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重组腺病毒表达非洲猪瘟病毒pA104R蛋白免疫效果评价
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作者 卢会鹏 顾陈怡 +6 位作者 吴植 朱睿 曹世诺 雷昕诺 朱善元 孙怀昌 陈长春 《江苏农业科学》 北大核心 2025年第7期191-197,共7页
将非洲猪瘟病毒(ASFV)的pA104R基因与分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)基因融合,并利用BJ5183-AD-1重组菌将融合基因嵌入rAd5复制缺陷型腺病毒基因组,获得含有融合基因的重组腺病毒质粒pAd-A104R-Hsp70,并转染至HEK293A细胞,拯救重组腺病毒r... 将非洲猪瘟病毒(ASFV)的pA104R基因与分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)基因融合,并利用BJ5183-AD-1重组菌将融合基因嵌入rAd5复制缺陷型腺病毒基因组,获得含有融合基因的重组腺病毒质粒pAd-A104R-Hsp70,并转染至HEK293A细胞,拯救重组腺病毒rAd-A104R-Hsp70。通过免疫荧光和免疫印记对拯救的病毒进行鉴定。将重组腺病毒通过腹腔途径免疫小鼠,剂量为108 PFU/只,首免14 d后以相同的剂量和途径加强免疫1次。免疫后不同时间点采集血清和脾细胞,利用间接ELISA检测血清中针对pA104R的特异性抗体。在首免28 d后采集小鼠脾细胞,采用pA104R重组蛋白刺激小鼠脾细胞,检测脾细胞上清中的IL-4和IFN-γ含量。结果显示,将pAd-A104R-Hsp70腺病毒质粒转染HEK293A细胞5 d后,细胞出现变圆、聚集成葡萄串状病变。用rAd-A104R-Hsp70感染HEK293A细胞,能被ASFV抗体阳性血清识别,感染的细胞经免疫印记鉴定,显示在17 ku处有单一的目的条带,说明目的基因在细胞中稳定表达。小鼠首次免疫后14 d,通过间接ELISA检测到小鼠血清中针对pA104R蛋白的特异性抗体,D450 nm为0.38,加强免疫后14 d升至1.53,显著高于对照组(P<0.01)。pA104R蛋白刺激下小鼠的脾细胞上清中的IL-4(28.43 pg/mL)和IFN-γ(1281.67 pg/mL)细胞因子显著高于对照组(P<0.01)。本研究构建的融合Hsp70的pA104R重组腺病毒能有效激发小鼠的体液和细胞免疫反应,可为开发有效的ASFV疫苗提供理论支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 a104r 腺病毒载体 HSP70 细胞免疫反应
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非洲猪瘟病毒A104R蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定 被引量：4
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作者 蒋亚君 王召阳 +8 位作者 崔帅 王洋 鑫婷 郭晓宇 刘雪婷 陈世钰 房立春 朱鸿飞 贾红 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2022年第6期29-34,共6页
为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)重组蛋白A104R(rA104R)及研制抗rA104R的多克隆抗体,本研究通过ExPASy等在线生物信息学软件初步预测该蛋白的理化性质、信号肽、核定位信号等信息,继而合成ASFV的A104R基因,构建基于pET-28a(+)载体的原核表达... 为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)重组蛋白A104R(rA104R)及研制抗rA104R的多克隆抗体,本研究通过ExPASy等在线生物信息学软件初步预测该蛋白的理化性质、信号肽、核定位信号等信息,继而合成ASFV的A104R基因,构建基于pET-28a(+)载体的原核表达系统。重组蛋白用Ni亲和层析纯化后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blotting和液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术鉴定。纯化的蛋白免疫6~8周龄BALB/c小鼠,制备抗rA104R的多克隆抗体,通过Western blotting和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其反应性和免疫原性。结果显示,原核表达载体构建成功;重组菌在37℃诱导8 h后表达量最高,在包涵体和上清中均有表达,表明其呈部分可溶性表达;纯化的重组蛋白大小约16 kDa,且反应性良好;LC-MS分析结果显示,该rA104R蛋白多个肽段均与目标蛋白的氨基酸序列相匹配,匹配率为59%;制备的鼠源抗rA104R多克隆抗体效价大于1∶2048000,具有良好的免疫原性。结果表明,本研究制备的rA104R及其多克隆抗体可进一步用于生物学功能研究,并可为疫苗及相关诊断试剂研制提供基础材料。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 原核表达 a104r重组蛋白 液相色谱-质谱
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