为建立花生致敏蛋白Ara h 2双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,本研究基于所制备的抗体,采用双抗体夹心检测模式,以Ara h 2鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,并通过棋盘法优化抗体工作浓度,对该方法的灵...为建立花生致敏蛋白Ara h 2双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,本研究基于所制备的抗体,采用双抗体夹心检测模式,以Ara h 2鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,并通过棋盘法优化抗体工作浓度,对该方法的灵敏度、准确度、精密度和特异性进行鉴定。结果表明,建立的双抗夹心ELISA检测方法对Ara h 2的检出限为5.04 ng·mL^(-1),线性范围为15.63~1 000 ng·mL^(-1),添加回收率为80.12%~96.03%,批内和批间变异系数均小于10%,且特异性良好、与其他常见食物过敏原无交叉反应。本研究可为致敏蛋白Ara h 2检测提供一种快速高效的方法。展开更多
花生过敏蛋白Ara h 3广泛存在于各类花生制品中,少量摄入即可引发过敏反应,严重威胁花生过敏患者的健康。精准地识别Ara h 3便于开展后续免疫学检测,因此,制备高纯度、高特异性的抗体显得尤为重要。以花生脱脂粉为原料,通过HiTrap Q HP...花生过敏蛋白Ara h 3广泛存在于各类花生制品中,少量摄入即可引发过敏反应,严重威胁花生过敏患者的健康。精准地识别Ara h 3便于开展后续免疫学检测,因此,制备高纯度、高特异性的抗体显得尤为重要。以花生脱脂粉为原料,通过HiTrap Q HP阴离子交换层析柱和HiLoad Superdex 200 pg制备级分子筛层析柱,制备高纯度的花生致敏蛋白Ara h 3,将其与CNBr-activated SepharoseTM 4B进行偶联,利用不同洗脱液对血清样品中的非特异性及特异性物质进行分离,制备高纯度、高特异性的抗Ara h 3多克隆抗体。结果表明:Gly-HCl洗脱的蛋白质量浓度为0.6 mg/mL;SDS-PAGE分析显示,多克隆抗体中的非特异性物质已被有效去除;免疫印迹和ELISA试验证明,纯化后的抗体仍具有较高的特异性,其效价达到1∶51200。上述结果表明抗体成功纯化,为花生过敏原Ara h 3的检测研究奠定了基础。展开更多
旨在为预防花生过敏提供新的思路和方法,考察了不同烘烤温度、烘烤时间和样品量(平铺于4 cm×4 cm锡箔纸)对Ara h 3抗原性的影响,利用正交试验得到Ara h 3抗原性增强程度最高的烘烤处理条件,并采用双缩脲法、紫外光谱、傅里叶变换...旨在为预防花生过敏提供新的思路和方法,考察了不同烘烤温度、烘烤时间和样品量(平铺于4 cm×4 cm锡箔纸)对Ara h 3抗原性的影响,利用正交试验得到Ara h 3抗原性增强程度最高的烘烤处理条件,并采用双缩脲法、紫外光谱、傅里叶变换红外光谱和荧光光谱探究烘烤对Ara h 3溶解度、游离巯基含量、二级结构和疏水性的影响。结果表明:烘烤后Ara h 3抗原性增强,且随烘烤温度升高和烘烤时间延长Ara h 3的抗原性呈先增强后减弱的趋势,样品量在70~90 mg时抗原性相差不大;在烘烤温度140℃、烘烤时间20 min,样品量80 mg时,抗原性增强程度最高,达到34.12%;烘烤后Ara h 3溶解度和游离巯基含量显著降低,蛋白质发生解折叠,无规卷曲含量增加,蛋白质分子趋于无序状态,同时,蛋白质部分肽链舒展,疏水基团暴露,外源荧光强度增强。综上,烘烤处理可以改变Ara h 3的结构,使其抗原表位暴露或者产生新的抗原表位,显著增强Ara h 3的抗原性。花生加工过程中应规避致使花生抗原性增强的烘烤条件,以降低花生致敏性。展开更多
为高效分离纯化花生过敏原Ara h 6,通过脱脂、蛋白浸提、阴离子交换层析分离得到目的蛋白,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)及免疫印迹技术(Western blotting)对其...为高效分离纯化花生过敏原Ara h 6,通过脱脂、蛋白浸提、阴离子交换层析分离得到目的蛋白,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)及免疫印迹技术(Western blotting)对其进行鉴定。结果表明,该蛋白为花生过敏原Ara h 6,其分子质量约为15kD,纯度大于95%,得率为22.5%。该方法简单、高效,可为花生过敏的进一步研究提供实验材料。展开更多
花生过敏已成为世界各地普遍存在的公众性健康问题,得到广泛关注,对花生过敏原的研究日渐深入。过敏原结构为加工降低其过敏原性提供基础,用各种加工手段降低甚至消除花生过敏原蛋白的致敏性,尤其是Ara h 1、Ara h 2和Ara h 6、Ara h 3/...花生过敏已成为世界各地普遍存在的公众性健康问题,得到广泛关注,对花生过敏原的研究日渐深入。过敏原结构为加工降低其过敏原性提供基础,用各种加工手段降低甚至消除花生过敏原蛋白的致敏性,尤其是Ara h 1、Ara h 2和Ara h 6、Ara h 3/4这些含量高、致敏性强的主要过敏原的致敏性已备受重视。本文主要介绍花生过敏原研究在结构及加工方面的进展,以期为低致敏甚至脱敏花生的生产提供一定的参考,以保证实现丰富食物过敏患者食品选择的同时,有效降低食品安全风险。展开更多
目的:克隆花生主要过敏原Ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h 8基因;将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表...目的:克隆花生主要过敏原Ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h 8基因;将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白Ara h 8;Western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生Ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原Ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。展开更多
目的:构建经序列重组的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。方法:根据已鉴定的Ara h 2 IgE抗原表位,利用基因工程技术将Ara h 2基因进行合理的组合,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上...目的:构建经序列重组的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。方法:根据已鉴定的Ara h 2 IgE抗原表位,利用基因工程技术将Ara h 2基因进行合理的组合,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western blotting和ELISA鉴定该重组蛋白的低致敏原性。结果:测序结果表明合成后的序列成功转入原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blotting和ELISA结果均表明通过基因工程改造的Ara h 2蛋白(S-Ara h 2)与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。结论:成功构建了经序列重组的Ara h 2表达载体,该基因表达的重组蛋白具有良好的低致敏原性,这将会为花生过敏患者的脱敏治疗提供了新的安全疫苗基础。展开更多
文摘为建立花生致敏蛋白Ara h 2双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,本研究基于所制备的抗体,采用双抗体夹心检测模式,以Ara h 2鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,并通过棋盘法优化抗体工作浓度,对该方法的灵敏度、准确度、精密度和特异性进行鉴定。结果表明,建立的双抗夹心ELISA检测方法对Ara h 2的检出限为5.04 ng·mL^(-1),线性范围为15.63~1 000 ng·mL^(-1),添加回收率为80.12%~96.03%,批内和批间变异系数均小于10%,且特异性良好、与其他常见食物过敏原无交叉反应。本研究可为致敏蛋白Ara h 2检测提供一种快速高效的方法。
文摘花生过敏蛋白Ara h 3广泛存在于各类花生制品中,少量摄入即可引发过敏反应,严重威胁花生过敏患者的健康。精准地识别Ara h 3便于开展后续免疫学检测,因此,制备高纯度、高特异性的抗体显得尤为重要。以花生脱脂粉为原料,通过HiTrap Q HP阴离子交换层析柱和HiLoad Superdex 200 pg制备级分子筛层析柱,制备高纯度的花生致敏蛋白Ara h 3,将其与CNBr-activated SepharoseTM 4B进行偶联,利用不同洗脱液对血清样品中的非特异性及特异性物质进行分离,制备高纯度、高特异性的抗Ara h 3多克隆抗体。结果表明:Gly-HCl洗脱的蛋白质量浓度为0.6 mg/mL;SDS-PAGE分析显示,多克隆抗体中的非特异性物质已被有效去除;免疫印迹和ELISA试验证明,纯化后的抗体仍具有较高的特异性,其效价达到1∶51200。上述结果表明抗体成功纯化,为花生过敏原Ara h 3的检测研究奠定了基础。
文摘旨在为预防花生过敏提供新的思路和方法,考察了不同烘烤温度、烘烤时间和样品量(平铺于4 cm×4 cm锡箔纸)对Ara h 3抗原性的影响,利用正交试验得到Ara h 3抗原性增强程度最高的烘烤处理条件,并采用双缩脲法、紫外光谱、傅里叶变换红外光谱和荧光光谱探究烘烤对Ara h 3溶解度、游离巯基含量、二级结构和疏水性的影响。结果表明:烘烤后Ara h 3抗原性增强,且随烘烤温度升高和烘烤时间延长Ara h 3的抗原性呈先增强后减弱的趋势,样品量在70~90 mg时抗原性相差不大;在烘烤温度140℃、烘烤时间20 min,样品量80 mg时,抗原性增强程度最高,达到34.12%;烘烤后Ara h 3溶解度和游离巯基含量显著降低,蛋白质发生解折叠,无规卷曲含量增加,蛋白质分子趋于无序状态,同时,蛋白质部分肽链舒展,疏水基团暴露,外源荧光强度增强。综上,烘烤处理可以改变Ara h 3的结构,使其抗原表位暴露或者产生新的抗原表位,显著增强Ara h 3的抗原性。花生加工过程中应规避致使花生抗原性增强的烘烤条件,以降低花生致敏性。
文摘为高效分离纯化花生过敏原Ara h 6,通过脱脂、蛋白浸提、阴离子交换层析分离得到目的蛋白,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)及免疫印迹技术(Western blotting)对其进行鉴定。结果表明,该蛋白为花生过敏原Ara h 6,其分子质量约为15kD,纯度大于95%,得率为22.5%。该方法简单、高效,可为花生过敏的进一步研究提供实验材料。
文摘花生过敏已成为世界各地普遍存在的公众性健康问题,得到广泛关注,对花生过敏原的研究日渐深入。过敏原结构为加工降低其过敏原性提供基础,用各种加工手段降低甚至消除花生过敏原蛋白的致敏性,尤其是Ara h 1、Ara h 2和Ara h 6、Ara h 3/4这些含量高、致敏性强的主要过敏原的致敏性已备受重视。本文主要介绍花生过敏原研究在结构及加工方面的进展,以期为低致敏甚至脱敏花生的生产提供一定的参考,以保证实现丰富食物过敏患者食品选择的同时,有效降低食品安全风险。
文摘目的:克隆花生主要过敏原Ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h 8基因;将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白Ara h 8;Western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生Ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原Ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。
文摘目的:构建经序列重组的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。方法:根据已鉴定的Ara h 2 IgE抗原表位,利用基因工程技术将Ara h 2基因进行合理的组合,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western blotting和ELISA鉴定该重组蛋白的低致敏原性。结果:测序结果表明合成后的序列成功转入原核表达载体pET-32a(+)上。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blotting和ELISA结果均表明通过基因工程改造的Ara h 2蛋白(S-Ara h 2)与重组的Ara h 2(R-Ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中IgE显著降低。结论:成功构建了经序列重组的Ara h 2表达载体,该基因表达的重组蛋白具有良好的低致敏原性,这将会为花生过敏患者的脱敏治疗提供了新的安全疫苗基础。
