用于非洲马瘟病毒核酸检测的假病毒阳性对照品的制备

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作者 杨燕 胡哲 +2 位作者 郭奎 张泽楠 王晓钧 《中国农业大学学报》 北大核心 2025年第6期92-100,共9页

为制备含非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)VP7基因的假病毒,并作为AHSV核酸检测的阳性对照品,本研究合成了含AHSV VP7基因片段的核苷酸序列,将该基因片段插入慢病毒穿梭载体pSIN4-GFP中,将重组慢病毒穿梭质粒pSIN4-VP7... 为制备含非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)VP7基因的假病毒,并作为AHSV核酸检测的阳性对照品,本研究合成了含AHSV VP7基因片段的核苷酸序列,将该基因片段插入慢病毒穿梭载体pSIN4-GFP中,将重组慢病毒穿梭质粒pSIN4-VP7和慢病毒骨架质粒pMD 2G、pSPA-X2共转染293T细胞,包装AHSV假病毒颗粒,并通过RT-PCR、荧光RT-PCR、逆转录酶检测及电镜验证AHSV假病毒包装。在AHSV假病毒颗粒中加入冻干保护剂制备成阳性对照品,对该冻干阳性对照品进行物理性状检验、无菌检验、均一性评估和稳定性评估。结果显示:1)经菌液PCR及测序验证,成功构建含AHSV VP7基因的慢病毒穿梭质粒。重组慢病毒质粒与慢病毒骨架质粒共转染293T细胞48 h后,提取细胞上清中RNA,经RT-PCR和荧光RT-PCR鉴定,RT-PCR结果显示,能扩增出大小约1187 bp的特异性条带,且测序结果显示特异性条带与插入片段一致。荧光RT-PCR结果显示,有特异性扩增曲线。2)逆转录酶检测结果显示AHSV假病毒颗粒中逆转录酶浓度为2628μg/mL,表明成功包装出AHSV假病毒颗粒,且假病毒含量较高。电镜观察显示AHSV假病毒颗粒为不规则圆形病毒样结构,直径为150~200 nm。3)均一性评估显示,阳性对照品Ct值的变异系数<10%,表明均一性良好。4)加速热稳定性试验显示,制备的阳性对照品分别经4、25和37℃放置7 d后仍能保持稳定。保存期试验表明制备的阳性对照品能在-20和-80℃环境下保存6个月。综上,本研究成功制备了含有AHSV VP7基因片段的假病毒阳性对照品,可实现对AHSV核酸提取和检测过程的全程监控。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒(ahsv) VP7基因 假病毒 阳性对照品

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非洲马瘟病毒NS1蛋白在昆虫细胞中的表达及抗原性分析

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作者 户鑫兵 王轩莹 +6 位作者 宋昱庆 田占成 关贵全 苟惠天 罗建勋 殷宏 独军政 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期350-356,共7页

非洲马瘟(African horse sickness,AHS)是一种由媒介昆虫传播感染马属动物的病毒性疾病,为了在杆状病毒表达系统中表达AHSVNS1蛋白并评估其作为亚单位疫苗组分的抗原性,本研究参考GenBank上公布的AHSV基因序列,人工合成NS1全长基因序列... 非洲马瘟(African horse sickness,AHS)是一种由媒介昆虫传播感染马属动物的病毒性疾病,为了在杆状病毒表达系统中表达AHSVNS1蛋白并评估其作为亚单位疫苗组分的抗原性,本研究参考GenBank上公布的AHSV基因序列,人工合成NS1全长基因序列,利用PCR方法扩增完整的开放阅读框后将其克隆到转座载体pFastBacTMHTb上,将成功构建的重组质粒pFastBac-AHSVNS1转化到DH10Bac感受态细胞中,获得了含有AHSVNS1基因的重组杆粒Bacmid-AHSVNS1,将其转染到Sf9昆虫细胞内获得了表达AHSVNS1蛋白的重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,表达的重组AHSV NS1蛋白大小为65 ku,且获得了纯化的重组AHSV NS1蛋白。将其免疫BALB/c小鼠,细胞免疫荧光和Western-blot试验显示获得了特异性的抗AHSV NS1蛋白多克隆抗体,其效价达1∶51 200。流式细胞分析显示,AHSV NS1蛋白免疫小鼠能够刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞的增加。上述研究结果表明,AHSV NS1蛋白作为AHSV亚单位疫苗的组成成分具有一定应用前景。本试验实现了AHSV NS1蛋白在昆虫细胞中成功表达并验证其具有良好的抗原性,这为进一步研究AHSV NS1蛋白的生物学功能和亚单位疫苗开发奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 ahsv NS1蛋白 昆虫细胞表达 抗原性

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抗非洲马瘟VP7蛋白的小鼠单克隆抗体制备及其鉴定 被引量：4

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作者 杜方原 冯春燕 +4 位作者 王彩霞 仇松寅 张永宁 林祥梅 吴绍强 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1125-1129,共5页

目的制备抗非洲马瘟病毒(AHSV)蛋白VP7的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定及分析。方法本研究以杆状病毒表达的VP7蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备mAb,通过ELISA、间接免疫荧光法(IFA)及阻断AHSV阳性血清等实验检测mAb的效果,利用mAb亚型分类鉴... 目的制备抗非洲马瘟病毒(AHSV)蛋白VP7的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定及分析。方法本研究以杆状病毒表达的VP7蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备mAb,通过ELISA、间接免疫荧光法(IFA)及阻断AHSV阳性血清等实验检测mAb的效果,利用mAb亚型分类鉴定试剂盒检测这四株mAb的亚型。结果筛选出20A8、28B3、30G8、47E6四株mAb,其中47E6阻断效果最好。结论成功制备了抗VP7蛋白的mAb。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒(ahsv) 单克隆抗体(mAb)

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非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达 被引量：4

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作者 曾昭文 花群义 +6 位作者 段纲 周晓黎 董俊 杨云庆 尹尚莲 项勋 常华 《中国农学通报》 CSCD 2006年第10期49-53,共5页

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,... 为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72kDa。Westernblotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 VP7基因 克隆 表达

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非洲马瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：4

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作者 赵文华 杨仕标 李富祥 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第12期11-16,共6页

非洲马瘟病毒(AHSV)为双股RNA病毒,能感染所有马科动物。为建立一种AHSV快速检测方法,根据GenBank及作者所测AHSV 9个血清型VP7-ORF全长核苷酸序列,设计一对位于AHSV基因组S7片段的特异引物,然后进行荧光定量检测。经试验,证实该对引物... 非洲马瘟病毒(AHSV)为双股RNA病毒,能感染所有马科动物。为建立一种AHSV快速检测方法,根据GenBank及作者所测AHSV 9个血清型VP7-ORF全长核苷酸序列,设计一对位于AHSV基因组S7片段的特异引物,然后进行荧光定量检测。经试验,证实该对引物对9种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,能检出特异荧光信号,而对与AHSV同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血症病毒(EHDV)及正常马淋巴组织和阴性对照均无扩增,无有效荧光信号可检出。以国家外来动物疫病诊断实验室已构建好的AHSV 9型pMD18-T-VP7质粒为标准品可建立良好的标准曲线,实现对检测样本的实时定量。本研究建立了模板预变性结合"三步"法敏感特异的AHSV实时荧光定量RT-PCR快速检测方法,检测灵敏度可达102拷贝/μL。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 血清型 SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量RT-PCR

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非洲马瘟病毒VP7蛋白研究进展

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作者 张桂铭 张兵 +3 位作者 张敏 宋亚芬 王磊 杨承槐 《中国兽药杂志》 2023年第5期87-94,共8页

非洲马瘟(African horse sickness, AHS)是由非洲马瘟病毒(African horse sickness virus, AHSV)引起的一种通过库蜢等昆虫传播的、主要感染马科动物的传染病。我国是世界动物卫生组织认可的非洲马瘟无疫国,随着AHS疫情在东南亚的传播,... 非洲马瘟(African horse sickness, AHS)是由非洲马瘟病毒(African horse sickness virus, AHSV)引起的一种通过库蜢等昆虫传播的、主要感染马科动物的传染病。我国是世界动物卫生组织认可的非洲马瘟无疫国,随着AHS疫情在东南亚的传播,增大了疫情传入我国的风险。AHSV编码了7种结构蛋白(VP1~VP7),其中VP7是病毒内衣壳蛋白的主要组成部分,在AHSV 9个血清型中高度保守,常作检测的靶标。此外,VP7蛋白的自组装特点对于AHSV亚单位疫苗和病毒样颗粒疫苗(VLP)的研究有基础性作用。对当前AHSV VP7蛋白相关研究进展进行了综述,以期为AHSV检测方法及疫苗等研究提供参考。 展开更多

关键词 ahsv VP7 结构 诊断 疫苗

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非洲马瘟病毒VP7蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

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作者 张桂铭 张敏 +3 位作者 张兵 王磊 郭思凡 杨承槐 《中国兽药杂志》 2023年第12期1-7,共7页

为建立非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus,AHSV)的血清学诊断方法,构建了非洲马瘟病毒VP7蛋白的原核表达质粒pET-32a-VP7,诱导表达后使用Ni-NTA纯化可溶性VP7蛋白,以重组VP7蛋白作为包被抗原,优化建立检测血清抗体的间接ELISA... 为建立非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus,AHSV)的血清学诊断方法,构建了非洲马瘟病毒VP7蛋白的原核表达质粒pET-32a-VP7,诱导表达后使用Ni-NTA纯化可溶性VP7蛋白,以重组VP7蛋白作为包被抗原,优化建立检测血清抗体的间接ELISA方法。对间接ELISA方法进行敏感性、特异型和重复性验证,表明间接ELISA方法的检测效果良好,可为非洲马瘟血清检测试剂盒的开发提供相关参考。 展开更多

关键词 ahsv VP7 酶联免疫吸附试验 检测

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一株1型非洲马瘟疫苗毒种的初步鉴定 被引量：1

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作者 王静文 张敏 +6 位作者 宋亚芬 张兵 张桂铭 王磊 苗清新 陈玲 杨承槐 《中国兽药杂志》 2022年第6期9-14,共6页

为做好非洲马瘟疫苗的储备性研究,以更好应对我国周边地区非洲马瘟疫情传入风险,对中国兽医微生物菌种保藏管理中心的一株1型非洲马瘟病毒鼠脑组织毒进行了复壮和细胞适应性培养,并对其病毒含量、特异性、对小鼠毒力等进行测定。结果显... 为做好非洲马瘟疫苗的储备性研究,以更好应对我国周边地区非洲马瘟疫情传入风险,对中国兽医微生物菌种保藏管理中心的一株1型非洲马瘟病毒鼠脑组织毒进行了复壮和细胞适应性培养,并对其病毒含量、特异性、对小鼠毒力等进行测定。结果显示,该毒种在Vero细胞连续传代至F10代后病变产生明显,病毒含量可稳定在10^(6.5) TCID_(50)/0.1mL以上;对小鼠毒力表现稳定,细胞适应毒也可达10^(6.5) TCID_(50)/0.1mL。根据OIE参考引物进行RT-PCR鉴定,序列比对证实该毒株为血清1型,与泰国毒株THA2020/01拥有99.7%的同源性。血清学试验结果表明,该毒株可被非洲马瘟1型特异性血清中和。本研究获得了一株Vero细胞适应毒,可作为良好的疫苗毒株候选株,适用于规模化生产,为疫苗储备奠定良好基础。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 血清1型 VERO细胞 疫苗种毒

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几种外来动物病毒多重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

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作者 赵文华 李富祥 杨仕标 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2022年第2期27-33,38,共8页

为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(... 为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示:建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达10^(1.70)~10^(2.08) copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10^(3) copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系Ⅳ型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法和四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测相应的3种或4种病毒病原,且具有临床样本检测的应用潜力。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 蓝舌病病毒8型 流行性出血热病毒1型 非洲马瘟病毒 四重普通RT-PCR 三重实时荧光定量RT-PCR

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非洲马瘟病毒VP7基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达 被引量：6

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作者 李富祥 杨仕标 +3 位作者 艾军 周晓黎 赵文华 王金萍 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第1期28-31,共4页

为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经XbaⅠ和HindⅢ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、... 为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经XbaⅠ和HindⅢ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带VP7基因的重组质粒pFastBacHTB-AHSV-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-AHSV-VP7,并在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染Sf9昆虫细胞,收获表达产物。表达产物经Western blotting分析表明,VP7重组蛋白得到表达,其分子质量大小约为45ku,且具有良好的生物活性。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 VP7基因 杆状病毒表达 昆虫细胞

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非洲马瘟病毒群特异性RT-PCR检测方法的研究 被引量：14

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作者 赵文华 杨仕标 +1 位作者 王金萍 李富祥 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期204-207,共4页

非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)为双股RNA病毒,感染所有马科动物。设计2对位于AHSV基因组S7片段的引物,经RT-PCR扩增,证实2对引物对6种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,且能对同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿出血热病毒(EH... 非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)为双股RNA病毒,感染所有马科动物。设计2对位于AHSV基因组S7片段的引物,经RT-PCR扩增,证实2对引物对6种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,且能对同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿出血热病毒(EHDV)进行区别诊断。经序列测定及Blast,证实所扩增的条带确为AHSV S7相应位置核苷酸序列,表明已初步建立AHSV群特异性RT-PCR检测方法。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 S7基因片段 RT-PCR 序列测定

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非洲马瘟病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立 被引量：9

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作者 史卫军 林彦星 +7 位作者 黄超华 曹琛福 曾少灵 吴江 刘建利 陈兵 阮周曦 花群义 《中国动物检疫》 CAS 2022年第7期119-123,共5页

本研究根据非洲马瘟病毒(AHSV)S7基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测AHSV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)方法。该方法特异性强,仅AHSV检测为阳性,蓝舌病病毒(BTV)、马流感病毒(EIV)、马动脉炎病毒(EAV)等病原检测... 本研究根据非洲马瘟病毒(AHSV)S7基因保守序列设计特异性引物和探针,建立了检测AHSV的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)方法。该方法特异性强,仅AHSV检测为阳性,蓝舌病病毒(BTV)、马流感病毒(EIV)、马动脉炎病毒(EAV)等病原检测均为阴性;灵敏性高,最低检出限为2.36×10^(1)copies/μL;反应快速,检测时间为20 min,同时具有良好的重复性。利用该方法和实时荧光RT-PCR平行检测60份临床样品,符合率为100%。结果表明,本研究建立的AHSV RT-RPA检测方法特异、敏感、快速且结果可靠,适用于AHSV的高通量、快速检测。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA) 检测

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非洲马瘟病毒分型RT-PCR检测方法的研究 被引量：7

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作者 赵文华 杨仕标 +1 位作者 王金萍 李富祥 《中国农学通报》 CSCD 2012年第2期43-47,共5页

为验证所引进9个血清型的非洲马瘟病毒,并同时对其分型鉴定方法有所探索,根据参考文献设计位于AHSV基因组L2片段的型特异性分型引物,用RT-PCR及测序方法进行实验研究。抽提所引进9种血清型的RNA,经RT-PCR扩增,各引物均有特异性扩增,经... 为验证所引进9个血清型的非洲马瘟病毒,并同时对其分型鉴定方法有所探索,根据参考文献设计位于AHSV基因组L2片段的型特异性分型引物,用RT-PCR及测序方法进行实验研究。抽提所引进9种血清型的RNA,经RT-PCR扩增,各引物均有特异性扩增,经进一步的核苷酸序列测定及分析,证实所扩增片段均为非洲马瘟病毒L2基因相应位置片段;同时对AHSV分型RT-PCR检测方法进行了改进优化研究。实验证实分型引物对各RNA均有特异扩增,所引进9个血清型为正确血清型,并建立了适合实验室条件的AHSV分型鉴定方法。 展开更多

关键词 非洲马瘟病毒 L2基因组片段 血清型 RT-PCR

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