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副结核分枝杆菌85A、85B蛋白生物信息学特征及其原核表达
1
作者 平宇明 张宏莉 +7 位作者 王佳 李明鑫 李超 赵萍萍 王娅荣 张立华 李劼 常华 《福建农业学报》 北大核心 2025年第5期467-475,共9页
【目的】探究副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)85A和85B蛋白的生物信息学结构特征,通过原核表达技术获取两种蛋白,并评估其反应原性,从而为后续该菌ELISA检测试剂盒的研发及疫苗研究奠定基础。【方法】... 【目的】探究副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)85A和85B蛋白的生物信息学结构特征,通过原核表达技术获取两种蛋白,并评估其反应原性,从而为后续该菌ELISA检测试剂盒的研发及疫苗研究奠定基础。【方法】运用生物信息学在线分析平台对85A和85B蛋白的氨基酸序列展开分析,去除跨膜区和信号肽结构,进行密码子优化,成功构建pET-30a-MAP-85A和pET-30a-MAP-85B重组质粒。以BL21(DE3)作为表达菌株进行原核表达,优化诱导表达的温度、IPTG浓度及诱导时间;对诱导表达蛋白进行可溶性分析,利用镍柱进行纯化;用Western blotting技术评估重组蛋白的免疫反应性。【结果】成功获得重组85A蛋白,其分子量约为31.3 kDa,在37℃、IPTG终浓度1.0 mmol·L^(-1)诱导4 h,可达到最佳表达效果;重组85B蛋白分子量为31.8 kDa,在37℃、IPTG终浓度0.8 mmol·L^(-1)诱导6 h表达量最好。两种重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍离子柱纯化后获得高纯度目标蛋白。以MAP阳性牛血清为一抗,对纯化后蛋白进行Western blotting检测,结果显示特异性条带,充分证实85A和85B重组蛋白具备良好的免疫反应性。【结论】研究成功实现副结核分枝杆菌重组85A和85B蛋白的高效表达,且有较好的免疫反应性,为该菌免疫学检测技术的开发提供重要的理论基础。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 原核表达 85a 85B
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结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达 被引量：13
2
作者 江山 朱道银 +2 位作者 蒋英 骆旭东 陈全 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第21期1973-1975,共3页
目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达... 目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达质粒 pCDAg85B A ,酶切、DNA测序鉴定 ,用脂质体法将 pCDAg85B A转染COS 7细胞 ,采用RT PCR ,ELISA方法检测其表达 .结果 :Ag85B Ag85A融合基因定向克隆入pcDNA3.1 (+) ,双向测序表明碱基无突变 ,Ag85B Ag85A融合基因在真核细胞中能表达 .结论 :成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85B AG85a 融合基因 双抗原融合真核表达质粒 基因表达
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Ag85A和Ag85B DNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果 被引量：5
3
作者 刘晶 韩国梁 +3 位作者 杨晓峰 田平贵 王鹏 张晓俊 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2008年第2期144-149,共6页
目的:探讨Ag85A和Ag85BDNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果。方法:致癌剂N-甲基亚硝基脲(methyl nitrosourea,MNU)膀胱灌注雌性Wistar大鼠制备膀胱癌模型。将建模成功的48只大鼠随机分为生理盐水组、空白质粒组、卡介苗组、Ag85A DNA疫... 目的:探讨Ag85A和Ag85BDNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果。方法:致癌剂N-甲基亚硝基脲(methyl nitrosourea,MNU)膀胱灌注雌性Wistar大鼠制备膀胱癌模型。将建模成功的48只大鼠随机分为生理盐水组、空白质粒组、卡介苗组、Ag85A DNA疫苗组、Ag85B DNA疫苗组、Ag85A+Ag85B DNA疫苗组(每组各8只),建模后第7、14、21天于大鼠右后肢肌内注射相应药物。第28天处死大鼠,流式细胞仪检测各组大鼠脾脏细胞的CD4+和CD8+T细胞亚群数量并计算CD4+/CD8+比值;ELISA法检测大鼠血清中IFN-γ分泌水平;剥离膀胱肿瘤进行组织病理学检查。结果:成功建立大鼠膀胱癌模型,致瘤率100%。经疫苗治疗后,Ag85A组、Ag85B组和Ag85A+Ag85B组膀胱肿瘤体积均有所减小、病理分级也有所减轻,但效果不及卡介苗组。Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组和卡介苗组CD4+T细胞亚群数量分别为(17.27±2.95)%、(23.15±1.56)%、(30.80±1.83)%、(38.05±1.48)%;CD8+ T细胞亚群数量分别为(9.03±1.06)%、(10.28±0.39)、(11.29±0.74)、(13.14±1.24);CD4+/CD8+比值分别为(1.90±0.10)、(2.25±0.08)、(2.73±0.19)、(2.97±0.23);血清IFN-γ含量分别为(96.94±12.38)、(131.03±26.68)、(179.20±28.88)、(240.53±32.17)pg/ml;与生理盐水、空白质粒组相比,Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组能够显著提高以上4项检测指标(P<0.01),但均低于卡介苗组;Ag85A+Ag85B组效果强于Ag85B组、更强于Ag85A组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:应用Ag85A和Ag85BDNA疫苗均可提高膀胱癌大鼠的免疫功能,其效果为Ag85A+Ag85B>Ag85B>Ag85A,但总体上都达不到卡介苗的抗癌免疫效果。 展开更多
关键词 膀胱癌 DNA疫苗 AG85a AG85B 卡介苗
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结核杆菌分泌蛋白Ag85A基因的克隆、表达及其诊断价值 被引量：7
4
作者 吴雪琼 张俊仙 +5 位作者 王安生 张妍 周文强 郑冬燕 何菊芳 张涛 《广东医学》 CAS CSCD 2002年第12期1258-1259,共2页
目的获得重组抗原85A(rAg85A),研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法应用基因工程技术克隆、表达、纯化Ag85A蛋白,通过Western印迹分析其抗原性。分别以结核分支杆菌纯蛋白衍生物(PPD)或纯化的rAg85A蛋白为抗原,通... 目的获得重组抗原85A(rAg85A),研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法应用基因工程技术克隆、表达、纯化Ag85A蛋白,通过Western印迹分析其抗原性。分别以结核分支杆菌纯蛋白衍生物(PPD)或纯化的rAg85A蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果重组质粒pET30a-Ag85A测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的2％左右,Western印迹分析它与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化的rAg85A样品纯度约85％左右,每100 ml培养菌可获得2 mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值+2s为正常界限值,一步法的特异性和敏感性分别为87.9％和65.6％;PPD分别为93.9％和62.5％;rAg85A分别为93.9％和15.6％。结论pET30a-Ag85A大肠杆菌工程菌能以包涵体形式表达rAg85A蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性,但检测抗结核抗体的灵敏度低。 展开更多
关键词 克隆 诊断 抗原 Ag85a基因 结核分支杆菌 基因表达 结核病 酶联免疫吸附试验
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结核杆菌Ag85A和mGM-CSF共同表达载体的构建与CTL活性的诱导 被引量：5
5
作者 陈峻崧 窦骏 +4 位作者 赵枫姝 陈国兵 房雪峰 洪晓武 唐权 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期399-403,共5页
构建、鉴定结核杆菌Ag85A和细胞因子GM CSF共同表达质粒 ,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。先从质粒pBSby5中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pIRES上成为pI85A ,用PCR方法从pc mGM CSF质粒中扩增出mGM CSF ,构建于pI... 构建、鉴定结核杆菌Ag85A和细胞因子GM CSF共同表达质粒 ,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。先从质粒pBSby5中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pIRES上成为pI85A ,用PCR方法从pc mGM CSF质粒中扩增出mGM CSF ,构建于pI85A质粒上 ,成为共同表达质粒pI85AGM。然后转染 772 1细胞 ,进行蛋白的表达和鉴定。结果经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。通过RT PCR、SDS PAGE、Westernblot检测证实Ag85A与mGM CSF基因的转录和蛋白表达正确。Ag85A与mGM CSF免疫组小鼠的CTL活性明显增强。表明细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A共同表达载体构建成功 ,并能诱导小鼠的CTL活性 。 展开更多
关键词 结核杆菌 GM-CSF 抗原85a 重组质粒 基因疫苗
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细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体的构建与鉴定 被引量：6
6
作者 陈峻崧 窦骏 +1 位作者 洪晓武 陈国兵 《东南大学学报（医学版）》 CAS 2003年第4期232-235,共4页
目的 :构建并鉴定细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A融合表达质粒 ,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法 :用PCR方法从pc mGM CSF质粒中扩增出GM CSF ,构建于pcDNA3 1质粒上 ,成为pcDNA3 1 GM CSF。从结核杆菌H3 7Rv基因组中扩... 目的 :构建并鉴定细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A融合表达质粒 ,为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法 :用PCR方法从pc mGM CSF质粒中扩增出GM CSF ,构建于pcDNA3 1质粒上 ,成为pcDNA3 1 GM CSF。从结核杆菌H3 7Rv基因组中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pcDNA3 1 GM CSF上 ,将基因GM CSF的 3′端与基因Ag85A的 5′端直接连接构建融合表达质粒pcGM85A。结果 :经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。结论 :细胞因子GM CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体构建成功 ,为研制新型结核病基因疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 细胞因子 GM-CSF 结核杆菌 AG85a 融合表达载体 质粒 DNA 结核 基因疫苗
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独立表达Ag85A与ESAT6的抗结核DNA疫苗的构建 被引量：4
7
作者 张雷 杨小康 +5 位作者 胡东 吴静 王文洋 杜久伟 许礼发 张荣波 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第20期3102-3104,共3页
目的以pIRES为载体建立可同时独立表达Ag85A与ESAT6两种抗原的抗结核二价疫苗,探究疫苗剂量对质粒基因体外表达水平的影响。方法 PCR扩增获得Ag85A基因和ESAT6基因,分别插入pIRES质粒的多克隆位点A和B,构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒。... 目的以pIRES为载体建立可同时独立表达Ag85A与ESAT6两种抗原的抗结核二价疫苗,探究疫苗剂量对质粒基因体外表达水平的影响。方法 PCR扩增获得Ag85A基因和ESAT6基因,分别插入pIRES质粒的多克隆位点A和B,构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒。脂质体2000将重组质粒转入RAW264.7细胞系,Western blot法检测目的蛋白的表达水平。结果成功构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒,在转染后的RAW264.7细胞同时高表达Ag85A与ESAT6,其表达水平与转染的剂量呈正相关。结论 pIRES-Ag85A-ESAT6二价疫苗的构建将为基于多个抗原同时独立表达的新型多价疫苗设计提供了思路。 展开更多
关键词 多价疫苗 结核分枝杆菌 AG85a ESAT6
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结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性 被引量：5
8
作者 邓毛子 石春薇 +4 位作者 王芳 付瑞玲 王春 方正明 范雄林 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2010年第2期117-121,共5页
目的通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白。方法用PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达。用镍纯化系统纯化重组... 目的通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白。方法用PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达。用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性。利用PCR技术鉴定fbpA基因在不同分枝杆菌的分布。结果32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化。表达Ag85A蛋白的fbpA基因在结核分枝杆菌H37Rv、H37Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达。结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度最高。结论重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85a 原核表达 纯化 免疫反应性
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传统 BCG 初免 IL-12联合 Ag85A DNA 疫苗加强序贯免疫小鼠效果观察 被引量：2
9
作者 王婵 王新敏 +6 位作者 季榕 张宇晴 王飞雨 吴江东 吴芳 张万江 章乐 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期997-1001,1008,共6页
目的探讨BCG初次免疫,IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强免疫对小鼠的免疫效果。方法实验小鼠随机分为7组,即PBS阴性对照组、BCG组、pcAg85A组、BCG初免pcAg85A加强免疫组、BCG初免pcAg85A联合IL-12加强免疫组、BCG初免IL-12加强... 目的探讨BCG初次免疫,IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强免疫对小鼠的免疫效果。方法实验小鼠随机分为7组,即PBS阴性对照组、BCG组、pcAg85A组、BCG初免pcAg85A加强免疫组、BCG初免pcAg85A联合IL-12加强免疫组、BCG初免IL-12加强免疫组、以及BCG初免pcDNA3.1加强免疫组。按BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA加强的免疫程序进行免疫实验,在末次免疫后的4、6、8周通过检测小鼠血清总IgG抗体、特异性淋巴细胞增殖,细胞因子的水平,观测对小鼠的免疫效果。结果采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强的免疫策略组的小鼠与其它免疫方式组相比,IgG明显升高(P<0.05)、特异性淋巴细胞明显增殖,加强免疫后IFN-γ水平、IL-2水平、IL-4水平BCG/Ag85A+IL-12组在3个时间段分别为128.2±20.4、190.2±16.51、244.2±39.14;146.2±17.29、271.6±16.36、419.3±28.12;68.6±6.62、96.6±5.5、117.4±10.71均高于其它各组(P<0.05)。结论采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85ADNA疫苗加强的免疫能明显增强机体体液和细胞免疫,为进一步在动物体内进行保护性效应试验的研究提供了依据。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 序贯免疫策略 AG85a BCG 白介素-12
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结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究 被引量：3
10
作者 陈海文 王子明 +5 位作者 范雄林 石涛 秦兆寅 贺大林 李元 徐志凯 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期416-419,共4页
目的　构建编码结核分枝杆菌蛋白Ag85A基因为基础的DNA疫苗。 方法　采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因组中 ,扩增出分泌蛋白Ag85A成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后 ,插入克隆载体 pGEM TEasy中。经酶切鉴定与序列测定证... 目的　构建编码结核分枝杆菌蛋白Ag85A基因为基础的DNA疫苗。 方法　采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因组中 ,扩增出分泌蛋白Ag85A成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后 ,插入克隆载体 pGEM TEasy中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3.1的相应酶切位点。重组质粒肌注免疫小鼠 ,4周后用ELISA法检测抗体滴度。结果　结核分枝杆菌H37Rv株Ag85A成熟蛋白的编码基因经序列测定证实无突变 ;经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定证实克隆基因正确插入载体 pcDNA3.1。ELISA法检测几何平均滴度为 1∶10 0 0。结论　以Ag85A成熟蛋白的编码基因为基础的DNA疫苗的成功构建和表达 。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 Ag85a基因 DNA疫苗 结核病
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重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白的原核表达、纯化及其生物活性 被引量：4
11
作者 张群 朱琳 楼觉人 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2010年第11期1153-1157,共5页
目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂... 目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化复性后,在体外对经5种不同类型的表达结核杆菌Ag85a和ESAT6的重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞进行刺激,以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应。结果重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约41000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的55.65%;纯化复性的重组融合蛋白纯度达95%以上,表达量约为1.2g/L发酵液,且具有良好的反应原性;与空痘苗病毒或生理盐水免疫的小鼠相比,5种重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞与Ag85a-ESAT6融合蛋白共培养后,增殖活性明显升高(P<0.01)。结论成功利用原核系统表达了结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,纯化复性的Ag85a-ESAT6融合蛋白具有生物学活性。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 AG85a ESAT6 原核细胞 基因表达 生物活性
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KLIANNTRV是结核抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL表位 被引量：2
12
作者 陈燕 娄加陶 +5 位作者 吴传勇 周晔 陈波 蒋天舒 仲人前 邓安梅 《现代检验医学杂志》 CAS 2007年第5期1-3,共3页
目的鉴定结核杆菌抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL优势表位。方法采用数据库SYFPEITHI初步预测结核抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL表位;经流式细胞术分析抗原肽与HLA-A*0201的亲和力;经时间荧光分辨法检测患者外周血单个核细胞(PBMCs)... 目的鉴定结核杆菌抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL优势表位。方法采用数据库SYFPEITHI初步预测结核抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL表位;经流式细胞术分析抗原肽与HLA-A*0201的亲和力;经时间荧光分辨法检测患者外周血单个核细胞(PBMCs)对抗原肽的增殖反应;最后通过细胞毒实验逐步鉴定Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL预测的表位。结果实验证明,预测的位于Ag85A氨基酸序列(242-250aa)的肽表位与HLA-A*0201具有较高的亲和力。结论筛选出的KLIANNTRV(242-250aa)是结核杆菌抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL优势表位。 展开更多
关键词 结核杆菌 AG85a CTL表位 预测 鉴定
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结核杆菌Ag85A/GM-CSF嵌合表达质粒的构建及表达 被引量：2
13
作者 谢勇恩 鲍朗 +1 位作者 张会东 陈玮 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期146-149,共4页
目的　探索对结核病DNA疫苗进行基因修饰的新方法。方法　以结核杆菌H3 7Rv 株基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增获得结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因的成熟肽编码区 ,以经PHA诱导后的小鼠脾组织总RNA为模板 ,通过RT PCR获得小鼠粒细胞 巨噬细... 目的　探索对结核病DNA疫苗进行基因修饰的新方法。方法　以结核杆菌H3 7Rv 株基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增获得结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因的成熟肽编码区 ,以经PHA诱导后的小鼠脾组织总RNA为模板 ,通过RT PCR获得小鼠粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子的cDNA ,将二者定向克隆入质粒pBK CMV中构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转染培养的COS7细胞后检测嵌合目的基因的表达。结果　成功构建了小鼠粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子cDNA与结核杆菌Ag85A抗原基因的真核嵌合表达质粒 ,重组质粒能在COS7细胞中进行稳定表达。结论　本研究首次将细胞因子基因与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合构建嵌合DNA疫苗 。 展开更多
关键词 结核杆菌 AG85a GM-CSF 嵌合表达 结核病 基因修饰 DNA疫苗
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人细胞因子IL-12p70与结核分枝杆菌特异性抗原Ag85A融合基因重组卡介苗的构建及鉴定 被引量：5
14
作者 邓仪昊 何红云 张本斯 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2012年第24期4038-4040,共3页
目的:构建可表达融合蛋白IL-12p70-Ag85A的重组卡介苗,为结核病新疫苗的研制奠定基础。方法:以穿梭表达质粒pMV361为载体,构建重组质粒rpMV361-IL-12p70-Ag85A。将成功构建的重组质粒以电转化方式导入BCG基因组构建重组卡介苗rBCG-IL-12... 目的:构建可表达融合蛋白IL-12p70-Ag85A的重组卡介苗,为结核病新疫苗的研制奠定基础。方法:以穿梭表达质粒pMV361为载体,构建重组质粒rpMV361-IL-12p70-Ag85A。将成功构建的重组质粒以电转化方式导入BCG基因组构建重组卡介苗rBCG-IL-12p70-Ag85A。通过抗生素筛选、重组卡介苗基因组PCR扩增及测序,以及western-blotting对重组卡介苗进行鉴定。结果:经鉴定,重组卡介苗成功构建,并可表达融合蛋白IL-12p70-Ag85A。结论:重组卡介苗rBCG-12p70-Ag85A构建成功,并可高效表达目的蛋白。 展开更多
关键词 重组卡介苗 IL-12p70 AG85a
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结核分枝杆菌Ag85A DNA的克隆与原核表达 被引量：3
15
作者 姜燕 Azuma Kalu +1 位作者 吕昌龙 单风平 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2007年第3期16-20,共5页
抗原85(Ag85)复合体是BCG合成分泌的可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答。Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。研究构建了高效表达的pTrcHisB-Ag85A基因重组质粒,并将其转化至大肠埃希菌TOP10中进行重组... 抗原85(Ag85)复合体是BCG合成分泌的可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答。Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。研究构建了高效表达的pTrcHisB-Ag85A基因重组质粒,并将其转化至大肠埃希菌TOP10中进行重组蛋白的表达,筛选转化物,SDS-PAGE进行蛋白表达的分子量检测,并通过Western Blotting方法,应用抗Ag85A的单克隆抗体进一步确认重组Ag85A蛋白的表达,建立了Ag85A的原核表达体系,为进一步制备出有效的重组Ag85A疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 重组DNA AG85a 结核分枝杆菌 表达载体
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可表达结核分枝杆菌融合蛋白Ag85A-ESAT-6重组卡介苗免疫保护作用研究 被引量：2
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作者 邓仪昊 何红云 +1 位作者 张本斯 鲍朗 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期921-925,共5页
目的以Balb/c小鼠为动物模型,评价重组卡介苗新型结核病疫苗rBCG-Ag85A-ESAT-6(rBC-AE)的免疫保护效应。方法将重组卡介苗rBCG-AE免疫动物10周后,结核分枝杆菌H37Rv尾静脉注射进行感染攻击,分别于感染攻击后3、6和9周,通过观察肺组织大... 目的以Balb/c小鼠为动物模型,评价重组卡介苗新型结核病疫苗rBCG-Ag85A-ESAT-6(rBC-AE)的免疫保护效应。方法将重组卡介苗rBCG-AE免疫动物10周后,结核分枝杆菌H37Rv尾静脉注射进行感染攻击,分别于感染攻击后3、6和9周,通过观察肺组织大体病变、脾肺组织细菌载荷量计数、肺组织抗酸染色、HE染色结合肺组织病理变化,综合评价该疫苗诱导的免疫保护作用。结果 rBCG-AE组脾肺组织细菌载荷量在各时间点均显著低于阴性对照组(PBST组,P<0.01),但明显高于卡介苗(BCG)组(P<0.01)。rBCG-AE组肺组织病变在感染攻击后6～9周逐渐改善,但其病理打分在各时间点均明显高于BCG组(P<0.01)。各组肺组织大体病变与组织病理打分变化相似。结论重组卡介苗rBCG-AE仅能诱导产生与BCG疫苗相当甚至较低的免疫保护作用。 展开更多
关键词 重组卡介苗 AG85a ESAT-6 免疫保护作用
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结核分枝杆菌重组Ag85A、Ag85B蛋白免疫原性的研究 被引量：3
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作者 尹文东 于庭 +7 位作者 梁艳 阳幼荣 肖漓 王兰 王莹 史迎昌 张俊仙 吴雪琼 《中国实验诊断学》 北大核心 2011年第10期1618-1621,共4页
目的研究结核分枝杆菌重组Ag85A(rAg85A)和/或Ag85B(rAg85B)蛋白与母牛分枝杆菌菌苗(Mycobacteri-um vaccae,MV)联合免疫的免疫原性。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机分为下列6组:(1)阴性对照组:磷酸盐缓冲液(PBS)组,(2)阳性对照组:卡介苗(... 目的研究结核分枝杆菌重组Ag85A(rAg85A)和/或Ag85B(rAg85B)蛋白与母牛分枝杆菌菌苗(Mycobacteri-um vaccae,MV)联合免疫的免疫原性。方法 60只雌性BALB/c小鼠随机分为下列6组:(1)阴性对照组:磷酸盐缓冲液(PBS)组,(2)阳性对照组:卡介苗(BCG)组,(3)阳性对照组:MV组,(4)实验组:rAg85A-MV组,(5)实验组:rAg85B-MV组及(6)实验组:rAg85A-rAg85B-MV组。每2周免疫1次,共免疫3次。末次免疫结束后第14天杀鼠,用ELISA法检测血清中IgGI、gG1和IgG2a水平;ELISPOT检测脾脏分泌γ干扰素(IFN-γ)的T淋巴细胞斑点数;流式细胞术检测全血单个核细胞内Th1和Th2百分比。结果三个实验组小鼠血清抗体水平均明显高于三个对照组(P<0.001);三个实验组和两个阳性对照组小鼠的T淋巴细胞斑点数均明显高于阴性对照组(P<0.05);rAg85A-rAg85B-MV组小鼠Th1百分比明显高于其余五组(P<0.001),三个实验组Th1/Th2比值均明显高于三个对照组(P<0.05)。结论结核分枝杆菌rAg85A和rAg85B蛋白均具有很强的免疫原性,与MV联合免疫可增强其Th1型细胞免疫应答。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85a AG85B 母牛分枝杆菌 疫苗
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结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究 被引量：2
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作者 张灵霞 吴雪琼 +2 位作者 张俊仙 史迎昌 梁建琴 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2002年第6期10-12,共3页
目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6... 目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8及 1.0 μg重组抗原分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8及 72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5IUPPD及 0 .4、0 .6、0 .8、1.0 μgAg85A抗原 ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部一侧 ,每批 6只 ,共 3批。于注射后 2 4、4 8、72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。结果 :常规皮肤试验 0 .1、0 .2 μg重组Ag85A抗原诱发DTH的平均直径与PPD相比有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,而 0 .4、0 .6、0 .8、1.0重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比 ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后结果与常规皮肤试验结果一致。结论 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 重组Ag85a蛋白抗原 DTH
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结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达 被引量：2
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作者 谢勇恩 鲍朗 +2 位作者 陈炜 李学敏 于向华 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期28-31,共4页
目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用I... 目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 结核杆菌 AG85a ESAT-6 融合表达 免疫保护性抗原 大肠杆菌 表达载体
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结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白在结核病诊断的价值 被引量：4
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作者 董恩军 张灵霞 张翠英 《中国热带医学》 CAS 2011年第3期279-280,共2页
目的探讨重组结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白用于结核病的诊断价值。方法以Ag85A和Ag85B为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 325例肺结核病组,Ag85A、Ag85B和PPD检测的灵敏度分别为58.2%、62.2%和71.7%。健康... 目的探讨重组结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白用于结核病的诊断价值。方法以Ag85A和Ag85B为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 325例肺结核病组,Ag85A、Ag85B和PPD检测的灵敏度分别为58.2%、62.2%和71.7%。健康献血组、非结核性呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用Ag85A、Ag85B和PPD检测,Ag85A特异性分别为94.3%、93.0%、73.7%。Ag85B特异性分别为96.4%、96.5%、85.3%。PPD特异性为93.6%、86.0%、67.9%。统计分析显示,Ag85B蛋白和PPD检测非结核性呼吸疾病组,其特异性有显著性差异(P<0.05)。检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异(P<0.05)。Ag85A和Ag85B同时检测325例肺结核病组血清可显著提高检测的阳性率。结论 Ag85B蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性,是ELISA的可靠抗原,与Ag85A联用可提高灵敏度,对结核病血清学诊断有较高参考价值。 展开更多
关键词 结核 重组卡介苗Ag85a、Ag85B ELISA血清学诊断
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