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Apoptin引起肿瘤细胞G_2-M阻滞 被引量：4
1
作者 何湘君 尚世彤 +2 位作者 刘玉京 张旗 王申五 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期263-267,共5页
目的 :研究凋亡素 (apoptin)特异诱导肿瘤细胞凋亡的作用 ,探讨其用于肿瘤治疗的可能性。方法 :用PCR技术克隆了apoptin基因 ,将其插入预先装有FLAG标签的真核表达质粒pcDNA3.1中 ,并构建了带有apoptin基因的腺病毒载体 ,观察转染pcDNA3... 目的 :研究凋亡素 (apoptin)特异诱导肿瘤细胞凋亡的作用 ,探讨其用于肿瘤治疗的可能性。方法 :用PCR技术克隆了apoptin基因 ,将其插入预先装有FLAG标签的真核表达质粒pcDNA3.1中 ,并构建了带有apoptin基因的腺病毒载体 ,观察转染pcDNA3.1/FLAG/apoptin和 /或Ad/apoptin重组腺病毒感染后apoptin在几种细胞中的表达及细胞形态的改变 ,用流式细胞术分析PI染色后Ad/apoptin感染细胞的DNA含量变化。结果 :apoptin在Hela、Bcap37、A5 4 9、HepG2、SKOV3等肿瘤细胞核中表达 ,apoptin重组腺病毒感染后细胞核染色质呈颗粒状 ,最后凝聚成不规则大块并出现核固缩。正向和反向插入apoptin的重组腺病毒均引起G2 M细胞增多 ,但前者引起G2 M阻滞更为显著 ,需要的感染复数 (MOI)也较低。结论 :apoptin可引起肿瘤细胞周期G2 M阻滞和染色质凝聚。 展开更多
关键词 apoptin 肿瘤细胞 G2-M阻滞 染色质 鸡贫血病毒 凋亡素
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Apoptin基因对人胃癌细胞BGC-823的抑制效应及与凋亡信号转导的关系 被引量：4
2
作者 李霄 金宁一 +3 位作者 连海 陈立刚 孙丽丽 李萍 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2006年第31期2991-2996,共6页
目的:探讨Apoptin基因对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用及其参与胞内细胞信号转导的机制.方法:应用脂质体转染法将重组质粒pVAX1-Apoptin体外转染BGC-823细胞,运用噻唑兰(methylthiazolyltetrazolium,MTT)分析法检测重组质粒对BGC-823肿... 目的:探讨Apoptin基因对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用及其参与胞内细胞信号转导的机制.方法:应用脂质体转染法将重组质粒pVAX1-Apoptin体外转染BGC-823细胞,运用噻唑兰(methylthiazolyltetrazolium,MTT)分析法检测重组质粒对BGC-823肿瘤细胞的抑制作用;通过AO/EB染色法对pVAX1-Apoptin转染的肿瘤细胞进行形态学观察;运用流式细胞术检测细胞线粒体跨膜电位(△Ψm);通过免疫印迹检测细胞色素c(cytochromec,Cytoc)释放;应用底物显色法检测Caspase-3/9活性.结果:pVAX1-Apoptin转染比pVAX1具有更强的抑瘤效应(10μg质粒转染72h后,23.37%vs99.61%,P<0.01),并且肿瘤细胞的死亡方式以凋亡为主.实验结果显示,pVAX1-Apoptin转染导致细胞线粒体跨膜电位下降,与pVAX1转染BGC-823细胞相比有显著差异(46.7%±7.26%vs70.66%±5.98%,P<0.01);同时伴随细胞色素c的释放.另外,pVAX1-Apoptin和pVAX1转染细胞的Caspase-3/9活性具有显著差异(Caspase-9:0.181±0.032vs0.079±0.013,P<0.01;Caspase-3:0.242±0.041vs0.058±0.023,P<0.01).结论:pVAX1-Apoptin转染BGC-823肿瘤细胞导致线粒体跨膜电位下降,并刺激释放细胞色素c,从而激活Caspase-9.经细胞色素c激活的Caspase-9进而活化凋亡通路下游关键作用因子,并对BGC-823肿瘤细胞产生抑制效应. 展开更多
关键词 apoptin基因 胃癌 BGC-823细胞系 细胞凋亡 抗肿瘤效应
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慢病毒介导的融合基因SP-TAT-Apoptin对HepG2细胞的作用 被引量：2
3
作者 韩苏夏 赵晶 +4 位作者 马瑾璐 黄辰 吕毅 欧玮 贾茜 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期310-312,共3页
目的:将已构建的SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体包装成感染性慢病毒颗粒,并用病毒颗粒感染肝癌HepG2细胞,测定其诱导凋亡的效率。方法:通过脂质体Li-pofectamine TM2000将SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体与其他包装质粒共同转... 目的:将已构建的SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体包装成感染性慢病毒颗粒,并用病毒颗粒感染肝癌HepG2细胞,测定其诱导凋亡的效率。方法:通过脂质体Li-pofectamine TM2000将SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体与其他包装质粒共同转导入293FT细胞,包装并收集感染性病毒颗粒,用实时定量PCR法测定病毒滴度,免疫荧光法检测重组慢病毒感染的293FT细胞中SP-TAT-Apoptin融合基因的表达,同时通过流式细胞术(FCM)测定慢病毒感染后HepG2细胞的凋亡率。结果:SP-TAT-Apoptin重组慢病毒感染293FT细胞后,用V5抗原单克隆抗体(mAb)进行免疫荧光化学检测,示SP-TAT-Apoptin融合基因可成功表达于293FT细胞;通过Anexin-VPI法检测示SP-TAT-Apoptin融合基因慢病毒感染肝癌HepG2细胞后可引起细胞凋亡,其凋亡效率明显高于单纯脂质体转染组。结论:成功包装出可表达SP-TAT-Apoptin融合基因且具感染性的慢病毒颗粒,感染HepG2肝癌细胞后可引起其凋亡,为进一步研究融合基因SP-TAT-Apoptin体内治疗效果极其在临床中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 apoptin 融合基因 慢病毒 细胞凋亡
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Apoptin对人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的抑瘤作用研究 被引量：2
4
作者 王亚林 靳风烁 +2 位作者 李彦锋 王洛夫 吴刚 《重庆医学》 CAS CSCD 2008年第9期940-941,I0001,共3页
目的探讨Apoptin质粒对人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的抑瘤作用。方法皮下注射T24细胞,建立裸鼠移植瘤模型,于肿瘤直径0.5cm大小时,多点注射脂质体包裹质粒pApoptin-EGFP,设立空质粒组、生理盐水组作为对照组,观察裸鼠肿瘤生长情况;5周后处死... 目的探讨Apoptin质粒对人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的抑瘤作用。方法皮下注射T24细胞,建立裸鼠移植瘤模型,于肿瘤直径0.5cm大小时,多点注射脂质体包裹质粒pApoptin-EGFP,设立空质粒组、生理盐水组作为对照组,观察裸鼠肿瘤生长情况;5周后处死,绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率,肿瘤组织石蜡包埋,常规切片,TUNEL法检测移植瘤凋亡情况。结果成功建立移植瘤模型,注射脂质体包裹pApoptin-EGFP质粒能明显抑制移植瘤生长;TUNEL检测凋亡率为(23.24±6.12)%,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论Apoptin通过诱导凋亡能明显抑制人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤生长。 展开更多
关键词 apoptin T24 膀胱肿瘤 移植瘤 凋亡
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SP-TAT-Apoptin融合蛋白对HepG2细胞周期的影响 被引量：2
5
作者 韩苏夏 马瑾璐 +2 位作者 吕毅 黄辰 段康民 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期864-866,共3页
目的:研究SP-TAT-Apoptin融合基因诱导人肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞,探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法:通过DNA重组技术,以pcDNA3.1/Apoptin质粒11为模板,构建SP-TAT-Apoptin融合基因plenti6-V5-D-TOPO真核表达载体。用SP-TAT-Ap... 目的:研究SP-TAT-Apoptin融合基因诱导人肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞,探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法:通过DNA重组技术,以pcDNA3.1/Apoptin质粒11为模板,构建SP-TAT-Apoptin融合基因plenti6-V5-D-TOPO真核表达载体。用SP-TAT-Apoptinplenti6-V5-D-TOPO真核表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),转染后Blasticidin霉素进行筛选,并进行鉴定得到稳定表达SP-TAT-Apoptin的CHO细胞株。收集含有TAT-Apoptin融合蛋白的筛选细胞培养上清,用于HepG2细胞培养。于共培养后的不同时段收集HepG2细胞,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期。结果:用包含SP-TAT-Apoptin融合基因的plenti6-V5-D-TOPO真核表达载体瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),成功筛选出稳定表达SP-TAT-Apoptin融合蛋白的CHO细胞,收集细胞培养上清,继续用于HepG2细胞培养,可观察到HepG2细胞阻滞于G1期并引起细胞凋亡。结论:SP-TAT-Apoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞。 展开更多
关键词 信号肽 蛋白转导域 鸡贫血病毒 apoptin蛋白 肝癌
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3种不同survivin基因启动子驱动Apoptin表达的重组慢病毒构建及体外抑瘤效果比较 被引量：2
6
作者 叶枫 钟波 +6 位作者 但国蓉 姜帆 赛燕 赵吉清 孙慧勤 梁后杰 邹仲敏 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期39-43,共5页
目的构建3种不同长度的survivin基因启动子融合6×his标签Apoptin cDNA的重组慢病毒载体,经鉴定后行慢病毒包装并感染人结直肠癌细胞(SW480),体外实验观察并比较抑瘤效果。方法克隆3种不同长度的人survivin基因启动子(160、270、987... 目的构建3种不同长度的survivin基因启动子融合6×his标签Apoptin cDNA的重组慢病毒载体,经鉴定后行慢病毒包装并感染人结直肠癌细胞(SW480),体外实验观察并比较抑瘤效果。方法克隆3种不同长度的人survivin基因启动子(160、270、987 bp)和Apoptin-6×his cDNA,将其分别连接到pMD18-T载体并在该载体上完成survivin基因启动子和Apoptin基因组装。将组装好的表达盒构建入polyA改造后的慢病毒载体FG12中,利用三质粒包装系统包装成慢病毒。为观察重组慢病毒的抑瘤效果,以最适MOI值感染SW480肿瘤细胞后第5天及第30天,利用AnnexinV-PE/7-AAD凋亡试剂盒和流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化,Western blot检测Apoptin-6×his表达。结果成功构建3种重组慢病毒载体,经包装浓缩后获得高滴度病毒,可以有效地感染目的细胞(感染效率大于80%)。体外结果提示病毒感染的SW480可以正确表达Apoptin-6×his蛋白,并能在感染后第30天出现明显的凋亡/坏死。其中,含有270 bp启动子的慢病毒抑瘤作用更为明显。结论采用270 bp survivin启动子,apoptin基因构建的重组慢病毒在靶细胞中显示出较好的抑瘤效果。 展开更多
关键词 apoptin基因 SURVIVIN启动子 慢病毒 肿瘤特异性
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Apoptin特异性诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制 被引量：5
7
作者 王清明 贺福初 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第4期509-512,共4页
Apoptin是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白,能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡,而对正常细胞无凋亡诱导作用。Apoptin的肿瘤细胞特异性与其在细胞中的亚细胞定位有关,在转化或肿瘤细胞中,Apoptin定位于细胞核,而在正常细胞中定位于细胞... Apoptin是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白,能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡,而对正常细胞无凋亡诱导作用。Apoptin的肿瘤细胞特异性与其在细胞中的亚细胞定位有关,在转化或肿瘤细胞中,Apoptin定位于细胞核,而在正常细胞中定位于细胞质。Apoptin的磷酸化决定其核定位,在肿瘤细胞中,Apoptin被磷酸化,磷酸化的Apoptin进入细胞核,并诱导细胞凋亡。Apoptin诱导的细胞凋亡不依赖p53,不为bcl鄄2、bcl鄄xL的过表达所抑制,但Apoptin诱导的快速凋亡效应需要caspase鄄3的活化。Apoptin具有很强的形成聚合体的倾向,在细胞内表达的Apoptin以多聚体形式存在,但多聚体的形成和解聚并不是其诱导凋亡所必需的。Apoptin诱导细胞凋亡的功能可能与其DNA结合能力密切相关。 展开更多
关键词 apoptin 凋亡 核定位 肿瘤
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PTD-Apoptin原核表达载体构建及可溶性表达 被引量：2
8
作者 贲松彬 潘子瑶 +4 位作者 刘雪梅 崔剑 谷海峰 李其久 陈长兰 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期20-24,共5页
目的:可溶性表达PTD-Apoptin融合蛋白。方法:亚克隆Apoptin基因并人工合成PTD序列,构建原核表达载体pGEX-6p-1-PTD-Apoptin,使载体在E.coli BL21(DE3)中表达并优化。GST亲和纯化天然状态的融合蛋白,并通过MTT实验验证活性。结果:最佳表... 目的:可溶性表达PTD-Apoptin融合蛋白。方法:亚克隆Apoptin基因并人工合成PTD序列,构建原核表达载体pGEX-6p-1-PTD-Apoptin,使载体在E.coli BL21(DE3)中表达并优化。GST亲和纯化天然状态的融合蛋白,并通过MTT实验验证活性。结果:最佳表达条件是25℃、0.1mmol/mL IPTG过夜诱导表达,经GST亲和纯化得到天然状态的单一组分融合蛋白,与胃癌823细胞共孵育后细胞存活率为10.86%,与对照组相比具显著差异。结论:成功获得高生物活性的原核可溶性表达融合蛋白PTD-Apoptin,使胃癌823细胞存活率降至10.86%。 展开更多
关键词 apoptin PTD 可溶性表达 BL21(DE3) MTT
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含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：2
9
作者 陈漉 金宁一 +6 位作者 李霄 刘立明 贾鹏 刘妍 高鹏 陆蕴松 迟宝荣 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2008年第31期3505-3509,共5页
目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切质粒pVAX1-Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apopt... 目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切质粒pVAX1-Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin.利用PacⅠ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Western blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录,表达产物的相对分子质量约为13kDa,与CVA阳性对照一致;所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白,该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性,重组病毒滴度为1011PFU/L.结论:成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求. 展开更多
关键词 apoptin基因 腺病毒载体 基因治疗 逆转 录-聚合酶链反应 免疫印迹法
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Apoptin对C6胶质瘤细胞凋亡的诱导作用 被引量：1
10
作者 朱战鹏 邱吉庆 +2 位作者 连海 郭云宝 罗毅男 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期579-581,F0002,共4页
目的:探索apoptin对C6胶质瘤细胞凋亡的诱导作用。方法:构建荷C6胶质瘤Wistar大鼠的肿瘤模型,随机分为荷瘤对照组、化疗对照组和pvVP3组,给予不同的药物,通过超微结构分析、TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率,观察apoptin诱导C6胶质瘤细胞的凋... 目的:探索apoptin对C6胶质瘤细胞凋亡的诱导作用。方法:构建荷C6胶质瘤Wistar大鼠的肿瘤模型,随机分为荷瘤对照组、化疗对照组和pvVP3组,给予不同的药物,通过超微结构分析、TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率,观察apoptin诱导C6胶质瘤细胞的凋亡情况。结果:pvVP3组肿瘤细胞异染色质边集,细胞核固缩,凋亡小体形成,而荷瘤对照组则未见明显凋亡改变。TUNEL法检测肿瘤细胞pvVP3组凋亡率为51.11%,明显高于荷瘤对照组(28.96%)(P<0.01)。结论:apoptin能够诱导C6胶质瘤细胞凋亡。 展开更多
关键词 apoptin 鸡贫血病毒 神经胶质瘤 细胞凋亡
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pApoptin-EGFP真核表达载体的构建及其对膀胱肿瘤T24的促凋亡作用 被引量：1
11
作者 王亚林 靳风烁 +2 位作者 万江华 王洛夫 吴刚 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期279-282,共4页
目的构建真核表达质粒pApoptin-EGFP并探讨其对人膀胱肿瘤细胞株T24促凋亡作用。方法采用PCR的方法从质粒p3×flag-Apoptin-myc扩增出野生Apoptin片段,将其定向克隆于pEGFP-N1载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,构建能表达Apoptin-EGFP... 目的构建真核表达质粒pApoptin-EGFP并探讨其对人膀胱肿瘤细胞株T24促凋亡作用。方法采用PCR的方法从质粒p3×flag-Apoptin-myc扩增出野生Apoptin片段,将其定向克隆于pEGFP-N1载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,构建能表达Apoptin-EGFP融合蛋白的真核表达质粒pApoptin-EGFP,酶切、测序鉴定,RT-PCR、荧光显微镜分析Apoptin基因表达,脂质体介导瞬时转染膀胱肿瘤T24细胞,流式细胞仪检测调亡及细胞周期变化。结果成功构建pApoptin-EGFP重组质粒,并在被转染细胞中检测到Apoptin基因表达;瞬时转染后不同时相点均可检测到细胞凋亡,与空质粒组相比具有显著差异,细胞周期表现为G1/G0期阻滞。结论成功构建pApoptin-EGFP真核表达质粒,重组质粒能在T24细胞中顺利表达Apoptin-EGFP融合蛋白,重组质粒转染可诱导T24细胞凋亡并阻滞细胞周期于G1/G0期。 展开更多
关键词 apoptin 膀胱肿瘤 T24 凋亡
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Apoptin对宫颈癌Hela细胞的抑制效应 被引量：1
12
作者 朱继红 崔满华 +6 位作者 李霄 孙丽丽 张钰 陈漉 刘立明 张振民 金宁一 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期237-240,共4页
目的:探讨Apoptin基因对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用和作用方式。方法:应用脂质体转染法将重组质粒pVAX1-Apoptin和载体质粒pVAX1分别体外转染Hela细胞,作为重组质粒pVAX1-Apoptin组和载体质粒pVAX1组,同时设空白细胞对照组。应用Wester... 目的:探讨Apoptin基因对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用和作用方式。方法:应用脂质体转染法将重组质粒pVAX1-Apoptin和载体质粒pVAX1分别体外转染Hela细胞,作为重组质粒pVAX1-Apoptin组和载体质粒pVAX1组,同时设空白细胞对照组。应用Western blotting检测Apoptin基因在Hela细胞中的表达;运用噻唑兰(MTT)分析法检测重组质粒对Hela肿瘤细胞的抑制作用;罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位(ΔΨm)和活性氧水平变化;底物染色反应检测caspase-3活性。结果:pVAX1-Apoptin组转染48h后,Hela细胞的抑制率为69.28%,明显高于对照组(0.74%)和pVAX1组(10.11%)(P<0.01)。与对照组比较,pVAX1-Apoptin组线粒体ΔΨm下降(P<0.01),细胞内活性氧水平升高(P<0.05),caspase-3活性增强(P<0.01)。结论:Apoptin可通过诱导Hela细胞凋亡,进而特异性杀伤Hela肿瘤细胞。 展开更多
关键词 宫颈肿瘤 apoptin基因 细胞凋亡 抑瘤作用
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表达Apoptin基因抗肿瘤双特异性重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：1
13
作者 王卓越 李霄 +6 位作者 王浩然 阚式绂 王宇航 齐延新 吴娜 刘燕瑜 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1555-1558,1567,共5页
为研发一种安全、特异、高效的抗肿瘤基因治疗候选药物,本试验基于人端粒酶启动子(hTERTp)、人5型腺病毒复制必需基因(E1a)和特异性抑癌基因(Apoption),利用RAPAd.Ⅰ腺病毒载体系统,构建了一种具有肿瘤特异性杀伤和特异性复制能力的双... 为研发一种安全、特异、高效的抗肿瘤基因治疗候选药物,本试验基于人端粒酶启动子(hTERTp)、人5型腺病毒复制必需基因(E1a)和特异性抑癌基因(Apoption),利用RAPAd.Ⅰ腺病毒载体系统,构建了一种具有肿瘤特异性杀伤和特异性复制能力的双特异性抗肿瘤重组腺病毒Ad-VT。并利用人肝癌细胞(HepG-2)、人肺癌细胞(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)、人胚胎肺细胞(WI-38)和非洲绿猿肾细胞(Vero)对hTERTp的肿瘤特异性进行鉴定。结果显示,hTERTp可在HepG-2、A549和Hela等肿瘤细胞内特异性启动外源基因的表达,而在WI-38、Vero等正常细胞内不能启动相关基因表达。用RT-PCR及Western-blot等方法对Apoptin基因和E1a基因的转录和表达进行了鉴定。结果表明,Ad-VT能够有效表达Apoptin和E1a等外源基因。 展开更多
关键词 RAPAd.Ⅰ apoptin HTERT启动子 双特异 基因治疗
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携Apoptin和PEG3启动子双特异性重组腺病毒的构建及鉴定 被引量：1
14
作者 兰添 李一权 +8 位作者 张诺娜 邢彬 胡宁宁 范园园 陈爽 姜爽 于海玲 李霄 金宁一 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第11期966-970,共5页
目的利用凋亡素基因(Apoptin)和进行性增量基因3(progression-elevated genes 3,PEG3)构建具有特异性杀伤和特异性复制功能的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,为研究Ad-Apoptin-PEG3p-E1a的抗肿瘤作用奠定基础。方法从pMT-E1a和... 目的利用凋亡素基因(Apoptin)和进行性增量基因3(progression-elevated genes 3,PEG3)构建具有特异性杀伤和特异性复制功能的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,为研究Ad-Apoptin-PEG3p-E1a的抗肿瘤作用奠定基础。方法从pMT-E1a和pIRES-neo获得目的基因E1a和PolyA并连接入pKS-PEG3p,用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后连接入pAd-Apoptin,获得穿梭载体pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a。用pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a和腺病毒骨架质粒(pAd5)共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,利用RT-PCR、Western blot和电镜对重组病毒进行鉴定,采用MTS检测病毒对A549细胞的抑制效果及其对L02细胞的影响;通过绘制一步生长曲线,检测重组毒在细胞内的复制情况。结果构建的重组病毒基因组中含有Apoptin目的基因,电镜下具有正常形态。MTS检测重组腺病毒对A549细胞的抑制作用具有时效和量效关系(P<0.05),抑制作用在100MOI、96h时达峰值为(79.84±1.0)%,对正常细胞L02无显著影响,该双特异性重组腺病毒能够在A549肿瘤细胞内复制,在L02细胞内几乎无复制能力。结论成功包装重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a,且该病毒具有肿瘤特异性杀伤和肿瘤特异性复制功能。 展开更多
关键词 重组腺病毒 apoptin 进行性增量基因3 特异性 抗肿瘤
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SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体的构建和鉴定 被引量：1
15
作者 韩苏夏 马瑾璐 +2 位作者 吕毅 黄辰 段康民 《第四军医大学学报》 CAS 北大核心 2009年第1期20-23,共4页
目的:通过基因克隆构建表达SP-TAT-Apoptin融合基因的真核表达载体.方法:通过DNA重组技术,以pCD-NA3.1/Apoptin质粒为模板,进行PCR反应;将具有分泌功能的信号肽和能够携带核酸、蛋白和肽自由地通过细胞膜和核膜的蛋白转导域TAT序列连接... 目的:通过基因克隆构建表达SP-TAT-Apoptin融合基因的真核表达载体.方法:通过DNA重组技术,以pCD-NA3.1/Apoptin质粒为模板,进行PCR反应;将具有分泌功能的信号肽和能够携带核酸、蛋白和肽自由地通过细胞膜和核膜的蛋白转导域TAT序列连接于Apoptin基因5′端;PCR反应的产物连接于plenti6-V5-D-TOPO(真核表达载体.用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组结果;将重组的真核表达载体瞬时转染HUVEC细胞,用免疫荧光标记对转染后的细胞进行处理,观察重组蛋白的表达情况.结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒plenti6-V5-D-TOPO(/SP-TAT-Ap-optin双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确.且经激光共聚焦显微镜观察到重组蛋白的表达,表明重组表达载体已构建成功.结论:成功克隆出SP-TAT-Apoptin融合基因,并成功构建其真核细胞表达载体,为下一步研究SP-TAT-Apoptin融合基因对肿瘤的生长抑制作用的体内外研究奠定了基础. 展开更多
关键词 信号肽 蛋白转导域 鸡贫血病毒 apoptin基因
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Apoptin与顺铂联用对膀胱癌T24细胞具有协同杀伤作用 被引量：1
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作者 王亚林 毛丽伟 +4 位作者 赵立 曲楠 黄晨 麦海星 陈立军 《西南国防医药》 CAS 2013年第1期21-24,共4页
目的探讨pApoptin-EGFP质粒转染与顺铂(DDP)联用对体外培养的膀胱癌T24细胞的协同杀伤作用。方法脂质体介导pApoptin-EGFP瞬时转染与梯度浓度DDP共同处理膀胱癌T24细胞,流式细胞仪检测细胞增殖变化;pApoptin-EGFP瞬时转染与10μg/ml的DD... 目的探讨pApoptin-EGFP质粒转染与顺铂(DDP)联用对体外培养的膀胱癌T24细胞的协同杀伤作用。方法脂质体介导pApoptin-EGFP瞬时转染与梯度浓度DDP共同处理膀胱癌T24细胞,流式细胞仪检测细胞增殖变化;pApoptin-EGFP瞬时转染与10μg/ml的DDP处理T24细胞,Annexin V法检测凋亡变化;金氏法分析两种抗肿瘤方式的协同作用。结果 DDP、pEGFP-N1+DDP和pApoptin-EGFP+DDP 3组的IC50分别为10.61、7.9和2.4μg/ml,以金氏法计算,确认pApoptin-EGFP质粒转染与DDP处理对T24的抑制增殖效应具有协同作用,而转染空质粒与DDP干预仅仅为简单相加。同法检测DDP、pApoptin-EGFP、pApoptin-EGFP+DDP 3组的凋亡率分别为(6.96±1.32)%、(19.55±1.09)%和(32.5±1.15)%,3组凋亡率相互间均具有显著性差异(P<0.05)。按金氏法计算,确认转染pApoptin-EGFP重组质粒与10μg/ml浓度DDP处理对T24细胞具有协同的促凋亡作用。结论 Apoptin基因转染与顺铂联用对T24肿瘤抑制增殖及诱导凋亡具有协同作用。 展开更多
关键词 apoptin 顺铂 膀胱癌 协同作用
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NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因重组腺相关病毒的构建及鉴定 被引量：1
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作者 王健生 张明鑫 +5 位作者 刘德纯 段小艺 周苏娜 张广健 杨广笑 王全颖 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期754-756,共3页
目的:构建编码融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT的重组腺相关病毒表达载体。方法:利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2-TAT连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pAAV/Ad、... 目的:构建编码融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT的重组腺相关病毒表达载体。方法:利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2-TAT连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140共同转染HEK-293细胞,通过同源重组获得NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,收集病毒上清,Dot blot法测定其滴度。MTT比色法观察NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞存活率的影响。结果:经酶切及测序证实克隆出NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因;得到高滴度的(3.14×1015pfu/L)重组腺相关病毒表达载体。NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞有强烈的诱导凋亡作用,与对照组比较,处理组细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-Ap-optin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,为下一步的Apoptin应用于基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 NT4-apoptin-HA2-TAT 重组腺相关病毒 肿瘤 融合基因
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Apoptin对宫颈癌Hela细胞放疗增敏作用实验研究 被引量：1
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作者 王丽 赵晶 韩苏夏 《西部医学》 2013年第9期1287-1290,1297,共5页
目的探讨Apoptin增加宫颈癌Hela细胞的敏感性及作用机制。方法应用脂质体转染方法将表达Apoptin的重组载体pEGFP-Apoptin转染入人宫颈癌Hela细胞。其中转染pEGFP-Apopti为实验组,转染pEGFP-C2组为阳性对照组,未转染组为阴性对照组。上... 目的探讨Apoptin增加宫颈癌Hela细胞的敏感性及作用机制。方法应用脂质体转染方法将表达Apoptin的重组载体pEGFP-Apoptin转染入人宫颈癌Hela细胞。其中转染pEGFP-Apopti为实验组,转染pEGFP-C2组为阳性对照组,未转染组为阴性对照组。上述各组经射线干预后利用平板克隆形成实验、流式细胞术、MTT及蛋白印迹western-blot等方法分别检测细胞凋亡、周期及相关蛋白表达水平。结果 pEGFP-Apoptin在人宫颈癌Hela细胞中稳定表达。Apoptin可增加宫颈癌Hela细胞对放射线的敏感性,Apoptin可使p21、p27的表达量上调,使Rad50及Ku80的表达量下调,而对XLF的表达量则无影响。结论 Apoptin可增加宫颈癌Hela细胞的放疗敏感性,其机制可能与细胞周期阻滞及同源与非同源重组修复相关蛋白的表达水平改变有关。 展开更多
关键词 宫颈癌 放疗敏感性 apoptin HELA细胞
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Apoptin与肿瘤细胞凋亡 被引量：1
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作者 姚站馨 吕茂民 章金刚 《生物技术通讯》 CAS 2007年第3期490-492,共3页
Apoptin是一种能够特异性地诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡的小蛋白质。简要综述了Apoptin的来源及其分子生物学特性、Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的特点和分子机制、Apoptin在肿瘤治疗方面的研究进展,以及Apoptin作为一种抗肿瘤制剂的应用前景。
关键词 apoptin 细胞凋亡 肿瘤
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重组Apoptin的叶酸修饰及诱导肿瘤细胞凋亡活性研究 被引量：2
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作者 董萍 彭海英 +1 位作者 高璐 赵洪礼 《中国疗养医学》 2015年第1期7-9,共3页
为了使重组GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细胞靶向性结合,并发挥其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用,本文采用化学方法将叶酸连接到GST-Apoptin融合蛋白,实验结果表明叶酸与GST-Apoptin融合蛋白的偶联率为6%,最佳偶联条件是20 mg/m L活化... 为了使重组GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细胞靶向性结合,并发挥其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用,本文采用化学方法将叶酸连接到GST-Apoptin融合蛋白,实验结果表明叶酸与GST-Apoptin融合蛋白的偶联率为6%,最佳偶联条件是20 mg/m L活化叶酸在p H 10.0条件下室温反应60 min。叶酸化的GST-Apoptin融合蛋白(folate-GST-Apoptin)具有显著诱导肿瘤细胞凋亡作用,1.0μg/m L的folate-GST-Apoptin可使50%的肿瘤细胞(KG-1)凋亡,而对正常人外周血淋巴细胞没有诱导凋亡作用。 展开更多
关键词 凋亡 叶酸 apoptin
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