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光敏蛋白G-Avitag融合蛋白介导生物素对山羊IgG特异性位点偶联标记研究
1
作者 杜悦 张玉敏 +3 位作者 马兰 李梦冉 杨洪鸣 唐金宝 《中国免疫学杂志》 北大核心 2025年第7期1777-1781,共5页
目的:构建蛋白G C3结构域与Avitag标签肽的3个光敏融合蛋白,介导生物素对山羊IgG特异性位点偶联标记。方法:化学合成含琥珀密码子的蛋白G C3结构域与1个、2个及3个Avitag标签肽的DNA序列,亚克隆至pTXB1质粒构建3个融合蛋白表达载体,分别... 目的:构建蛋白G C3结构域与Avitag标签肽的3个光敏融合蛋白,介导生物素对山羊IgG特异性位点偶联标记。方法:化学合成含琥珀密码子的蛋白G C3结构域与1个、2个及3个Avitag标签肽的DNA序列,亚克隆至pTXB1质粒构建3个融合蛋白表达载体,分别与pEVOL-pBpF质粒共转化至感受态菌E.coli BL21,利用遗传密码子扩展技术制备光敏C^(Bpa)-Avi‐tag、C^(Bpa)-(Avitag)_(2)及C^(Bpa)-(Avitag)_(3)融合蛋白,目的蛋白经金属亲和层析纯化、Avitag/BirA酶体系生物素化后,通过SDS-PAGE电泳、对照实验及竞争ELISA考察其与山羊IgG的共价偶联效率、偶联位点及偶联物抗原结合特性。结果:成功构建3个表达载体并表达设计的3个目的光敏融合蛋白,C^(Bpa)-Avitag、C^(Bpa)-(Avitag)_(2)、C^(Bpa)-(Avitag)_(3),分子量与理论值相符,生物素化融合蛋白C^(Bpa)-Bn与山羊IgG重链偶联效率为85%,且特异性偶联抗体Fc位点;偶联后抗体保持了其抗原结合活性。结论:成功构建了C^(Bpa)-Avitag、C^(Bpa)-(Avitag)_(2)及C^(Bpa)-(Avitag)3融合蛋白,实现了生物素对山羊IgG的Fc位点偶联标记。 展开更多
关键词 蛋白G 山羊IgG 可生物素化标签肽 光亲和标记
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特异性位点生物素化蛋白的制备
2
作者 张璐 李清雅 徐江浩 《江苏医药》 CAS 2019年第5期440-443,共4页
目的探讨特异性位点生物素化蛋白的制备技术。方法采用分子克隆法,将编码Avi标签(AviTag)的基因序列插入真核表达载体,构建表达AviTag的gp120重组质粒,使融合蛋白羧基段带AviTag。采用生物素蛋白连接酶将活化生物素连接到融合蛋白的Avi... 目的探讨特异性位点生物素化蛋白的制备技术。方法采用分子克隆法,将编码Avi标签(AviTag)的基因序列插入真核表达载体,构建表达AviTag的gp120重组质粒,使融合蛋白羧基段带AviTag。采用生物素蛋白连接酶将活化生物素连接到融合蛋白的AviTag多肽位点,采用酶切、Western blot和ELISA等方法分析制备是否成功。结果酶切和Western blot证实gp120-AviTag表达载体构建和表达成功。ELISA结果显示生物素成功标记于融合蛋白的AviTag多肽位点。结论将AviTag引入表达载体可成功制备特异性位点生物素化蛋白,为生发中心抗原特异性B细胞反应的研究提供技术支持。 展开更多
关键词 生物素化蛋白 Avi标签
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