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抗原85B抑制自噬促进霍奇金淋巴瘤小鼠肿瘤凋亡机制研究
1
作者 程永凤 沈亦平 +4 位作者 樊春艳 古丽巴哈·买买提 王学梅 李丹露 严媚 《新疆医科大学学报》 2025年第3期286-292,298,共8页
目的研究抗原85B(Antigen 85B,Ag85B)对霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)小鼠肿瘤生长、凋亡的作用及机制。方法取HDLM-2细胞,用杜氏改良鹰培养基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)调整细胞密度为5×10^(6)个/200μL备用... 目的研究抗原85B(Antigen 85B,Ag85B)对霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)小鼠肿瘤生长、凋亡的作用及机制。方法取HDLM-2细胞,用杜氏改良鹰培养基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)调整细胞密度为5×10^(6)个/200μL备用。取40只小鼠随机分为4组,小鼠左侧腋下酒精棉片擦拭消毒后给予接种相应试剂。Ⅰ组:接种DMEM基础培养基(200μL);Ⅱ组:接种Ag85B(每克小鼠接种4μg Ag85B,用DMEM基础培养基调整总液量为200μL);Ⅲ组:接种HDLM-2(5×10^(6)个/200μL);Ⅳ组:接种HDLM-2(5×10^(6)个/200μL)+Ag85B;(每克小鼠接种4μg Ag85B,直接混入HDLM-2细胞,维持总液量为200μL)。每日接种一次,连续接种3日。期间每日观察各组小鼠活动、精神状况,毛发和饮食饮水情况。实验第7天、第14天、第21天、第28天、第35天小鼠称重并测量肿瘤的长径及短径,肿瘤体积达到1000 mm3说明建模成功。第35天处死小鼠,剥离瘤体称重,测量肿瘤体积,计算抑瘤率。苏木精-伊红染色(Hematoxylin and Eosin,HE)比较I组、II组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织结构。取Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肿瘤组织进行后续检测比较,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测LC3、p62、Beclin-1、Caspase-3、Ki-67在肿瘤组织的定位及蛋白表达;免疫荧光检测Ki-67表达;TUNEL染色检测凋亡;透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)检测自噬体数量;实时荧光定量聚合酶链式反应法(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)分别检测LC3、p62、Beclin-1、PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白表达。结果各组小鼠体重随时间延长有下降趋势,各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅰ组、Ⅱ组小鼠毛发有光泽,精神尚可,活动正常,未见肿瘤生长。Ⅲ组、Ⅳ组小鼠精神萎靡、活动减少、毛发无光泽,有肿瘤生长。与Ⅲ组比较,Ⅳ组小鼠肿瘤体积较小,差异有统计学意义(P<0.05),Ag85B对肿瘤抑制率为20.53%。HE染色显示I组、II组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织结构和细胞形态无明显差异。与Ⅲ组比较,Ⅳ组小鼠LC3、Beclin-1、Ki-67抗原表达减低,p62、Caspase-3表达增强,差异有统计学意义(P<0.05);与Ⅲ组比较,Ⅳ组小鼠肿瘤Ki-67表达减低,差异有统计学意义(P<0.05);与Ⅲ组比较,Ⅳ组小鼠肿瘤凋亡增强,差异有统计学意义(P<0.05);与Ⅲ组比较,Ⅳ组小鼠肿瘤自噬体减少;与Ⅲ组比较,Ⅳ组小鼠肿瘤组织LC3、Beclin-1 mRNA及蛋白表达降低,p62、PI3K、AKT、mTOR mRNA及蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Ag85B可以抑制HL小鼠的肿瘤增长及增殖,促进肿瘤细胞凋亡,其机制与促进PI3K/AKT/mTOR通路、抑制自噬相关。 展开更多
关键词 霍奇金淋巴瘤 抗原85b 自噬 凋亡 增殖
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Ag85B通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制霍奇金淋巴瘤细胞自噬并促进凋亡
2
作者 程永凤 沈亦平 +5 位作者 樊春艳 王学梅 余霞 古丽巴哈·买买提 贾继鹏 严媚 《中国肿瘤外科杂志》 2025年第3期241-247,共7页
目的 探讨结核杆菌抗原Ag85B对霍奇金淋巴瘤(HL)细胞自噬和凋亡的影响以及机制。方法 将人HL细胞(L-428)分为5组:L-428组、L-428+Ag85B(Ag85B分别为1、2、4、8μg/mL)组。Western blot检测LC3、p62、Beclin-1、ATG14、PI3K、AKT、mTOR、... 目的 探讨结核杆菌抗原Ag85B对霍奇金淋巴瘤(HL)细胞自噬和凋亡的影响以及机制。方法 将人HL细胞(L-428)分为5组:L-428组、L-428+Ag85B(Ag85B分别为1、2、4、8μg/mL)组。Western blot检测LC3、p62、Beclin-1、ATG14、PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、PARP、Cleaved caspase-8蛋白在细胞中的表达;凋亡试剂盒检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期;透射电镜检测细胞自噬小体;qRT-PCR检测LC3、Beclin-1、caspase-8 mRNA在细胞中的表达。结果 L-428+Ag85B各组LC3蛋白在细胞中的表达低于L-428组,p62高于L-428组,且在Ag85B为4μg/mL差异最为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,Ag85B组中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR在细胞中的磷酸化蛋白表达比值高于L-428组,LC3、Beclin-1、ATG14蛋白低于L-428组,差异有统计学意义(P<0.05)。透射电镜结果显示,Ag85B组细胞自噬低于L-428组。细胞凋亡检测结果显示,Ag85B组细胞早期及晚期凋亡明显高于L-428组,差异有统计学意义(P<0.05);Cleaved caspase-8及PARP蛋白表达高于L-428组。细胞周期检测结果显示,Ag85B组细胞周期阻滞在S期,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,加入Ag85B后,p-mTOR蛋白表达增高;加入LY294002(PI3K/AKT抑制剂)后,p-mTOR蛋白表达降低,自噬相关LC3、Beclin-1 mRNA表达增高,凋亡相关caspase-8 mRNA表达减低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Ag85B可抑制HL细胞自噬,促进凋亡,阻滞细胞周期在S期。其抑制自噬和促进凋亡机制与促进PI3K/AKT/mTOR通路相关。 展开更多
关键词 霍奇金淋巴瘤 AG85b 自噬 凋亡 PI3K/AKT/MTOR
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副结核分枝杆菌85A、85B蛋白生物信息学特征及其原核表达
3
作者 平宇明 张宏莉 +7 位作者 王佳 李明鑫 李超 赵萍萍 王娅荣 张立华 李劼 常华 《福建农业学报》 北大核心 2025年第5期467-475,共9页
【目的】探究副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)85A和85B蛋白的生物信息学结构特征,通过原核表达技术获取两种蛋白,并评估其反应原性,从而为后续该菌ELISA检测试剂盒的研发及疫苗研究奠定基础。【方法】... 【目的】探究副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)85A和85B蛋白的生物信息学结构特征,通过原核表达技术获取两种蛋白,并评估其反应原性,从而为后续该菌ELISA检测试剂盒的研发及疫苗研究奠定基础。【方法】运用生物信息学在线分析平台对85A和85B蛋白的氨基酸序列展开分析,去除跨膜区和信号肽结构,进行密码子优化,成功构建pET-30a-MAP-85A和pET-30a-MAP-85B重组质粒。以BL21(DE3)作为表达菌株进行原核表达,优化诱导表达的温度、IPTG浓度及诱导时间;对诱导表达蛋白进行可溶性分析,利用镍柱进行纯化;用Western blotting技术评估重组蛋白的免疫反应性。【结果】成功获得重组85A蛋白,其分子量约为31.3 kDa,在37℃、IPTG终浓度1.0 mmol·L^(-1)诱导4 h,可达到最佳表达效果;重组85B蛋白分子量为31.8 kDa,在37℃、IPTG终浓度0.8 mmol·L^(-1)诱导6 h表达量最好。两种重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍离子柱纯化后获得高纯度目标蛋白。以MAP阳性牛血清为一抗,对纯化后蛋白进行Western blotting检测,结果显示特异性条带,充分证实85A和85B重组蛋白具备良好的免疫反应性。【结论】研究成功实现副结核分枝杆菌重组85A和85B蛋白的高效表达,且有较好的免疫反应性,为该菌免疫学检测技术的开发提供重要的理论基础。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 原核表达 85A 85b
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结核杆菌抗原85B抑制自噬促进霍奇金淋巴瘤细胞凋亡机制研究 被引量：1
4
作者 程永凤 沈亦平 +4 位作者 王学梅 李丹露 樊春艳 古丽巴哈·买买提 严媚 《中国当代儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期1218-1224,共7页
目的探讨结核杆菌抗原85B(mycobacterial antigen 85B,Ag85B)抑制自噬促进霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)细胞凋亡及机制。方法回顾性收集新疆医科大学第一附属医院收治的80例HL及同期30例淋巴结反应性增生患儿(对照组)临床资料及... 目的探讨结核杆菌抗原85B(mycobacterial antigen 85B,Ag85B)抑制自噬促进霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)细胞凋亡及机制。方法回顾性收集新疆医科大学第一附属医院收治的80例HL及同期30例淋巴结反应性增生患儿(对照组)临床资料及病理组织切片。采用免疫组化分析微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、自噬降解底物蛋白1(sequestosome 1,P62/SQSTM1)、Beclin-1在HL及对照组患儿病理组织中的表达。将人霍奇金淋巴瘤细胞(HDLM-2)分为HDLM-2组、HDLM-2+结核杆菌抗原85B(mycobacterial antigen 85B,Ag85B)组(Ag85B分别为0.5、1、2、4μg/mL)。采用CCK8法检测HDLM-2细胞增殖;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测LC3、P62、Beclin-1、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)mRNA的表达;凋亡试剂盒检测细胞凋亡。结果HL组LC3、Beclin-1阳性表达高于对照组(P<0.05),P62阳性表达低于对照组(P<0.05);Ⅲ~Ⅳ期较Ⅰ~Ⅱ期LC3、Beclin-1阳性表达增高,P62阳性表达降低(P<0.05)。细胞实验结果显示,HDLM-2+Ag85B组与HDLM-2组比较,细胞增殖受抑,LC3和Beclin1的mRNA表达减低,P62、PI3K、Akt和mTOR的mRNA表达增高,细胞凋亡增加,且在Ag85B为2μg/mL时,Ag85B干预HDLM-2细胞24 h作用最强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论自噬在HL患儿中增强,且随疾病的分期增加而增强;Ag85B可抑制HL肿瘤细胞增殖及自噬,促进细胞凋亡,其机制可能与促进PI3K/Akt/mTOR通路相关。 展开更多
关键词 霍奇金淋巴瘤 结核杆菌抗原85b 自噬 凋亡 人霍奇金淋巴瘤细胞
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老年COPD患者合并结核分枝杆菌感染的危险因素及IFN-γ、sIL-2R、Ag85B水平变化 被引量：3
5
作者 吴秋静 史可云 +3 位作者 胡杰 陈芸 谢婧 徐晓娟 《中华医院感染学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1336-1339,共4页
目的探讨老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并结核分枝杆菌感染的危险因素及对γ-干扰素(IFN-γ)、可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)、抗原85B(Ag85B)水平的影响。方法选取2018年8月-2023年5月宜兴市人民医院收治的104例老年COPD合并结核分... 目的探讨老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并结核分枝杆菌感染的危险因素及对γ-干扰素(IFN-γ)、可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)、抗原85B(Ag85B)水平的影响。方法选取2018年8月-2023年5月宜兴市人民医院收治的104例老年COPD合并结核分枝杆菌感染患者为研究组,随机选取同期104例单纯COPD患者为对照组,分析老年COPD患者合并结核分枝杆菌感染的危险因素,检测两组患者血清IFN-γ、sIL-2R、Ag85B表达水平。结果多因素Logistic回归分析结果显示,年龄大、吸烟史、粉尘暴露史、吸入糖皮质激素、营养不良均是老年COPD患者合并结核分枝杆菌感染的危险因素(OR=1.992、2.092、2.162、1.964、2.132;P<0.05);研究组血清IFN-γ、sIL-2R、Ag85B水平均高于对照组(P<0.05),且随结核病变程度加重而上升(P<0.05)。结论老年COPD合并结核分枝杆菌感染与年龄、吸烟史、粉尘暴露史、吸入糖皮质激素及营养不良等密切相关,并导致血清IFN-γ、sIL-2R、Ag85B水平升高,且随结核病变程度加重而上升。 展开更多
关键词 慢性阻塞性肺疾病 结核分枝杆菌 Γ-干扰素 可溶性白细胞介素-2受体 抗原85b
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结核分枝杆菌Ag85B蛋白对小鼠溃疡性结肠炎的作用及其机制
6
作者 王婧 姚思 +5 位作者 杨雨欣 王天松 马梦蝶 张炜 万巧凤 马锐 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第12期1441-1446,共6页
目的 探讨结核分枝杆菌Ag85B蛋白诱导的免疫效应对小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的作用及机制,为Ag85B的临床应用及其进一步研究提供参考。方法 构建真核表达质粒pcDNA 3.1(+)Rv1886c,将其转染至CHO-K1细胞并检测Ag85B蛋白... 目的 探讨结核分枝杆菌Ag85B蛋白诱导的免疫效应对小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的作用及机制,为Ag85B的临床应用及其进一步研究提供参考。方法 构建真核表达质粒pcDNA 3.1(+)Rv1886c,将其转染至CHO-K1细胞并检测Ag85B蛋白的表达情况。雌性C57BL/6J小鼠连续7 d饮用3%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)制备UC模型后,随机选取6只小鼠作为正常对照组,其余小鼠随机分为UC模型及Ag85B治疗组,每组6只,治疗组小鼠经肌内注射pcDNA 3.1(+)Rv1886c(100μg/只),UC模型组小鼠肌内注射等量pcDNA 3.1(+)空质粒,每周1次,共3次;初免后第21天,经小鼠眼眶采血后断颈处死小鼠,摘取脾脏,分离并铺平肠管,截取结肠。测量小鼠结肠长度,HE染色法观察小鼠结肠组织结构,Western blot法检测结肠闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、闭锁蛋白(occludin)的表达;ELISA法检测血清促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-18含量;流式细胞术检测小鼠脾脏滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)、滤泡调节性T细胞(follicular regulatory T cell,Tfr)比例。结果 真核表达质粒pcDNA 3.1(+)Rv1886c经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的Ag85B蛋白相对分子质量约35 000,大小与预期相符。与UC模型组比较,Ag85B治疗组结肠长度增加(t=3.26,P <0.01),结肠黏膜相对完好,炎性渗出减轻,结肠组织ZO-1、occludin蛋白表达增加(t分别为10.86和9.22,P均<0.05);血清TNF-α、IL-1β及IL-18表达降低(t分别为3.25、3.11和2.86,P均<0.05),Tfh占比下调(t=3.70,P <0.05),Tfr占比上调(t=5.24,P <0.01)。结论 Ag85B蛋白诱导的免疫效应对DSS诱导的UC有一定缓解作用,可能与其调节Tfh、Tfr细胞平衡相关。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 溃疡性结肠炎 AG85b 真核表达质粒 肠道屏障 滤泡辅助性T细胞 滤泡调节性T细胞
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重组结核分枝杆菌Ag85b蛋白原液纯度反向高效液相色谱检测方法的建立及验证
7
作者 金丽婷 黄岳 +4 位作者 张素勤 肖文俊 朱克骏 张健 江秋虹 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第1期86-91,共6页
目的 建立检测重组结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85b蛋白原液纯度的反向高效液相色谱法,并进行验证。方法 设计4因素3水平正交试验,将面积、拖尾因子、峰面积、峰面积RSD作为评价指标进行分析,摸索最适检测条件,并依... 目的 建立检测重组结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85b蛋白原液纯度的反向高效液相色谱法,并进行验证。方法 设计4因素3水平正交试验,将面积、拖尾因子、峰面积、峰面积RSD作为评价指标进行分析,摸索最适检测条件,并依据《中国药典》四部(2020版)9101药品质量标准分析方法验证指导原则进行专属性、线性范围、精密度、耐用性等验证。结果 当检测条件为有机相洗脱比例30%~95%、检测温度35℃、进样量3μg、95%有机相洗脱时间15 min时,各评价指标结果均较好,在该检测条件下线性相关系数(R2)为0.998 5,线性范围为1.8~4.2μg;重复性RSD为0.01%;中间精密度RSD为0.16%;在柱温与流速细微变动下均具有良好的耐用性。结论 建立了重组MTBAg85b蛋白原液纯度检测的反向高效液相色谱法,该方法专属性强,精密度、耐用性好,可用于重组MTBAg85b蛋白原液质量控制。 展开更多
关键词 反向高效液相色谱法 结核分枝杆菌 Ag85b蛋白 纯度
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牛分枝杆菌Ag85B的生物信息学分析及多表位候选抗原的构建
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作者 董希望 张岩 +4 位作者 魏稚彤 李文欣 刘思宇 梁栋 赵海涛 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第15期62-65,72,118,119,共7页
为了构建基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,试验采用生物信息学方法对Ag85B蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构等进行分析,预测其T、B淋巴细胞抗原表位,并构建以pET-28a(+)为载体的多表位候选抗原,分析预测多表位候选抗原的... 为了构建基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,试验采用生物信息学方法对Ag85B蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构等进行分析,预测其T、B淋巴细胞抗原表位,并构建以pET-28a(+)为载体的多表位候选抗原,分析预测多表位候选抗原的理化性质、抗原性并进行免疫模拟。结果表明:Ag85B蛋白有325个氨基酸残基,相对分子量为34.58085,理论等电点为5.62,脂肪系数为72.18,亚细胞定位于线粒体、细胞质和高尔基体中,具有亲水性、信号肽和跨膜结构域,属于分泌型蛋白,其无规则卷曲和β-转角结构的占比分别28.15%和8.62%,含有3个T淋巴细胞优势表位和8个B淋巴细胞优势表位。构建的Ag85B多表位候选抗原为亲水性蛋白和非致敏原,两次预测免疫原性参数分别为0.893和1.524,可诱导特异性的体液和细胞免疫应答。说明试验成功构建出基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,且该多表位候选抗原可能诱导机体产生T、B淋巴细胞免疫应答。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 抗原表位 AG85b 生物信息学 多表位候选抗原
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结核分枝杆菌85B基因原核表达及间接ELISA方法的建立
9
作者 石洁 朱岩昆 +3 位作者 马晓光 王少华 李辉 邢进 《中国卫生检验杂志》 CAS 2015年第15期2449-2452,共4页
目的原核表达结核分枝杆菌85B融合蛋白,建立该抗原对结核病患者诊断的ELISA方法。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中进行PCR扩增85B基因并构建至表达载体p GEX4T-1上。原核表达GST-85B融合蛋白,并通过包涵体... 目的原核表达结核分枝杆菌85B融合蛋白,建立该抗原对结核病患者诊断的ELISA方法。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中进行PCR扩增85B基因并构建至表达载体p GEX4T-1上。原核表达GST-85B融合蛋白,并通过包涵体对其进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化得到可溶性的目的蛋白。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白,ELISA检测表达融合蛋白的抗原性。结果扩增出了结核分枝杆菌85B基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体p GEX4T-85B,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。将包涵体变性、复性后用GST亲和层析纯化,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-85B融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 85b基因 抗原85b 原核表达
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结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫 被引量：22
10
作者 范雄林 徐志凯 +4 位作者 李元 薛莹 张芳琳 李别虎 白光春 《第四军医大学学报》 北大核心 2001年第14期1282-1286,共5页
目的　研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法　以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RN... 目的　研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法　以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RNA的表达 .将 p TB30 m质粒肌注免疫 BAL B/c和 C5 7BL /6小鼠 ,EL ISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,生物学方法检测 IFNγ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 RT- PCR检测证实 p TB30 m可在 CHO细胞中表达 .p TB30 m免疫小鼠可引起较高水平的 Ag85 B特异性的抗体应答 .免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞增殖显著 ,BAL B/c和 C5 7BL/6小鼠 IFNγ的量分别达到 136 0 ng· L- 1 和 196 5 ng· L- 1 ,而生理盐水和空质粒对照组均低于 80 ng· L- 1 .结论　应进一步研究 p TB30 m作为TB的基因疫苗用于 TB的防治的效果 . 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 DNA疫苗 免疫原性 AG85b
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结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建 被引量：11
11
作者 范雄林 徐志凯 +3 位作者 白光春 李元 李别虎 薛莹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期314-316,共3页
目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体 pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,... 目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体 pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3的相应酶切位点。结果结核分枝杆菌H37Ra株Ag85B成熟蛋白的编码基因经序列测定证实 ,与Erdman株完全一致 ;用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实 ,克隆基因正确插入载体pcDNA3。结论以Ag85B成熟蛋白的编码基因为基础的真核表达载体的构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85b 真核表达载体 基因克隆
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结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究 被引量：8
12
作者 范雄林 徐志凯 +5 位作者 李元 李别虎 薛莹 柏银兰 白光春 贾向志 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期90-92,共3页
目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱... 目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85b 基因疫苗 免疫保护作用
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结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力 被引量：11
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作者 师长宏 范雄林 +3 位作者 柏银兰 薛莹 张海 徐志凯 《第四军医大学学报》 北大核心 2004年第18期1633-1636,共4页
目的 :研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力 .方法 :采用皮下包埋的方法 ,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3次 ,每次间隔 2wk,用MTB培养上清滤液蛋白 (culturefiltrat... 目的 :研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力 .方法 :采用皮下包埋的方法 ,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3次 ,每次间隔 2wk,用MTB培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins,CFP)作为抗原 ,ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度 .为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答 ,最后一次免疫完成后 4wk ,取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞 ,体外用抗原刺激 ,MTT法检测淋巴细胞刺激反应 ,ELISA检测悬液中IFN γ水平 .另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv ,4wk后计数脾脏细菌负荷数 .结果 :Ag85B ESAT6蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶10 0 0 ,ESAT6 Ag85B蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶5 0 0 0 .融合蛋白Ag85B ESAT6和ESAT6 Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为 2 .4 0± 0 .17和 2 .6 0± 0 .2 5 ,而生理盐水组只有 0 .90± 0 .2 1;相对应的IFN γ含量分别为 (3.5 1± 0 .30 ) μg/L和 (4 .0 5± 0 .4 1) μg/L ,显著高与生理盐水对照组 (0 .5 0± 0 .2 5 ) μg/L ,P <0 .0 5 ,但不及BCG免疫组 (5 .5 5±0 .31) μg/L .与生理盐水免疫组 (细菌负荷6 .31± 0 .13)相比较 ,融合蛋白免疫的BALB/c小鼠 。 展开更多
关键词 分支杆菌 结核 疫苗 抗原85b ESAT6 重组融合蛋白质类
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T-bet佐剂对Ag85B抗结核DNA疫苗的免疫调节 被引量：7
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作者 陈丽萍 张荣波 +5 位作者 胡东 吴静 张金凤 吴汉霞 李昕 牛凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期680-683,共4页
目的:构建以Th1转录因子T-bet为基因佐剂的Ag85B新型DNA疫苗,并研究其免疫调控作用。方法:RT-PCR法扩增出Ag85B基因和T-bet基因,克隆入pcDNA3.1质粒构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞系,Western blot法... 目的:构建以Th1转录因子T-bet为基因佐剂的Ag85B新型DNA疫苗,并研究其免疫调控作用。方法:RT-PCR法扩增出Ag85B基因和T-bet基因,克隆入pcDNA3.1质粒构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞系,Western blot法检测质粒蛋白表达情况。3次肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后,ELISA法检测血清中抗Ag85B抗体滴度。同时将脾脏淋巴细胞悬液于Ag85B刺激下培养,ELISA法检测培养液中细胞因子分泌情况。结果:质粒蛋白成功表达,并且质粒剂量与质粒蛋白表达水平呈正相关。此外,T-bet/Ag85B不仅诱导IgG2a滴度显著增高伴随IgG1显著降低,而且还刺激IL-2/IFN-γ(Th1类)分泌增加伴随IL-4/IL-10(Th2类)减少。结论:T-bet增强抗Ag85B特异性IgG2a抗体反应,并诱导显著的Th1细胞优势免疫。 展开更多
关键词 T—bet AG85b 疫苗 结核 免疫调节
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结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达 被引量：13
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作者 江山 朱道银 +2 位作者 蒋英 骆旭东 陈全 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第21期1973-1975,共3页
目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达... 目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达质粒 pCDAg85B A ,酶切、DNA测序鉴定 ,用脂质体法将 pCDAg85B A转染COS 7细胞 ,采用RT PCR ,ELISA方法检测其表达 .结果 :Ag85B Ag85A融合基因定向克隆入pcDNA3.1 (+) ,双向测序表明碱基无突变 ,Ag85B Ag85A融合基因在真核细胞中能表达 .结论 :成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85b AG85A 融合基因 双抗原融合真核表达质粒 基因表达
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Ag85A和Ag85B DNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果 被引量：5
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作者 刘晶 韩国梁 +3 位作者 杨晓峰 田平贵 王鹏 张晓俊 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2008年第2期144-149,共6页
目的:探讨Ag85A和Ag85BDNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果。方法:致癌剂N-甲基亚硝基脲(methyl nitrosourea,MNU)膀胱灌注雌性Wistar大鼠制备膀胱癌模型。将建模成功的48只大鼠随机分为生理盐水组、空白质粒组、卡介苗组、Ag85A DNA疫... 目的:探讨Ag85A和Ag85BDNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果。方法:致癌剂N-甲基亚硝基脲(methyl nitrosourea,MNU)膀胱灌注雌性Wistar大鼠制备膀胱癌模型。将建模成功的48只大鼠随机分为生理盐水组、空白质粒组、卡介苗组、Ag85A DNA疫苗组、Ag85B DNA疫苗组、Ag85A+Ag85B DNA疫苗组(每组各8只),建模后第7、14、21天于大鼠右后肢肌内注射相应药物。第28天处死大鼠,流式细胞仪检测各组大鼠脾脏细胞的CD4+和CD8+T细胞亚群数量并计算CD4+/CD8+比值;ELISA法检测大鼠血清中IFN-γ分泌水平;剥离膀胱肿瘤进行组织病理学检查。结果:成功建立大鼠膀胱癌模型,致瘤率100%。经疫苗治疗后,Ag85A组、Ag85B组和Ag85A+Ag85B组膀胱肿瘤体积均有所减小、病理分级也有所减轻,但效果不及卡介苗组。Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组和卡介苗组CD4+T细胞亚群数量分别为(17.27±2.95)%、(23.15±1.56)%、(30.80±1.83)%、(38.05±1.48)%;CD8+ T细胞亚群数量分别为(9.03±1.06)%、(10.28±0.39)、(11.29±0.74)、(13.14±1.24);CD4+/CD8+比值分别为(1.90±0.10)、(2.25±0.08)、(2.73±0.19)、(2.97±0.23);血清IFN-γ含量分别为(96.94±12.38)、(131.03±26.68)、(179.20±28.88)、(240.53±32.17)pg/ml;与生理盐水、空白质粒组相比,Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组能够显著提高以上4项检测指标(P<0.01),但均低于卡介苗组;Ag85A+Ag85B组效果强于Ag85B组、更强于Ag85A组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:应用Ag85A和Ag85BDNA疫苗均可提高膀胱癌大鼠的免疫功能,其效果为Ag85A+Ag85B>Ag85B>Ag85A,但总体上都达不到卡介苗的抗癌免疫效果。 展开更多
关键词 膀胱癌 DNA疫苗 AG85A AG85b 卡介苗
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结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究 被引量：6
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作者 刘建利 师长宏 +3 位作者 靳亚平 张海 赵勇 赵雷 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期449-452,共4页
目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的... 目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。 展开更多
关键词 AG85b ESAT6 柔性链 融合蛋白 原核表达 纯化
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结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察 被引量：5
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作者 骆旭东 朱道银 +2 位作者 陈全 蒋英 江山 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期592-594,共3页
目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.... 目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85b MPT64 融合基因 DNA疫苗
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Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究 被引量：7
19
作者 呼西旦 蔡宏 +2 位作者 李淑霞 田霞 朱玉贤 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第5期365-368,共4页
扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴... 扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌病 Ag85b分泌蛋白抗原 核酸疫苗 免疫原性 保护效率
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结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性 被引量：7
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作者 薛莹 李元 +5 位作者 史皆然 师长宏 李别虎 范雄林 柏银兰 马文煜 《第四军医大学学报》 北大核心 2002年第13期1203-1205,共3页
目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法　用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水... 目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法　用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论　Ag85 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 结核病 结核疫苗 MTT法 Ag85b蛋白 免疫学
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