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AA12(LG21)可溶性表达研究及抗体制备 被引量：6
1
作者 刘爽 胡宝成 +1 位作者 绳纪坡 田媛 《生物技术通讯》 CAS 2003年第2期105-108,共4页
用PCR技术从AA12基因上扩增出LG21(100～498bp)片段,并克隆到原核表达载体pET-28a(+)上;转化大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达研究,使其在大肠杆菌中能够可溶性表达,优化表达条件获得表达量比较高的LG21蛋白;用镍离子螯和柱(Ni-NTA)纯化L... 用PCR技术从AA12基因上扩增出LG21(100～498bp)片段,并克隆到原核表达载体pET-28a(+)上;转化大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达研究,使其在大肠杆菌中能够可溶性表达,优化表达条件获得表达量比较高的LG21蛋白;用镍离子螯和柱(Ni-NTA)纯化LG21蛋白,获得纯度较高的蛋白。用纯蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA结果显示效价可达到1∶163840;Western结果表明该抗体可以与LG21蛋白特异结合;为进行免疫共沉淀实验,验证Chk1蛋白与AA12蛋白在体内的相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 aa12蛋白 LG21蛋白 原核表达 多克隆抗体 Chkl蛋白 A1—5细胞 表型 差异表达基因 G2期延迟 抗辐射性 可溶性表达 细胞周期 PCR技术
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苏云金芽胞杆菌Rpp39杀虫晶体蛋白基因的鉴定及cry2Aa12基因的克隆表达
2
作者 谭芙蓉 朱军 +2 位作者 李云艳 郑爱萍 李平 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期684-689,共6页
【目的】本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究。【方法】本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-R... 【目的】本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究。【方法】本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-RFLP鉴定法和SDS-PAGE分析法研究菌株的特性;采用PCR直接克隆法克隆cry2Aa全长基因,并亚克隆到原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-2Aa,再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)中进行诱导表达;采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾和水稻二化螟的毒力。【结果】经扫描电镜观察菌株Rpp39主要产生菱形、方形和圆形3种伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明主要产生130kDa和60kDa左右2种蛋白;经PCR-RFLP鉴定,该菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia和cry2Aa五类杀虫晶体蛋白基因;1种cry2Aa类杀虫晶体蛋白全长基因被克隆,序列分析显示该基因的开放阅读框(ORF)为1902bps,编码由634个氨基酸组成的蛋白质,氨基酸序列与Cry2Aa1蛋白同源性为99.7%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Aa12。重组表达质粒pET-2Aa在E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有65kDa表达蛋白。生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对小菜蛾和二化螟具有杀虫活性,LC50分别为5.4μg/mL和22.3μg/mL。【结论】菌株Rpp39及从中分离克隆的cry2Aa12基因来自四川生态条件,丰富了菌株及基因的资源,在资源积累方面具有重要意义。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 鉴定 cry2aa12基因 克隆表达 杀虫活性
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与抗辐射性相关蛋白AA12相互作用蛋白的筛选
3
作者 薛恒钢 胡宝成 +3 位作者 刘爽 田媛 黄翠芬 王亚 《生物技术通讯》 CAS 2004年第5期460-463,共4页
将AA12基因克隆入酵母双杂交载体中,转化入酵母菌AH109,Western印迹检测其在酵母中的表达;将转化有AA12基因的酵母菌AH109培养再转化人前列腺cDNA文库质粒,检测报告基因的表达情况。Western印迹结果表明AA12可以在酵母菌AH109中表达。... 将AA12基因克隆入酵母双杂交载体中,转化入酵母菌AH109,Western印迹检测其在酵母中的表达;将转化有AA12基因的酵母菌AH109培养再转化人前列腺cDNA文库质粒,检测报告基因的表达情况。Western印迹结果表明AA12可以在酵母菌AH109中表达。共转化子中有2个β-半乳糖苷酶活性分析和α-半乳糖苷酶活性分析结果为阳性的克隆,但测序结果为相同序列。本实验筛选到1个与AA12相互作用的蛋白,此结果为进一步研究新基因AA12的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 AA 表达 WESTERN印迹 相关蛋白 相互作用蛋白 新基因 前列腺 酵母双杂交 共转化 酵母菌
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一种新的抗辐射性相关蛋白AA12和CHK1相互作用研究 被引量：7
4
作者 胡宝成 薛恒刚 +3 位作者 刘爽 田媛 黄翠芬 王亚 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2003年第5期345-348,366,共5页
目的 :研究AA12蛋白与CHK1蛋白的相互作用。方法 :用在大肠杆菌中表达纯化的AA12 (LG2 1)蛋白制备多克隆抗体 ,Western印迹检测抗体的特异性 ;用自制的抗体在A1_5和B4细胞中进行了免疫共沉淀实验 ;同时将AA12与Chk1基因克隆入酵母双杂... 目的 :研究AA12蛋白与CHK1蛋白的相互作用。方法 :用在大肠杆菌中表达纯化的AA12 (LG2 1)蛋白制备多克隆抗体 ,Western印迹检测抗体的特异性 ;用自制的抗体在A1_5和B4细胞中进行了免疫共沉淀实验 ;同时将AA12与Chk1基因克隆入酵母双杂交载体中 ,将重组质粒导入酵母菌AH10 9中 ,检测报告基因的表达情况。结果 :Western印迹结果表明该抗体可以与AA12蛋白特异结合 ;并用免疫共沉淀实验验证了AA12蛋白与CHK1蛋白在哺乳动物细胞体内的相互作用。同时用酵母双杂交实验验证了AA12蛋白与CHK1蛋白在酵母体内的相互作用 ,β_半乳糖苷酶活性分析和α_半乳糖苷酶活性分析结果均为阳性。结论 :AA12蛋白和CHK1蛋白之间存在相互作用 ,此结果为进一步研究新基因AA12的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 抗辐射性相关蛋白 AAL2 CHKl 相互作用 免疫共沉淀 酵母双杂交
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梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因的异源表达与生化鉴定 被引量：5
5
作者 刘天海 张强 +5 位作者 苗人云 唐杰 张小平 黄忠乾 彭卫红 谭昊 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1139-1151,共13页
典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族(auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA11家族),而AA12家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA12家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA1... 典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族(auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA11家族),而AA12家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA12家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA12家族酶基因,该基因编码的酶蛋白是否拥有漆酶功能尚未清楚。本研究主要从酶生化特性的角度,结合酶基因的表达规律,对该基因的功能进行初探。对该AA12家族基因在梯棱羊肚菌生长发育不同阶段的表达水平进行实时定量PCR检测;将该基因编码序列克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,层析获得纯化的酶蛋白,对酶蛋白的生化特性进行了鉴定。发现该AA12多铜氧化酶基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝里低表达,在菇原基和子实体中表达较活跃。异源表达获得纯化的酶蛋白分子量约64k Da,表现出亚铁氧化酶(EC1.16.3.1)与漆酶(EC1.10.3.2)双重活性。其亚铁氧化酶活性在pH4最高,漆酶活性在pH6最高。亚铁氧化酶活性与漆酶活性的最适温度均为30℃左右,在30℃温育16h后仍保留70%以上活性。亚铁氧化酶和漆酶活性受Mn^2+、Hg^2+和Pb^2+抑制。对蛋白质变性剂SDS、尿素的耐受性较强。本研究通过酶学证据证实了梯棱羊肚菌AA12家族多铜氧化酶基因编码的酶蛋白具有亚铁氧化酶-漆酶双重活性,系在子囊菌大型真菌中首次发现,为进一步研究铁元素代谢与漆酶活性在羊肚菌子实体形成与发育过程中的作用提供了启示。 展开更多
关键词 aa12家族 多铜氧化酶 异源表达纯化 漆酶活性 亚铁氧化酶活性
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