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利用CRISPR/Cas9在HEK293T细胞实现γ珠蛋白上调
1
作者 黄献娟 赖永榕 李静 《广西医科大学学报》 2025年第2期241-246,共6页
目的:采用CRISPR/Cas9技术编辑HEK293T细胞的γ珠蛋白启动子上调γ珠蛋白,探索基因编辑技术治疗β地中海贫血方法的可行性。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在γ珠蛋白转录起始位点(TSS)区前420 bp设计2条sgRNA序列,通过脂质体转染CR... 目的:采用CRISPR/Cas9技术编辑HEK293T细胞的γ珠蛋白启动子上调γ珠蛋白,探索基因编辑技术治疗β地中海贫血方法的可行性。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在γ珠蛋白转录起始位点(TSS)区前420 bp设计2条sgRNA序列,通过脂质体转染CRISPR/Cas9质粒诱导HEK293T细胞血红蛋白γ(HBG)基因启动子切割,经阳性克隆筛选、Sanger测序验证、TIDE分析编辑效率、RT-qPCR和western blotting检测γ珠蛋白基因表达量。结果:2条sgRNA序列均能对γ珠蛋白进行基因切割且切割活性分别为44.20%(sgRNA1)、32.90%(sgRNA2),RT-qPCR和western blotting结果显示,与对照组(NCs组,转染空载PX459质粒)相比,sgRNA2组γ珠蛋白基因表达量升高(P<0.05)。结论:CRISPR/Cas9基因编辑技术可在γ珠蛋白启动子上实现有效编辑,从而上调γ珠蛋白。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9编辑 Γ珠蛋白 HEK293t细胞 基因编辑
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逆转座子LINE-1对293T细胞增殖及细胞形态的影响
2
作者 李丹 刘红梅 张鹏 《中国生物工程杂志》 北大核心 2025年第7期1-10,共10页
目的:探索逆转座子LINE-1(long interspersed nuclear elements-1)编码的ORF-1p在维持293T细胞增殖和形态中的作用。方法:利用核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)技术,构建LINE-1 ORF-1p表达量下调的293T细胞系,通过qPCR(quantitative... 目的:探索逆转座子LINE-1(long interspersed nuclear elements-1)编码的ORF-1p在维持293T细胞增殖和形态中的作用。方法:利用核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)技术,构建LINE-1 ORF-1p表达量下调的293T细胞系,通过qPCR(quantitative polymerase chain reaction)和Western blot验证干扰效率,通过免疫荧光染色检测ORF-1p的表达和定位,通过细胞计数和克隆形成实验检测细胞增殖能力,通过鬼笔环肽和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色分析细胞形态。结果:成功构建两种LINE-1敲低的293T细胞系,通过免疫荧光染色观察ORF-1p的表达定位,显示ORF-1p主要分布在细胞质,干扰LINE-1后ORF-1p表达减少;通过细胞计数和集落形成实验,发现下调ORF-1p后细胞的增殖能力和克隆形成能力显著降低(P<0.05);通过鬼笔环肽标记细胞骨架,DAPI标记细胞核,相差显微镜和共聚焦显微镜观察干扰LINE-1后细胞形态,结果显示,下调ORF-1p后shL1-749细胞面积减小,细胞圆润度增加(P<0.05)。结论:成功构建了LINE-1敲低的293T细胞系,发现下调ORF-1p蛋白能够抑制293T细胞的生长,改变细胞形态,为进一步了解LINE-1在细胞增殖和调控中的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 LINE-1 ORF-1p RNAI 293t 细胞增殖 细胞形态
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高葡萄糖诱导对293T细胞类二十烷酸代谢的影响
3
作者 曹洋 柏聪颖 +5 位作者 王文倩 李浩 杜佳欣 郑柏诚 李捷 魏利莎 《湖北农业科学》 2025年第4期171-175,共5页
采用高葡萄糖(50 mmol/L)诱导293T细胞,通过CCK-8试剂盒检测细胞在1~4 d的增殖情况,利用荧光实时定量PCR技术分析细胞中类二十烷酸代谢相关基因及炎症相关基因的mRNA表达水平。结果表明,与正常葡萄糖(25 mmol/L)相比,高葡萄糖刺激后,293... 采用高葡萄糖(50 mmol/L)诱导293T细胞,通过CCK-8试剂盒检测细胞在1~4 d的增殖情况,利用荧光实时定量PCR技术分析细胞中类二十烷酸代谢相关基因及炎症相关基因的mRNA表达水平。结果表明,与正常葡萄糖(25 mmol/L)相比,高葡萄糖刺激后,293T细胞内类二十烷酸代谢相关基因的mRNA表达水平未发生显著变化,仅COX1基因在第5代时出现短暂下调,随后恢复至正常水平。高葡萄糖刺激还导致293T细胞内炎症因子IL-1β的mRNA水平在第11代时显著升高,表明长期高葡萄糖刺激可能诱发293T细胞产生轻度炎症反应。 展开更多
关键词 高葡萄糖 诱导 类二十烷酸代谢 293t细胞
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稳定分泌表达猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白的HEK293T细胞系的构建及鉴定
4
作者 颜仁和 万鹏飞 +2 位作者 刘蕾 楚电峰 毛莹莹 《分子诊断与治疗杂志》 2025年第3期453-457,共5页
目的构建一种高效、稳定表达分泌型猪瘟病毒E2蛋白的HEK-293T细胞株。方法利用分子克隆技术将含有信号肽的猪瘟病毒E2基因插入到慢病毒表达质粒,获得重组慢病毒载体pLV-CMV-E2。通过三质粒转染法包装重组慢病毒并感染HEK-293T细胞,采用... 目的构建一种高效、稳定表达分泌型猪瘟病毒E2蛋白的HEK-293T细胞株。方法利用分子克隆技术将含有信号肽的猪瘟病毒E2基因插入到慢病毒表达质粒,获得重组慢病毒载体pLV-CMV-E2。通过三质粒转染法包装重组慢病毒并感染HEK-293T细胞,采用有限稀释法获得稳定表达分泌性E2蛋白的重组单克隆细胞系。结果重组质粒酶切及PCR鉴定结果可见约1050条带,与CSFV E2基因大小相符;包装慢病毒LV-CSFV E2检测滴度为1×10^(8) copies/mL。慢病毒感染HEK-293T后,经Dot blot和有限稀释法筛选得到7个细胞形态均一、长势良好且E2蛋白表达水平较高的克隆(A4,A5,C1,D1,D2,E1,E2);重组细胞系经PCR及Western blot方法检测到E2基因及蛋白所对应特异性条带。将重组细胞系连续传至70代,E2蛋白表达水平稳定不变;免疫学实验结果显示,重组E2蛋白能够与猪瘟阳性血清发生特异性反应。结论本研究成功建立了一种稳定高效地表达分泌性重组E2蛋白的真核表达系统,为研究猪瘟E2亚单位疫苗及血清学诊断方法等奠定基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2囊膜蛋白 慢病毒载体 HEK-293t细胞
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磷酸化TauS214对HT22细胞和HEK293T细胞焦亡及炎症的影响
5
作者 陈慧琳 操蓉 +3 位作者 文亿 王能琴 齐晓岚 唐智 《贵州医科大学学报》 2025年第8期1093-1105,1119,共14页
目的构建阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)Tau蛋白异常磷酸化体外模型,探究磷酸化TauS214对细胞焦亡及炎症的影响。方法以NCBI中人源Tau40(h-Tau40)基因序列为模板设计突变引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)... 目的构建阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)Tau蛋白异常磷酸化体外模型,探究磷酸化TauS214对细胞焦亡及炎症的影响。方法以NCBI中人源Tau40(h-Tau40)基因序列为模板设计突变引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增目的基因,经限制性内切酶(restriction endonuclease,RE)BglⅡ和EcoR I双酶切后定向克隆到载体pEGFP-C1中,构建Tau突变体(TauS214E、TauS214A、TauP301L),测序鉴定正确后将质粒瞬时转染至HEK293T和HT22细胞,免疫荧光法检测重组Tau蛋白定位情况,蛋白质印迹法检测pTauS214、pTauS404和Tau5的表达,检测NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、Gasdermin D N端片段(GSDMD-N)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-6(IL-6)的表达水平。结果成功构建Tau蛋白重组质粒并在两种细胞中稳定表达;Tau40和TauP301L组中pS214表达显著降低,pS404表达升高(P<0.05),NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18、IL-6表达显著增加(P<0.05);TauS214E与Tau40相比,pS214表达显著升高,pS404表达显著降低(P<0.05),NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18、IL-6表达显著降低(P<0.05)。结论Tau40和TauP301L通过调节Tau蛋白磷酸化水平显著促进细胞焦亡和炎症反应,而TauS214E位点抑制炎性小体激活或阻断细胞焦亡。 展开更多
关键词 阿尔茨海默病 TAU蛋白 质粒 细胞焦亡 炎症 HT22 HEK293t
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稳定表达PDCoV-S和RBD蛋白的293T细胞系构建与免疫原性评价 被引量：1
6
作者 肖丽 赵淑庆 +6 位作者 袁雪松 范丽原 易鑫 陈琢琦 李彬 李基棕 主性 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期959-965,共7页
为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S和RBD蛋白的293T细胞系,获得PDCoV S和RBD蛋白。本研究将优化合成的PDCoV S蛋白全长基因及其RBD的表达质粒进行双酶切鉴定,将重组质粒pLV-S-Puro、pLV-RBD-Puro、psPRX2、pMD2.G同时转染293T细胞中... 为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S和RBD蛋白的293T细胞系,获得PDCoV S和RBD蛋白。本研究将优化合成的PDCoV S蛋白全长基因及其RBD的表达质粒进行双酶切鉴定,将重组质粒pLV-S-Puro、pLV-RBD-Puro、psPRX2、pMD2.G同时转染293T细胞中进行慢病毒包装,收集上清感染293T细胞,经嘌呤霉素初筛得到的多细胞克隆,进一步通过终点稀释法筛选获得稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的单克隆293T细胞系,通过Western blot检测蛋白表达,用纯化的PDCoV S和RBD蛋白分别免疫BALB/c小鼠,对重组蛋白进行免疫原性检测。结果表明,稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的293T细胞系构建成功,获得了重组慢病毒,纯化PDCoV S和RBD重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高的IgG抗体(S:1.2;RBD:0.9),中和抗体水平分别达1∶128和1∶64。本研究构建的293T细胞系能稳定表达PDCoV S和RBD蛋白,为进一步研制PDCoV亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 293t细胞系 PDCoV 慢病毒 稳定表达
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293T细胞生产慢病毒工艺优化 被引量：1
7
作者 李欣 高驰 +4 位作者 顾力行 曾毅 姚頔 何红鹏 张同存 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期554-564,共11页
随着细胞治疗的快速发展,大规模慢病毒的生产成为工艺环节中的瓶颈,因此,优化293T高滴度和高纯度的CAR慢病毒载体生产工艺显得至关重要。本研究旨在优化包装慢病毒的293T贴壁细胞,节省时间,节约成本,提高慢病毒包装的能力。同时对优化... 随着细胞治疗的快速发展,大规模慢病毒的生产成为工艺环节中的瓶颈,因此,优化293T高滴度和高纯度的CAR慢病毒载体生产工艺显得至关重要。本研究旨在优化包装慢病毒的293T贴壁细胞,节省时间,节约成本,提高慢病毒包装的能力。同时对优化慢病毒载体中出现悬浮细胞结团生长的现象进行探索,检测其影响结团的因素。分别采用快速、慢速驯化方式将293T贴壁细胞驯化为悬浮培养,并比较其细胞形态、细胞密度、细胞活率、慢病毒包装能力和冻存复苏后稳定一致性,筛选出最优的悬浮驯化条件。通过调节Ca^(2+)浓度和EDTA添加量来研究比较细胞结团生长状况。结果证明,使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂(medium)可以将293T贴壁细胞快速驯化为293T悬浮细胞,并能制备出慢病毒滴度且优于贴壁细胞的包装滴度(^(*)P<0.05)。Ca^(2+)浓度会影响细胞结团大小,添加EDTA能有效分离分散非必要的细胞抱团生长。研究结果显示,传统293T贴壁细胞可以使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂快速驯化成悬浮细胞;在一定范围内,Ca^(2+)浓度越高细胞所结团块及粒径越大,EDTA添加量越高细胞所结团块及粒径变小。这为优化慢病毒载体包装工艺和悬浮培养条件,同时为体外规模化细胞培养放大和生产奠定了理论基础,具有一定的实用价值。 展开更多
关键词 慢病毒载体 293t细胞 悬浮驯化 悬浮细胞培养 结团
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花生红衣中反式白藜芦醇对HEK293T细胞抗氧化的影响
8
作者 孙畅 周春田 +5 位作者 岳玉兰 吕呈蔚 李云飞 黄威 李铁柱 胡济美 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第5期150-160,共11页
目的:分析花生红衣中的白藜芦醇成分,探究其主要成分反式白藜芦醇(RES)对人胚胎肾细胞293(HEK293T)抗氧化的影响及其潜在的分子机制。方法:采用超声波辅助酶法提取花生红衣中的白藜芦醇,采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术分析花... 目的:分析花生红衣中的白藜芦醇成分,探究其主要成分反式白藜芦醇(RES)对人胚胎肾细胞293(HEK293T)抗氧化的影响及其潜在的分子机制。方法:采用超声波辅助酶法提取花生红衣中的白藜芦醇,采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术分析花生红衣中白藜芦醇粗提液的组成成分。通过测定细胞活力,检测RES对HEK293T细胞的最高毒性。通过荧光素酶报告基因试验及免疫印迹试验检测其对Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路的影响,以DPPH自由基清除率评价其体外抗氧化能力。结果:HPLC-MS结果表明,花生红衣中含有白藜芦醇苷、白皮杉醇和RES。由于白藜芦醇在自然界中主要以反式白藜芦醇形式存在,因此选择RES进行后续试验。细胞存活力检测结果表明,RES对HEK293T细胞的最高无毒浓度为50μmol/L,体外抗氧化作用呈浓度依赖性。荧光素酶报告基因分析表明,RES显著诱导了ARE介导的转录激活。免疫印迹结果显示,RES能诱导Nrf2介导的3个抗氧化蛋白表达【血红素氧合酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLM)】表达。此外,DPPH自由基清除率测定结果表明,RES能有效清除DPPH自由基,具有体外抗氧化能力。结论:花生红衣中白藜芦醇的主要成分RES对HEK293T细胞有抗氧化作用,可通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路激活潜在的抗氧化活性。 展开更多
关键词 花生红衣 白藜芦醇 HEK293t 高效液相色谱-质谱联用 Keap1-Nrf2-ARE信号通路 抗氧化
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POLQ基因敲除293T细胞系的构建及其在外源基因定点整合中的应用
9
作者 王瑶 姜志洋 +6 位作者 蔡军雨 樊榕榕 贾姗姗 冯健男 石艳春 王晶 郑源强 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期40-55,共16页
目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用。方法:构建靶向POLQ基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、... 目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用。方法:构建靶向POLQ基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、稳定单细胞克隆培养、TA克隆测序及蛋白质印迹等方法验证POLQ敲除情况;利用靶向AAVS1和FBL位点的含GFP/mCherry报告基因同源打靶载体,评估敲除的293T POLQ-/-细胞系在外源基因定点整合效率的变化,并通过测序方式验证供体报告载体是否定点整合到基因组中;最后分析POLQ敲除对293T细胞增殖和存活率的影响。结果:成功在293T细胞中稳定敲除POLQ基因;通过报告基因实验验证,敲除细胞系中外源基因定点整合效率平均提高2~7倍,且敲除POLQ基因对293T细胞系增殖和存活率没有明显影响。结论:成功利用CRISPR/Cas9技术构建具有高效定点整合能力的POLQ基因稳定敲除293T细胞系,为进一步利用该细胞系高效制备稳定整合外源基因(包括抗体基因)工程化细胞系奠定基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 POLQ 293t细胞 基因敲除 定点整合
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非洲猪瘟病毒p30蛋白在293T细胞中的瞬时表达
10
作者 刘郁夫 林晓慧 +3 位作者 黎洁泳 官逸瑶 刘俐 冯美莹 《肇庆学院学报》 2024年第5期84-89,共6页
为真核表达非洲猪瘟病毒p30蛋白,探究其对炎症反应相关基因表达的影响.实验根据NCBI上的p30基因序列合成基因,将其克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,再将重组质粒转染到293T细胞中,培养24 h后通过荧光显微镜观察质粒的转染情况,以wester... 为真核表达非洲猪瘟病毒p30蛋白,探究其对炎症反应相关基因表达的影响.实验根据NCBI上的p30基因序列合成基因,将其克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,再将重组质粒转染到293T细胞中,培养24 h后通过荧光显微镜观察质粒的转染情况,以western blots试验检测目的蛋白的表达情况,最后再利用RTqPCR检测过表达p30蛋白的293T细胞中NF-κB信号通路和炎症反应相关基因的mRNA转录情况.结果显示,293T细胞转染重组质粒24 h后,约80%的细胞可显示绿色荧光,并且western blots检测到一条可与Flag标签抗体特异性反应的条带,大小与预期相符.RT-qPCR试验表明,过表达ASFV p30蛋白的293T细胞中,炎性反应相关细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平得到显著上调,上调倍数为对照组的2.988~3.605倍.试验可为ASFV抗原抗体检测技术的研发提供前期基础,为ASFV分子致病机制研究提供参考. 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 P30 293t细胞 炎性细胞因子
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固定床式生物反应器在293T细胞高密度培养中的应用
11
作者 曹灿 汪兴 +1 位作者 张君轩 程黄鹤 《生物化工》 CAS 2024年第2期154-157,共4页
目的:研究悬浮和贴壁293T细胞在生物反应器内的高密度培养工艺。方法:分别在2个3.5 L固定床生物反应器中加入150 g片状载体,接种贴壁293T细胞和驯化为悬浮的293T细胞,根据葡萄糖消耗情况调整灌流量进行连续灌流培养6天。结果:贴壁293T... 目的:研究悬浮和贴壁293T细胞在生物反应器内的高密度培养工艺。方法:分别在2个3.5 L固定床生物反应器中加入150 g片状载体,接种贴壁293T细胞和驯化为悬浮的293T细胞,根据葡萄糖消耗情况调整灌流量进行连续灌流培养6天。结果:贴壁293T细胞和悬浮293T细胞均能在固定床生物反应器片状载体上生长,细胞密度最终分别达到2.5×10^(7)cells/mL和2.3×10^(7)cells/mL,6天增殖约50倍。结论:固定床式生物反应可以用于贴壁和悬浮293T细胞的高密度培养。 展开更多
关键词 生物反应器 293t细胞 连续灌流 片状载体
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犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达 被引量：4
12
作者 靳慧君 仲飞 +3 位作者 吴凌娟 解民 王微 韩冬梅 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第5期897-902,共6页
哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将... 哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank编号:NM-001024641)的同源性为99.7%。表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外。为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 犬β防御素-1 载体构建 HEK293t细胞 表达
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真核表达载体pEGFP-claudin-1的构建及其在293T细胞中的表达 被引量：4
13
作者 魏欣 张野 +5 位作者 李军 马力 潘蕾 王平忠 白雪帆 贾战生 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期444-446,共3页
目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho I和BamH I酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴... 目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho I和BamH I酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和Western blot分析。结果:构建了含有claudin-1 ORF的真核表达质粒pEGFP-claudin-1,转染293T细胞后,经荧光可见细胞膜有EGFP-claudin-1融合蛋白的表达,Western blot检测发现有相对分子质量(Mr)49000的蛋白条带。结论:成功地构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中表达,为研究claudin-1的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 CLAUDIN-1 绿色荧光蛋白 真核表达载体 293t细胞
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二甲基亚砜和胎牛血清对293T细胞冷冻效果的影响 被引量：4
14
作者 李佳佳 程腾 +4 位作者 贺小英 梁波 陈秀莉 籍凤宇 马利兵 《信阳师范学院学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2013年第2期217-220,共4页
使用含不同体积分数二甲基亚砜(DMSO)(5%、10%、15%、20%)和不同体积分数胎牛血清(FBS)(5%、10%、20%、40%)的细胞冷冻液以三步冷冻法冻存293T细胞.台盼蓝染色法进行活细胞计数后计算出解冻后细胞存活率.结果表明:FBS对293T细胞冷冻效... 使用含不同体积分数二甲基亚砜(DMSO)(5%、10%、15%、20%)和不同体积分数胎牛血清(FBS)(5%、10%、20%、40%)的细胞冷冻液以三步冷冻法冻存293T细胞.台盼蓝染色法进行活细胞计数后计算出解冻后细胞存活率.结果表明:FBS对293T细胞冷冻效果的影响是显著的(P<0.05),但添加20%和40%FBS的效果无显著差异(P>0.05);DMSO对293T细胞冷冻效果的影响则是极显著的(P<0.01),添加10%DMSO时,细胞的冷冻效果最好;冷冻液中含10%DMSO、40%FBS时的冷冻效果最佳,细胞存活率可达到82.00%.而实际应用中,含10%FBS、10%DMSO或20%FBS、5%～10%DMSO的细胞冷冻液也可达到较理想的冷冻效果,足以达到一般实验的要求. 展开更多
关键词 293t细胞 二甲基亚砜 胎牛血清 冷冻效果
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TALEN质粒转染HEK-293T细胞的条件优化 被引量：3
15
作者 严爱芬 刘婉霞 +3 位作者 刘芳 刘靖 张雅洁 唐冬生 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2554-2559,共6页
本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光... 本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光细胞,计算绿色荧光细胞/总细胞数的比例得出转染率,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验结果表明,TALEN质粒转染293T细胞,采用Fugene HD转染试剂比Lipofectamine 2000转染试剂细胞存活率高;以6孔板为例,转染质粒DNA量为4μg时转染效率最高(49.0±8.0)%;Fugene HD与质粒DNA比例(μg/μL)为3:1时转染效率最高。本研究建立TALEN表达质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件,可作为相关研究或应用提供参考。 展开更多
关键词 转染 优化 TALEN HEK-293t
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柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达 被引量：7
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作者 王晔 姜连连 +6 位作者 韩红玉 薛璞 赵其平 董辉 朱顺海 舒凡帆 黄兵 《中国动物传染病学报》 CAS 2012年第5期39-44,共6页
为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Te... 为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 棒状体颈部蛋白2 293t细胞 真核表达
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反义核酸抑制miR-20、miR-106表达对293T细胞增殖的影响 被引量：3
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作者 李有杰 张帅 +4 位作者 高宗华 张文娟 谢书阳 张鹏举 姜安丽 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1665-1669,共5页
目的:通过反义核酸技术抑制miR-20、miR-106的表达,检测对293T细胞增殖的影响。方法:应用特异性针对miR-20、miR-106的反义核酸转染293T细胞,用形态学、流式细胞技术研究反义核酸对细胞增殖的抑制作用,用定量PCR和ELISA研究miRNA和相关... 目的:通过反义核酸技术抑制miR-20、miR-106的表达,检测对293T细胞增殖的影响。方法:应用特异性针对miR-20、miR-106的反义核酸转染293T细胞,用形态学、流式细胞技术研究反义核酸对细胞增殖的抑制作用,用定量PCR和ELISA研究miRNA和相关靶基因的表达。结果:研究发现反义核酸可有效抑制miR-20和miR-106的表达,并明显抑制293T细胞的增殖;研究还表明反义miR-106可明显上调抑癌基因Rb的表达。结论:反义核酸通过抑制miRNA表达,上调抑癌基因Rb的表达,能明显抑制293T细胞增殖。 展开更多
关键词 RNA 反义 MIRNA 293t细胞 细胞增殖 基因表达
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一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价 被引量：4
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作者 华进 程志彬 +2 位作者 林春霖 戴起宝 朱广伟 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1177-1181,I0006,共6页
目的:探讨2种磷酸钙转染法转染293T细胞的效果,建立一种实现高效稳定磷酸钙转染293T细胞的方法。方法:荧光显微镜观察采用2种磷酸钙转染方法(传统磷酸钙转染法和改良磷酸钙转染法)转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞的转染效率... 目的:探讨2种磷酸钙转染法转染293T细胞的效果,建立一种实现高效稳定磷酸钙转染293T细胞的方法。方法:荧光显微镜观察采用2种磷酸钙转染方法(传统磷酸钙转染法和改良磷酸钙转染法)转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞的转染效率。采用Real-time PCR法和Western blotting法分别检测2种磷酸钙转染方法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞后,肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6) mRNA和flag蛋白表达水平。结果:荧光显微镜下观察,与传统磷酸钙转染法比较,改良磷酸钙转染法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24 和48 h后的转染效率明显升高( P <0.01);Real-time PCR法和Western blotting法检测,与传统转染方法比较,磷酸钙转染改良法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24 和48 h后,TRAF6 mRNA 和flag蛋白表达水平均明显升高( P <0.01)。结论:本研究建立的改良磷酸钙转染方法是一种高效、稳定的DNA转染方法。 展开更多
关键词 磷酸钙转染 293t细胞 肿瘤坏死因子受体相关因子6 flag蛋白
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鸡MHCⅠα和β2m链基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达 被引量：4
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作者 戴银 胡晓苗 +5 位作者 赵瑞宏 侯宏艳 沈学怀 潘孝成 周学利 张丹俊 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第8期1938-1943,共6页
为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCh... 为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCherry-MHCⅠβ_2m,并通过脂质体法转染293T真核表达细胞。荧光显微镜观察可见,MHCⅠα和β_2m分子主要分布于真核细胞的内膜系统,改变了与之融合的荧光蛋白在细胞内的定位。此外,Western blotting检测可见大小约68.3和41.3ku的目的蛋白反应带,表明重组质粒能够在293T细胞中顺利表达,且表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应,具有良好的免疫学活性。 展开更多
关键词 鸡MHCⅠα基因 鸡MHCⅠβ2m链基因 真核表达载体 293t细胞
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一种高效稳定的磷酸钙转染HEK293T细胞的方法 被引量：4
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作者 况野 房有荣 +6 位作者 刘丽 王蓉 严子琴 李海龙 孟凡国 盛清 欧文斌 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期407-413,共7页
为了克服磷酸钙转染法在真核细胞中转染效率低和不稳定性等缺点,适用于体外在哺乳细胞中高效表达外源蛋白,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达质粒通过常规的磷酸钙转染法导入到HEK293T细胞中,对影响质粒转染效率的条... 为了克服磷酸钙转染法在真核细胞中转染效率低和不稳定性等缺点,适用于体外在哺乳细胞中高效表达外源蛋白,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达质粒通过常规的磷酸钙转染法导入到HEK293T细胞中,对影响质粒转染效率的条件逐步予以优化,具体包括:在制备磷酸钙-DNA沉淀复合物时,对DNA质粒的用量和涡旋混匀时间的优化;磷酸钙-DNA沉淀形成后对转染促进剂(甘油、丁酸钠和氯喹)的浓度、作用时间及其组合进行优化和筛选。结果表明:GFP转染6孔板培养的HEK293T细胞的DNA质粒最适用量为3μg/孔,其转染效率较1和2μg/孔的平均转染效率提高了50%,较4和5μg/孔的平均转染效率提高了70%以上;涡旋混匀时间最佳为10s,比涡旋混匀5s时的转染效率提高了80%;在上述优化条件基础上加入不同的转染促进剂,其中单独使用15%甘油处理细胞6.5min时,所得转染效率较2.5、4.5、8.5和10.5min有明显提高,15%甘油+5mmol/L丁酸钠联用或者单独用500μmol/L氯喹处理细胞后,转染效率较常规方法分别提高了80%和75%,且荧光表达强度有所增强。总之,该文通过对磷酸钙转染时和转染后的条件进行优化,使其转染效率较常规方法有了显著提高,相对于脂质体转染法更加安全可靠,且价格低廉,因此可适用于大规模蛋白表达质粒转染或者病毒包装,尤其适用于各种糖基化蛋白如肿瘤诊断标志物在体外的高通量表达与制备。 展开更多
关键词 磷酸钙转染 HEK293t细胞 转染促进剂 甘油 丁酸钠 氯喹
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