【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白ARC1及ARC1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息...【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白ARC1及ARC1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息学分析得到蛋白功能域,根据分析结果以典型的自交不亲和结球甘蓝E1为材料分别扩增SRK、ARC1和Exo70A1含不同功能域的截短体片段,利用分子克隆技术将SRK激酶域(SRKj)及其截短体SRKjΔ1—SRKjΔ4,Exo70A1全长及其截短体Exo70A1Δ1—Exo70A1Δ3的编码序列分别亚克隆至p GADT7(AD)质粒,将ARC1及其截短体ARC1Δ1—ARC1Δ8的编码序列分别亚克隆至载体p GBKT7(BD)质粒。用PEG/Li Ac法将获得的AD和BD重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步测定其β-半乳糖苷酶活性。最后通过原核表达体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1的相互作用进行验证。【结果】DNA测序和内切酶分析显示成功构建18个酵母双杂交表达载体,且无自激活能力。在SRK-ARC1的10个试验组合中,只有ARC1Δ4、ARC1Δ8、ARC1与SRKj组合的融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着SRKj或ARC1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性逐渐增加,其中,ARC1Δ4与SRKj组合的β-半乳糖苷酶活性最高(酶活为15.98)。在ARC1-Exo70A1 16个试验组合中,Exo70A1Δ3与ARC1Δ1Δ3都相互作用,其融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着ARC1或Exo70A1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性呈现先增加后降低的趋势,其中ARC1Δ2与Exo70A1Δ3组合的β-半乳糖苷酶活性最大(酶活性为25.07)。说明ARC1的N端和Exo70A1的N端发生了互作,而ARC1的C端、全长与Exo70A1都不发生互作。体外表达检测蛋白相互作用发现,SRKj与ARC1Δ4、ARC1Δ2与Exo70A1Δ3均可以直接发生相互作用。【结论】SRK的激酶域(SRKj)与ARC1的C端臂重复区发生互作,缩短SRK激酶域中的任何结构域或者缩短ARC1的臂重复区,二者都不会发生互作。ARC1的亮氨酸拉链和蜷曲螺旋与Exo70A1的N端结构域(去除pfam Exo70A1域)介导了二者的相互作用。SRK-ARC1的作用力强度小于ARC1-Exo70A1的作用力强度。展开更多
文摘【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白ARC1及ARC1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息学分析得到蛋白功能域,根据分析结果以典型的自交不亲和结球甘蓝E1为材料分别扩增SRK、ARC1和Exo70A1含不同功能域的截短体片段,利用分子克隆技术将SRK激酶域(SRKj)及其截短体SRKjΔ1—SRKjΔ4,Exo70A1全长及其截短体Exo70A1Δ1—Exo70A1Δ3的编码序列分别亚克隆至p GADT7(AD)质粒,将ARC1及其截短体ARC1Δ1—ARC1Δ8的编码序列分别亚克隆至载体p GBKT7(BD)质粒。用PEG/Li Ac法将获得的AD和BD重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步测定其β-半乳糖苷酶活性。最后通过原核表达体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1的相互作用进行验证。【结果】DNA测序和内切酶分析显示成功构建18个酵母双杂交表达载体,且无自激活能力。在SRK-ARC1的10个试验组合中,只有ARC1Δ4、ARC1Δ8、ARC1与SRKj组合的融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着SRKj或ARC1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性逐渐增加,其中,ARC1Δ4与SRKj组合的β-半乳糖苷酶活性最高(酶活为15.98)。在ARC1-Exo70A1 16个试验组合中,Exo70A1Δ3与ARC1Δ1Δ3都相互作用,其融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着ARC1或Exo70A1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性呈现先增加后降低的趋势,其中ARC1Δ2与Exo70A1Δ3组合的β-半乳糖苷酶活性最大(酶活性为25.07)。说明ARC1的N端和Exo70A1的N端发生了互作,而ARC1的C端、全长与Exo70A1都不发生互作。体外表达检测蛋白相互作用发现,SRKj与ARC1Δ4、ARC1Δ2与Exo70A1Δ3均可以直接发生相互作用。【结论】SRK的激酶域(SRKj)与ARC1的C端臂重复区发生互作,缩短SRK激酶域中的任何结构域或者缩短ARC1的臂重复区,二者都不会发生互作。ARC1的亮氨酸拉链和蜷曲螺旋与Exo70A1的N端结构域(去除pfam Exo70A1域)介导了二者的相互作用。SRK-ARC1的作用力强度小于ARC1-Exo70A1的作用力强度。
