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8-oxoGTP作为G蛋白α亚基内源性配体的体外研究
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作者 李瑾 潘佳欣 +1 位作者 盛刚 蔡剑平 《中国老年保健医学》 2025年第6期3-7,共5页
目的异源三聚体G蛋白由α、β、γ3个亚基组成,其中α亚基通过GDP/GTP循环及与βγ的动态解离与复合,实现“分子开关”循环,精确调控下游信号。本研究探讨8-oxoGTP是否可作为Gα亚基的内源性配体,进而影响其信号转导功能,拓展对氧化应... 目的异源三聚体G蛋白由α、β、γ3个亚基组成,其中α亚基通过GDP/GTP循环及与βγ的动态解离与复合,实现“分子开关”循环,精确调控下游信号。本研究探讨8-oxoGTP是否可作为Gα亚基的内源性配体,进而影响其信号转导功能,拓展对氧化应激条件下G蛋白介导信号调控机制的理解。方法采用分子对接模拟预测8-oxoGTP与Gαi的结合模式;通过表面等离子共振(SPR)比较8-oxoGTP和GTP与Gαi的结合动力学及亲和力;利用体外活化实验,比较8-oxoGTP和GTP对Gαi的激活效应。结果分子对接显示8-oxoGTP与Gαi形成的氢键和盐桥数量多于GTP,提示其结合更稳固。SPR检测表明8-oxoGTP与Gαi的结合亲和力显著高于GTP(KD=5.24×10^(-7)Mvs.3.95×10^(-6)M)。功能实验发现,8-oxoGTP激活Gαi的能力明显强于GTP。结论8-oxoGTP不仅是氧化应激的产物,还可作为Gαi的高效内源性配体,增强其激活效应,提示氧化核苷酸在细胞信号转导和病理调控中可能发挥重要作用。本研究为进一步解析氧化应激相关疾病的分子机制及潜在治疗靶点提供了新思路。 展开更多
关键词 8-oxogtp GTP G蛋白α亚基 分子对接 表面等离子共振
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秀丽隐杆线虫NDX-4蛋白的体外表达及酶学活性研究
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作者 郭娇 徐新民 +4 位作者 干伟 史飞 钱建畅 周晓阳 蔡剑平 《医学研究杂志》 2014年第4期21-25,共5页
目的构建秀丽隐杆线虫NDX-4基因的克隆载体和表达载体,诱导NDX-4蛋白表达,研究NDX-4的体外酶学活性。方法构建NDX-4的克隆载体,将NDX-4的开放阅读框架(ORF)插入PGEM-T载体中扩增;采用双酶切将NDX-4ORF连入表达载体pET-30a(+)中;将连接... 目的构建秀丽隐杆线虫NDX-4基因的克隆载体和表达载体,诱导NDX-4蛋白表达,研究NDX-4的体外酶学活性。方法构建NDX-4的克隆载体,将NDX-4的开放阅读框架(ORF)插入PGEM-T载体中扩增;采用双酶切将NDX-4ORF连入表达载体pET-30a(+)中;将连接质粒转入BL21(DE3)感受态细胞后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对NDX-4蛋白进行表达诱导,并进行树脂纯化;用SDS-PAGE和Western blot检测以评价NDX-4体外表达和纯化的质量;采用高效液相色谱-紫外检测技术(HPLC-UV)检测NDX-4蛋白水解8-oxodGTP和8-oxoGTP的活性。结果 SDS-PAGE和Western blot检测均在经IPTG诱导的蛋白提纯物泳道上出现单一条带,分子质量约为24kDa,而未诱导的和空载体均未见条带。HPLC-UV检测结果显示加入NDX-4蛋白的8-oxodGTP和8-oxoGTP均被水解为相应的单磷酸和二磷酸氧化核苷,并且随着蛋白量的增加,两种产物的量逐渐增多。结论秀丽隐杆线虫的NDX-4蛋白具有水解8-oxodGTP和8-oxoGTP的双重功能,可能对抑制DNA和RNA的氧化损伤具有重要意义。 展开更多
关键词 NDX-4 HPLC-UV 8-oxodGTP 8-oxogtp 酶活性
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