ASFV-G-ΔI177L(I177L基因缺失株)疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法,本试验针对非洲猪瘟病毒B646L与I177L两种基因保守性高的区域,分别设计了引物和探针,通过引物、探针最佳工作浓度筛选和... 为建立一种可鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株与ASFV-G-ΔI177L(I177L基因缺失株)疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法,本试验针对非洲猪瘟病毒B646L与I177L两种基因保守性高的区域,分别设计了引物和探针,通过引物、探针最佳工作浓度筛选和退火温度优化,建立了一种双重实时荧光定量PCR核酸检测方法,并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果显示,该检测方法建立的标准曲线线性关系良好,R2均>0.99;对pUC57-B646L和pUC57-I177L质粒标准品最低检出限均为10 copies/μL;与其他常见猪病病原无交叉反应,特异性强;批内变异系数为0.11%~1.39%,批间变异系数为0.21%~0.96%,均小于1.4%,重复性和稳定性良好。结果表明,本试验成功建立了一种性能良好的非洲猪瘟病毒B646L与I177L基因双重实时荧光定量PCR核酸检测方法,可为临床上非洲猪瘟病毒野毒株和ASFV-G-ΔI177L疫苗株的检测和鉴别提供技术支撑。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) b646L基因 I177L基因 双重实时荧光定量PCR

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非洲猪瘟病毒B646L和F778R双基因PCR检测方法的构建 被引量：3

2

作者 王慧 钟菊花 +3 位作者 杨俊 杜丽飞 王红兵 刘俊琦 《激光生物学报》 CAS 2023年第6期554-560,共7页

为建立一种能够快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的普通PCR方法,本研究分别以ASFV B646L和F778R基因为靶序列设计了两对特异性引物,建立ASFV B646L和F778R双基因普通PCR方法,并对其特异性、灵敏性及重复性进行检测。结果显示:该PCR体系(25.0... 为建立一种能够快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的普通PCR方法,本研究分别以ASFV B646L和F778R基因为靶序列设计了两对特异性引物,建立ASFV B646L和F778R双基因普通PCR方法,并对其特异性、灵敏性及重复性进行检测。结果显示:该PCR体系(25.0μL体系)的最优组合为Pfu酶0.2μL、10×Reaction Buffer 2.5μL、2.5 mmol/L d NTP Mixture 2.5μL、B646L上下游引物各1.5μL、F778R上下游引物各0.5μL、DNA模板1.0μL;退火温度为57℃、退火时间为30 s、72℃延伸2.5 min,30个循环。该方法仅针对ASFV B646L和F778R基因进行特异性扩增,无交叉反应。同时对B646L和F778R阳性质粒的最低检测下限分别为7.2×10^(7)copies/μL、1.5×10^(6)copies/μL,试验重复性良好。本研究对于提高ASFV临床诊断的准确性、特异性和高效性具有重要价值,为其快速检测提供了可靠的技术支撑。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 多重PCR b646L基因 F778R基因 快速检测

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非洲猪瘟病毒B646L基因序列分析及p72蛋白质结构与细胞抗原表位预测 被引量：3

3

作者 罗世民 李中波 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第16期141-146,共6页

为探究非洲猪瘟病毒B646L基因序列的碱基组成特点,及预测该基因所编码的p72蛋白质结构与细胞抗原表位,利用PCR技术对非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框的序列进行扩增、测序及碱基组成分析;运用软件EXPASY、PRABI与SWISS-MODEL对p72蛋白质进... 为探究非洲猪瘟病毒B646L基因序列的碱基组成特点,及预测该基因所编码的p72蛋白质结构与细胞抗原表位,利用PCR技术对非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框的序列进行扩增、测序及碱基组成分析;运用软件EXPASY、PRABI与SWISS-MODEL对p72蛋白质进行理化性质分析及二、三级结构预测;运用在线软件ABCpred Prediction、Scratch、IEDB和NetCTL对p72蛋白在B、T细胞的抗原表位进行预测。结果表明,非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框序列全长为1941 bp,其中,碱基A含量为26.9%,T含量为28.9%,G含量为24.2%及C含量为20.0%,A+T的含量为55.8%,G+C的含量为44.2%,AT含量显著高于GC含量;该序列共编码646个氨基酸,p72蛋白大小为76 ku;在整个p72蛋白分子的二、三级结构中,α-螺旋占19.35%,β-转角占5.42%,无规卷曲占50.15%,扩展链为25.08%,以无规卷曲为主要结构;该蛋白存在细胞质的概率最大,其次是细胞核,存在于线粒体、高尔基体和内质网的概率较低;p72蛋白B淋巴细胞优势抗原表位分别为12~18 aa、27~37 aa、45~55 aa、77~88 aa、110~120 aa;T淋巴细胞优势抗原表位分别为203~212 aa、298~307 aa、520~531 aa。说明非洲猪瘟病毒B646L基因ORF框序列呈明显AT偏好性;p72蛋白为一亲水性蛋白,其高级结构主要以无规卷曲为主,且具有B、T淋巴细胞优势抗原表位,是检测试剂和疫苗研发的理想靶标。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 b646L基因 p72蛋白 序列分析 结构预测 抗原表位预测

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越南北部6省2020年~2021年非洲猪瘟病毒的遗传演化分析

4

作者 阮氏璧凤 李标 +4 位作者 袁海峰 胡庭俊 邓武黄 长英德 韦英益 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期452-457,479,共7页

非洲猪瘟病毒(ASFV)自2019年在越南被发现以来,迅速在越南全国范围内传播。为了解ASFV在越南北部的流行及其流行株的遗传变异情况,本研究采集越南北部6省的250份疑似ASFV感染病死猪的组织病料样品,采用荧光定量PCR(qPCR)方法检测ASFV,... 非洲猪瘟病毒(ASFV)自2019年在越南被发现以来,迅速在越南全国范围内传播。为了解ASFV在越南北部的流行及其流行株的遗传变异情况,本研究采集越南北部6省的250份疑似ASFV感染病死猪的组织病料样品,采用荧光定量PCR(qPCR)方法检测ASFV,进一步采用PCR扩增ASFV阳性组织样品中的B646L(p72)基因、EP402R(CD2v)基因和I73R~I329L基因的IGR区域,并测序后采用DNAStar 7.0的MegAlign软件比对分析上述3种基因序列的同源性;每个省均选取10份阳性样品的B646L基因和EP402R基因序列分别构建系统进化树,并对I73R~I329L基因的IGR区进行核苷酸差异分析。结果显示,250份组织样品均为ASFV阳性,本研究获得的所有B646L基因和EP402R基因之间的同源性均达100%,与GenBank中ASFV相应基因序列的同源性分别为95.1%~100%、66.9%~99.7%,其中B646L基因与中国ASFV分离株相应基因序列的同源性最高,与2012年乌干达ASFV分离株该基因序列的同源性最低,而与EP402R基因序列的同源性最高的是格鲁吉亚、俄罗斯ASFV分离株,同源性最低的是葡萄牙ASFV分离株。基于B646L和EP402R基因构建的遗传进化树结果均显示,本研究获得的上述基因均与中国、格鲁吉亚ASFV分离株相应基因的亲缘性更近,属于基因型II,血清型SG8。对IGR区的I73R~I329L基因进行核苷酸差异分析结果显示,在2020年采集的ASFV阳性样品属于ASFV的IGR II型变异体,至少有IGR I和IGR II型2种ASFV在越南传播。本研究揭示了越南早期ASFV的变化,对预防ASFV的传播具有重要的参考意义。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 b646L基因 EP402R基因 I73R~I329L基因

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非洲猪瘟病毒遗传多样性分析研究进展 被引量：1

5

作者 金贵兵 杨丁 +4 位作者 金仕强 邹仲航 牟燕平 古从伟 杨倩 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第7期97-101,共5页

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病,严重危害全球养猪业。ASFV基因分型可以从分子水平追溯疫情病毒的来源,掌握和切断潜在的传播途径,有助于ASF的预防和控制。目前,ASFV的遗传分型主要通过表... 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病,严重危害全球养猪业。ASFV基因分型可以从分子水平追溯疫情病毒的来源,掌握和切断潜在的传播途径,有助于ASF的预防和控制。目前,ASFV的遗传分型主要通过表征编码p72衣壳蛋白的B646L基因来实现,随后再通过几个特定的遗传标志基因对B646L基因型相同的ASFV进行进一步细分,包括编码p54包膜蛋白的E183L基因、编码毒力因子的I73R/I329L基因、与致病性相关的多基因家族MGF5059R/10R基因和编码p72蛋白分子伴侣的B602L基因等。这些基因分型方式对于追溯病毒起源,快速区分密切相关的毒株具有重要意义。本文就几类主要的ASFV基因分型方法进行简单概述,以期为我国ASFV诊断技术和遗传演变研究提供参考。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 b646L E183L I73R/I329L MGF5059R/10R B602L

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非洲猪瘟病毒MGF-505R基因缺失株双重荧光RPA检测方法的建立及应用 被引量：6

6

作者 邓俊花 吕继洲 +4 位作者 陈冬杰 袁向芬 魏方 赵文军 吴绍强 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第12期85-90,共6页

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法,以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势,选择MGF-505R基因及B646L基因,设计特异性引物及exo探针,对其进行敏感性、特异性分析,并进行临床应用。利用双... 旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法,以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势,选择MGF-505R基因及B646L基因,设计特异性引物及exo探针,对其进行敏感性、特异性分析,并进行临床应用。利用双重-重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测ASFV MGF-505R及B646L基因,结果显示:检测时间在15 min内,最低检测限均为10 copies/反应,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;利用所建立方法对266份临床样品进行检测,结果与世界动物卫生组织(WOAH)推荐荧光PCR检测方法的符合率为100%。建立的ASFV MGF-505R基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式荧光RPA检测仪,具有快速、灵敏度高、特异性强的优点,适用于ASFV现场快速临床检测,为非洲猪瘟疫情防控提供一种新的筛查手段。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 MGF-505R基因 b646L基因 双重荧光RPA 应用

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非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株三重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用 被引量：4

7

作者 郭振华 邢广旭 +3 位作者 翁茂洋 金前跃 乔松林 张改平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期619-625,共7页

针对非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v基因分别设计了引物和探针,经过条件优化,建立了基于TaqMan探针技术的三重荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法与猪场常见病毒的核酸不发生交叉反应,具有良好的... 针对非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v基因分别设计了引物和探针,经过条件优化,建立了基于TaqMan探针技术的三重荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法与猪场常见病毒的核酸不发生交叉反应,具有良好的特异性;敏感性分析显示,针对B646L、MGF505-2R和CD2v基因的最低检测下限分别为6.5,8.0和14.0 copies/μL;并且该方法在10~10copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,组间变异系数为0.05%~2.68%,组内变异系数为0.10%~1.17%,稳定性良好。进一步针对临床核酸样品的检测显示,本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的荧光定量PCR鉴别检测方法,为临床非洲猪瘟病毒的监测诊断提供了良好的技术支撑。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 荧光定量PCR b646L基因 MGF505-2R基因 CD2v基因

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非洲猪瘟病毒微芯片荧光PCR快速检测技术的建立及初步应用 被引量：2

8

作者 刘洋 王新杰 +6 位作者 汪葆玥 李翔 高姗姗 马静 孙晓明 王传彬 倪建强 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期8-12,共5页

非洲猪瘟缺乏安全有效的疫苗,其防控有赖于及时、准确的诊断和消毒灭源。本研究在对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L基因序列进行分析的基础上设计引物、探针,建立了基于微芯片的ASFV免提取荧光PCR检测技术。特异性... 非洲猪瘟缺乏安全有效的疫苗,其防控有赖于及时、准确的诊断和消毒灭源。本研究在对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L基因序列进行分析的基础上设计引物、探针,建立了基于微芯片的ASFV免提取荧光PCR检测技术。特异性试验结果显示,微芯片PCR可用于我国不同地区ASFV毒株的通用检测,对其他主要猪源病毒均为阴性;敏感性试验结果显示其检测下限为10拷贝/μL;对117份临床样品的检测结果显示,该方法可用于猪全血、淋巴结、脾脏、肌肉样本中ASFV核酸的检测,与世界动物卫生组织推荐的荧光PCR检测方法相符率达100%,且显著简化了检测操作步骤,检测用时缩短在30 min之内,获得农业农村部第一批非洲猪瘟现场快速检测试剂的推荐,应用于养殖场、屠宰场和流通环节中ASFV核酸的检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 微芯片 荧光PCR方法 b646L基因

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非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1

9

作者 余斌 徐丽华 +3 位作者 李军星 苏菲 叶十一 袁秀芳 《浙江农业科学》 2023年第4期964-967,共4页

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法,验证其特异性、灵敏性和重... 为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法,验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示:本研究所建立的检测方法特异性强,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;灵敏度高,能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好,组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑,为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 荧光定量PCR b646L 检测

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非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：2

10

作者 曹云雷 高飞 +5 位作者 李国新 姜一峰 郑浩 童武 黄剑 童光志 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第6期141-146,共6页

本研究旨在用原核生物表达系统来表达非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因。获得其编码的p72重组蛋白,并针对纯化的p72重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV B646L全长基因连入pcold-Ⅰ表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导1... 本研究旨在用原核生物表达系统来表达非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L基因。获得其编码的p72重组蛋白,并针对纯化的p72重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV B646L全长基因连入pcold-Ⅰ表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导16 h后,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。然后用纯化的p72重组蛋白为免疫原制备鼠源抗p72多克隆抗体,经过4次免疫后获得p72蛋白的多克隆抗体,随后采取血清来检测多克隆抗体。结果显示,利用p72蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步对ASFV B646L基因建立快速、特异的血清学诊断技术奠定基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 b646L基因 p72蛋白 多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒可视化重组酶辅助扩增检测方法的建立与初步应用 被引量：5

11

作者 岳怀宁 李艳蕊 +6 位作者 张亚楠 苏恺 袁晨 逯纪成 孙泰然 薛文阁 宋勤叶 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第5期19-25,共7页

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)重组酶辅助扩增(RAA)与核酸检测试纸条相结合的可视化RAA检测方法,本试验根据ASFV的B646L基因(编码p72蛋白)保守区设计特异性的引物和探针,通过优化引物和探针浓度、反应温度和反应时间,确定反应的最佳体系... 为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)重组酶辅助扩增(RAA)与核酸检测试纸条相结合的可视化RAA检测方法,本试验根据ASFV的B646L基因(编码p72蛋白)保守区设计特异性的引物和探针,通过优化引物和探针浓度、反应温度和反应时间,确定反应的最佳体系和扩增条件;检测建立的可视化RAA方法的特异性和灵敏性,分析建立方法与非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒对临床样品检测结果的符合率。结果显示,建立的可视化RAA方法的反应体系为25μL,在38℃恒温条件下反应20 min即可在5 min内读取结果;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等均不发生交叉反应;单个反应可检测到48.75拷贝的病毒核酸。初步临床应用结果显示,建立的可视化RAA方法与商品化的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒检测结果一致,其阴性和阳性符合率均为100%。本试验成功建立的基于ASFV B646L基因的可视化恒温扩增方法具有反应时间短、特异性和灵敏度高、操作便捷等优势,适合现场快速检测和诊断,具有进一步开发潜力。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 b646L基因 重组酶辅助扩增技术 可视化 核酸检测试纸条

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非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型的双重实时荧光定量PCR检测方法建立 被引量：3

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作者 常昊 邱英武 +10 位作者 彭杰 高琦 宋泽布 陈洋 李薇 林丽苗 曹雪珍 周庆丰 张桂红 李群辉 郑泽中 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4428-4432,共5页

随着基因Ⅰ型非洲猪瘟(GenotypeⅠASFV)在我国开始流行,使我国对ASF的诊断、预防和控制更具挑战性。本研究使用中国动物疾病预防控制中心(CADC)推荐使用的B646L引物与探针,结合针对GenotypeⅠASFV EP402R基因保守特异性区域设计引物与探... 随着基因Ⅰ型非洲猪瘟(GenotypeⅠASFV)在我国开始流行,使我国对ASF的诊断、预防和控制更具挑战性。本研究使用中国动物疾病预防控制中心(CADC)推荐使用的B646L引物与探针,结合针对GenotypeⅠASFV EP402R基因保守特异性区域设计引物与探针,建立了一种在诊断ASF的同时可对ASFV进行GenotypeⅠASFV鉴别的快速检测方法,并对其灵敏性、特异性进行检测。结果显示,该方法具有良好的灵敏性以及特异性,可有效用于ASFV的临床诊断以及GenotypeⅠASFV的监测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 基因Ⅰ型ASFV 实时荧光定量PCR EP402R b646 L

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鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的三重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4

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作者 宋影影 刘英楠 +6 位作者 刘建奇 谢振华 于婉琪 吕璐 钟秋萍 宋庆庆 陈鸿军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期939-945,共7页

为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L、EP402R、MGF360-13L基因序列,分别设计PCR引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,并进行重复性试验、特异性试验、敏感性试验... 为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L、EP402R、MGF360-13L基因序列,分别设计PCR引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,并进行重复性试验、特异性试验、敏感性试验与临床样品检测,建立三重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示,以B646L、EP402R和MGF360-13L重组质粒为标准品绘制的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数(R^(2))分别为0.995、0.997和0.997;建立的方法与多种猪常见病原不存在交叉反应,特异性良好;对B646L、MGF 360-13L与EP402R基因的检测下限均为10^(2.5) copies/μL,变异系数均<2%,该方法灵敏度高;当临床样品稀释至10^(-5)时,即滴度为10^(2.5)TCID_(50)/mL时仍能检测到病毒粒子,具有较高的临床使用价值。本研究建立了一种高效、灵敏、特异的ASFV分子检测方法,对ASF风险预警具有重要意义。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 b646L EP402R MGF360-13L TAQMAN探针 荧光定量PCR

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非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增方法的建立 被引量：2

14

作者 王宏燕 杨作丰 +4 位作者 李秀梅 杨利敏 边际 董娜 张立国 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第2期27-30,F0002,共5页

本文采用实时荧光环介导等温扩增方法建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的方法。根据GenBank中公布的非洲猪瘟病毒编码主要衣壳蛋白p72的B 646 L基因序列,针对其6个保守区段设计3对引物和1条环介导等温扩增(LAMP)TaqMan探针,对其特异... 本文采用实时荧光环介导等温扩增方法建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的方法。根据GenBank中公布的非洲猪瘟病毒编码主要衣壳蛋白p72的B 646 L基因序列,针对其6个保守区段设计3对引物和1条环介导等温扩增(LAMP)TaqMan探针,对其特异性、灵敏性进行评估,进行临床样本检测试验,并与OIE推荐的实时荧光定量PCR检测结果进行比较分析。结果显示,该检测方法能够特异性地检出ASFV的存在,具有良好的特异性;灵敏度达到1 pg/μL。本方法的特异性、灵敏性及临床样品检测结果与OIE推荐的实时荧光定量PCR检测结果高度一致。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 b646L基因 实时荧光环介导等温扩增

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非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立 被引量：1

15

作者 施科达 徐民生 +8 位作者 李艳 张昆丽 翟少伦 勾红潮 宋帅 杨冬霞 臧莹安 孙铭飞 李春玲 《中国农学通报》 2023年第11期143-151,共9页

试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-... 试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针,并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件,确立LNA-OSN-PCR标准曲线,并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法,对96份临床疑似患病样品进行检测,同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系,建立的LNA-OSN-PCR标准曲线,具有较好的线性(R2=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^(-1)copies/μL,变异系数小于3%,并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较,检测灵敏度提高10~100倍,在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中,检出55份阳性,41份阴性,比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率。并且能获得典型的扩增曲线。试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰,建立了ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR,为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 b646L(P72)蛋白基因 锁核酸修饰 一步法巢式荧光定量PCR

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