阻断程序性死亡受体1/程序性死亡配体1 (programmed cell death protein 1/programmed cell death ligand 1,PD-1/PD-L1)为代表的肿瘤免疫疗法在肺癌治疗上获得较好的治疗效果,研发小分子药物阻断PD-1/PD-L1为肺癌免疫疗法提供新策略。...阻断程序性死亡受体1/程序性死亡配体1 (programmed cell death protein 1/programmed cell death ligand 1,PD-1/PD-L1)为代表的肿瘤免疫疗法在肺癌治疗上获得较好的治疗效果,研发小分子药物阻断PD-1/PD-L1为肺癌免疫疗法提供新策略。本研究应用体外细胞模型探讨了黄芩苷(baicalin)对A549肺癌细胞PD-L1的表达调控及作用机制。利用CCK8实验检测黄芩苷对A549细胞活力影响;Western blot检测A549细胞PD-L1蛋白的表达情况;利用凋亡、自噬等小分子抑制剂挖掘黄芩苷细胞毒性的机制及其对PD-L1蛋白表达的相关性;透射电子显微镜下观察黄芩苷处理A549细胞后自噬囊泡的形成;荧光显微镜下观察A549给药黄芩苷后酸性自噬泡的改变。CCK8实验结果显示,黄芩苷(12.5~400μmol·L-1)可呈剂量依赖性抑制A549细胞增殖;经干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)干扰后PD-L1蛋白表达的升高可随黄芩苷浓度的增加而降低;另一方面,自噬抑制剂wortmannin和chloroquine处理可回调黄芩苷引起的细胞毒性,透射电子显微镜及荧光显微镜下观察黄芩苷处理A549细胞后自噬囊泡数量增加, Western blot结果显示,黄芩苷可促进自噬相关蛋白LC3-II/I和beclin-1的表达;wortmannin干预后,黄芩苷引起的A549细胞酸性自噬泡数量减弱,自噬蛋白LC3-II/I的表达受到抑制,对PD-L1的抑制作用得到回调。上述结果表明,黄芩苷可能通过激活A549细胞中自噬蛋白LC3降低PD-L1的表达发挥抗肿瘤作用。本研究为黄芩苷开发为PD-1/PD-L1信号通路小分子阻断剂奠定了基础。展开更多
[目的]利用shRNA慢病毒载体构建敲低CTNNB1的A549细胞系,检测其对细胞增殖迁移及对趋化因子CCL4表达的影响。[方法]设计靶向CTNNB1基因的shRNA序列,克隆至pLKO.1慢病毒载体中得到重组干扰质粒。运用三质粒系统包装慢病毒;转导A549细胞...[目的]利用shRNA慢病毒载体构建敲低CTNNB1的A549细胞系,检测其对细胞增殖迁移及对趋化因子CCL4表达的影响。[方法]设计靶向CTNNB1基因的shRNA序列,克隆至pLKO.1慢病毒载体中得到重组干扰质粒。运用三质粒系统包装慢病毒;转导A549细胞后用梯度稀释法得到阳性单克隆细胞;采用Western blotting和qRT-PCR检测CTNNB1及其下游基因的mRNA和蛋白质表达水平;采用实时无标记细胞分析实验检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验评估细胞迁移能力。[结果]成功构建稳定敲低CTNNB1的A549细胞系,与A549-shNC相比,A549-shCTNNB1细胞中CTNNB1的mRNA表达降低(1.01±0.05 vs 0.40±0.004,P<0.0001),β-catenin的蛋白表达降低(0.95±0.10 vs 0.47±0.16,P<0.05);细胞增殖有减缓的趋势,增殖相关基因COX2、CCND1、c-MYC的mRNA表达降低(0.978±0.02 vs 0.66±0.09,P<0.01);MMP2/9的mRNA表达降低(0.98±0.001 vs 0.20±0.08,P<0.0001),MMP2/9蛋白表达降低(0.96±0.05 vs 0.70±0.05,P<0.05),细胞迁移能力减弱(0.91±0.02 vs 0.69±0.05,P<0.01);CCL4的mRNA表达上调(1.87±0.39 vs 6.27±0.60,P<0.001)。[结论]敲低CTNNB1的A549细胞增殖速度减缓,迁移能力减弱,且趋化因子CCL4的mRNA表达上调。展开更多
文摘阻断程序性死亡受体1/程序性死亡配体1 (programmed cell death protein 1/programmed cell death ligand 1,PD-1/PD-L1)为代表的肿瘤免疫疗法在肺癌治疗上获得较好的治疗效果,研发小分子药物阻断PD-1/PD-L1为肺癌免疫疗法提供新策略。本研究应用体外细胞模型探讨了黄芩苷(baicalin)对A549肺癌细胞PD-L1的表达调控及作用机制。利用CCK8实验检测黄芩苷对A549细胞活力影响;Western blot检测A549细胞PD-L1蛋白的表达情况;利用凋亡、自噬等小分子抑制剂挖掘黄芩苷细胞毒性的机制及其对PD-L1蛋白表达的相关性;透射电子显微镜下观察黄芩苷处理A549细胞后自噬囊泡的形成;荧光显微镜下观察A549给药黄芩苷后酸性自噬泡的改变。CCK8实验结果显示,黄芩苷(12.5~400μmol·L-1)可呈剂量依赖性抑制A549细胞增殖;经干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)干扰后PD-L1蛋白表达的升高可随黄芩苷浓度的增加而降低;另一方面,自噬抑制剂wortmannin和chloroquine处理可回调黄芩苷引起的细胞毒性,透射电子显微镜及荧光显微镜下观察黄芩苷处理A549细胞后自噬囊泡数量增加, Western blot结果显示,黄芩苷可促进自噬相关蛋白LC3-II/I和beclin-1的表达;wortmannin干预后,黄芩苷引起的A549细胞酸性自噬泡数量减弱,自噬蛋白LC3-II/I的表达受到抑制,对PD-L1的抑制作用得到回调。上述结果表明,黄芩苷可能通过激活A549细胞中自噬蛋白LC3降低PD-L1的表达发挥抗肿瘤作用。本研究为黄芩苷开发为PD-1/PD-L1信号通路小分子阻断剂奠定了基础。
文摘[目的]利用shRNA慢病毒载体构建敲低CTNNB1的A549细胞系,检测其对细胞增殖迁移及对趋化因子CCL4表达的影响。[方法]设计靶向CTNNB1基因的shRNA序列,克隆至pLKO.1慢病毒载体中得到重组干扰质粒。运用三质粒系统包装慢病毒;转导A549细胞后用梯度稀释法得到阳性单克隆细胞;采用Western blotting和qRT-PCR检测CTNNB1及其下游基因的mRNA和蛋白质表达水平;采用实时无标记细胞分析实验检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验评估细胞迁移能力。[结果]成功构建稳定敲低CTNNB1的A549细胞系,与A549-shNC相比,A549-shCTNNB1细胞中CTNNB1的mRNA表达降低(1.01±0.05 vs 0.40±0.004,P<0.0001),β-catenin的蛋白表达降低(0.95±0.10 vs 0.47±0.16,P<0.05);细胞增殖有减缓的趋势,增殖相关基因COX2、CCND1、c-MYC的mRNA表达降低(0.978±0.02 vs 0.66±0.09,P<0.01);MMP2/9的mRNA表达降低(0.98±0.001 vs 0.20±0.08,P<0.0001),MMP2/9蛋白表达降低(0.96±0.05 vs 0.70±0.05,P<0.05),细胞迁移能力减弱(0.91±0.02 vs 0.69±0.05,P<0.01);CCL4的mRNA表达上调(1.87±0.39 vs 6.27±0.60,P<0.001)。[结论]敲低CTNNB1的A549细胞增殖速度减缓,迁移能力减弱,且趋化因子CCL4的mRNA表达上调。
