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利用CRISPR/Cas9在HEK293T细胞实现γ珠蛋白上调
1
作者 黄献娟 赖永榕 李静 《广西医科大学学报》 2025年第2期241-246,共6页
目的:采用CRISPR/Cas9技术编辑HEK293T细胞的γ珠蛋白启动子上调γ珠蛋白,探索基因编辑技术治疗β地中海贫血方法的可行性。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在γ珠蛋白转录起始位点(TSS)区前420 bp设计2条sgRNA序列,通过脂质体转染CR... 目的:采用CRISPR/Cas9技术编辑HEK293T细胞的γ珠蛋白启动子上调γ珠蛋白,探索基因编辑技术治疗β地中海贫血方法的可行性。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在γ珠蛋白转录起始位点(TSS)区前420 bp设计2条sgRNA序列,通过脂质体转染CRISPR/Cas9质粒诱导HEK293T细胞血红蛋白γ(HBG)基因启动子切割,经阳性克隆筛选、Sanger测序验证、TIDE分析编辑效率、RT-qPCR和western blotting检测γ珠蛋白基因表达量。结果:2条sgRNA序列均能对γ珠蛋白进行基因切割且切割活性分别为44.20%(sgRNA1)、32.90%(sgRNA2),RT-qPCR和western blotting结果显示,与对照组(NCs组,转染空载PX459质粒)相比,sgRNA2组γ珠蛋白基因表达量升高(P<0.05)。结论:CRISPR/Cas9基因编辑技术可在γ珠蛋白启动子上实现有效编辑,从而上调γ珠蛋白。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9编辑 Γ珠蛋白 HEK293t细胞 基因编辑
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逆转座子LINE-1对293T细胞增殖及细胞形态的影响
2
作者 李丹 刘红梅 张鹏 《中国生物工程杂志》 北大核心 2025年第7期1-10,共10页
目的:探索逆转座子LINE-1(long interspersed nuclear elements-1)编码的ORF-1p在维持293T细胞增殖和形态中的作用。方法:利用核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)技术,构建LINE-1 ORF-1p表达量下调的293T细胞系,通过qPCR(quantitative... 目的:探索逆转座子LINE-1(long interspersed nuclear elements-1)编码的ORF-1p在维持293T细胞增殖和形态中的作用。方法:利用核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)技术,构建LINE-1 ORF-1p表达量下调的293T细胞系,通过qPCR(quantitative polymerase chain reaction)和Western blot验证干扰效率,通过免疫荧光染色检测ORF-1p的表达和定位,通过细胞计数和克隆形成实验检测细胞增殖能力,通过鬼笔环肽和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色分析细胞形态。结果:成功构建两种LINE-1敲低的293T细胞系,通过免疫荧光染色观察ORF-1p的表达定位,显示ORF-1p主要分布在细胞质,干扰LINE-1后ORF-1p表达减少;通过细胞计数和集落形成实验,发现下调ORF-1p后细胞的增殖能力和克隆形成能力显著降低(P<0.05);通过鬼笔环肽标记细胞骨架,DAPI标记细胞核,相差显微镜和共聚焦显微镜观察干扰LINE-1后细胞形态,结果显示,下调ORF-1p后shL1-749细胞面积减小,细胞圆润度增加(P<0.05)。结论:成功构建了LINE-1敲低的293T细胞系,发现下调ORF-1p蛋白能够抑制293T细胞的生长,改变细胞形态,为进一步了解LINE-1在细胞增殖和调控中的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 LINE-1 ORF-1p RNAI 293t 细胞增殖 细胞形态
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高葡萄糖诱导对293T细胞类二十烷酸代谢的影响
3
作者 曹洋 柏聪颖 +5 位作者 王文倩 李浩 杜佳欣 郑柏诚 李捷 魏利莎 《湖北农业科学》 2025年第4期171-175,共5页
采用高葡萄糖(50 mmol/L)诱导293T细胞,通过CCK-8试剂盒检测细胞在1~4 d的增殖情况,利用荧光实时定量PCR技术分析细胞中类二十烷酸代谢相关基因及炎症相关基因的mRNA表达水平。结果表明,与正常葡萄糖(25 mmol/L)相比,高葡萄糖刺激后,293... 采用高葡萄糖(50 mmol/L)诱导293T细胞,通过CCK-8试剂盒检测细胞在1~4 d的增殖情况,利用荧光实时定量PCR技术分析细胞中类二十烷酸代谢相关基因及炎症相关基因的mRNA表达水平。结果表明,与正常葡萄糖(25 mmol/L)相比,高葡萄糖刺激后,293T细胞内类二十烷酸代谢相关基因的mRNA表达水平未发生显著变化,仅COX1基因在第5代时出现短暂下调,随后恢复至正常水平。高葡萄糖刺激还导致293T细胞内炎症因子IL-1β的mRNA水平在第11代时显著升高,表明长期高葡萄糖刺激可能诱发293T细胞产生轻度炎症反应。 展开更多
关键词 高葡萄糖 诱导 类二十烷酸代谢 293t细胞
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稳定分泌表达猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白的HEK293T细胞系的构建及鉴定
4
作者 颜仁和 万鹏飞 +2 位作者 刘蕾 楚电峰 毛莹莹 《分子诊断与治疗杂志》 2025年第3期453-457,共5页
目的构建一种高效、稳定表达分泌型猪瘟病毒E2蛋白的HEK-293T细胞株。方法利用分子克隆技术将含有信号肽的猪瘟病毒E2基因插入到慢病毒表达质粒,获得重组慢病毒载体pLV-CMV-E2。通过三质粒转染法包装重组慢病毒并感染HEK-293T细胞,采用... 目的构建一种高效、稳定表达分泌型猪瘟病毒E2蛋白的HEK-293T细胞株。方法利用分子克隆技术将含有信号肽的猪瘟病毒E2基因插入到慢病毒表达质粒,获得重组慢病毒载体pLV-CMV-E2。通过三质粒转染法包装重组慢病毒并感染HEK-293T细胞,采用有限稀释法获得稳定表达分泌性E2蛋白的重组单克隆细胞系。结果重组质粒酶切及PCR鉴定结果可见约1050条带,与CSFV E2基因大小相符;包装慢病毒LV-CSFV E2检测滴度为1×10^(8) copies/mL。慢病毒感染HEK-293T后,经Dot blot和有限稀释法筛选得到7个细胞形态均一、长势良好且E2蛋白表达水平较高的克隆(A4,A5,C1,D1,D2,E1,E2);重组细胞系经PCR及Western blot方法检测到E2基因及蛋白所对应特异性条带。将重组细胞系连续传至70代,E2蛋白表达水平稳定不变;免疫学实验结果显示,重组E2蛋白能够与猪瘟阳性血清发生特异性反应。结论本研究成功建立了一种稳定高效地表达分泌性重组E2蛋白的真核表达系统,为研究猪瘟E2亚单位疫苗及血清学诊断方法等奠定基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2囊膜蛋白 慢病毒载体 HEK-293t细胞
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磷酸化TauS214对HT22细胞和HEK293T细胞焦亡及炎症的影响
5
作者 陈慧琳 操蓉 +3 位作者 文亿 王能琴 齐晓岚 唐智 《贵州医科大学学报》 2025年第8期1093-1105,1119,共14页
目的构建阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)Tau蛋白异常磷酸化体外模型,探究磷酸化TauS214对细胞焦亡及炎症的影响。方法以NCBI中人源Tau40(h-Tau40)基因序列为模板设计突变引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)... 目的构建阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)Tau蛋白异常磷酸化体外模型,探究磷酸化TauS214对细胞焦亡及炎症的影响。方法以NCBI中人源Tau40(h-Tau40)基因序列为模板设计突变引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增目的基因,经限制性内切酶(restriction endonuclease,RE)BglⅡ和EcoR I双酶切后定向克隆到载体pEGFP-C1中,构建Tau突变体(TauS214E、TauS214A、TauP301L),测序鉴定正确后将质粒瞬时转染至HEK293T和HT22细胞,免疫荧光法检测重组Tau蛋白定位情况,蛋白质印迹法检测pTauS214、pTauS404和Tau5的表达,检测NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、Gasdermin D N端片段(GSDMD-N)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-6(IL-6)的表达水平。结果成功构建Tau蛋白重组质粒并在两种细胞中稳定表达;Tau40和TauP301L组中pS214表达显著降低,pS404表达升高(P<0.05),NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18、IL-6表达显著增加(P<0.05);TauS214E与Tau40相比,pS214表达显著升高,pS404表达显著降低(P<0.05),NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18、IL-6表达显著降低(P<0.05)。结论Tau40和TauP301L通过调节Tau蛋白磷酸化水平显著促进细胞焦亡和炎症反应,而TauS214E位点抑制炎性小体激活或阻断细胞焦亡。 展开更多
关键词 阿尔茨海默病 TAU蛋白 质粒 细胞焦亡 炎症 HT22 HEK293t
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犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达 被引量：4
6
作者 靳慧君 仲飞 +3 位作者 吴凌娟 解民 王微 韩冬梅 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第5期897-902,共6页
哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将... 哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank编号:NM-001024641)的同源性为99.7%。表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外。为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 犬β防御素-1 载体构建 HEK293t细胞 表达
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真核表达载体pEGFP-claudin-1的构建及其在293T细胞中的表达 被引量：4
7
作者 魏欣 张野 +5 位作者 李军 马力 潘蕾 王平忠 白雪帆 贾战生 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期444-446,共3页
目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho I和BamH I酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴... 目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho I和BamH I酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和Western blot分析。结果:构建了含有claudin-1 ORF的真核表达质粒pEGFP-claudin-1,转染293T细胞后,经荧光可见细胞膜有EGFP-claudin-1融合蛋白的表达,Western blot检测发现有相对分子质量(Mr)49000的蛋白条带。结论:成功地构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中表达,为研究claudin-1的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 CLAUDIN-1 绿色荧光蛋白 真核表达载体 293t细胞
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二甲基亚砜和胎牛血清对293T细胞冷冻效果的影响 被引量：4
8
作者 李佳佳 程腾 +4 位作者 贺小英 梁波 陈秀莉 籍凤宇 马利兵 《信阳师范学院学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2013年第2期217-220,共4页
使用含不同体积分数二甲基亚砜(DMSO)(5%、10%、15%、20%)和不同体积分数胎牛血清(FBS)(5%、10%、20%、40%)的细胞冷冻液以三步冷冻法冻存293T细胞.台盼蓝染色法进行活细胞计数后计算出解冻后细胞存活率.结果表明:FBS对293T细胞冷冻效... 使用含不同体积分数二甲基亚砜(DMSO)(5%、10%、15%、20%)和不同体积分数胎牛血清(FBS)(5%、10%、20%、40%)的细胞冷冻液以三步冷冻法冻存293T细胞.台盼蓝染色法进行活细胞计数后计算出解冻后细胞存活率.结果表明:FBS对293T细胞冷冻效果的影响是显著的(P<0.05),但添加20%和40%FBS的效果无显著差异(P>0.05);DMSO对293T细胞冷冻效果的影响则是极显著的(P<0.01),添加10%DMSO时,细胞的冷冻效果最好;冷冻液中含10%DMSO、40%FBS时的冷冻效果最佳,细胞存活率可达到82.00%.而实际应用中,含10%FBS、10%DMSO或20%FBS、5%～10%DMSO的细胞冷冻液也可达到较理想的冷冻效果,足以达到一般实验的要求. 展开更多
关键词 293t细胞 二甲基亚砜 胎牛血清 冷冻效果
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TALEN质粒转染HEK-293T细胞的条件优化 被引量：3
9
作者 严爱芬 刘婉霞 +3 位作者 刘芳 刘靖 张雅洁 唐冬生 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2554-2559,共6页
本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光... 本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光细胞,计算绿色荧光细胞/总细胞数的比例得出转染率,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验结果表明,TALEN质粒转染293T细胞,采用Fugene HD转染试剂比Lipofectamine 2000转染试剂细胞存活率高;以6孔板为例,转染质粒DNA量为4μg时转染效率最高(49.0±8.0)%;Fugene HD与质粒DNA比例(μg/μL)为3:1时转染效率最高。本研究建立TALEN表达质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件,可作为相关研究或应用提供参考。 展开更多
关键词 转染 优化 TALEN HEK-293t
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柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达 被引量：7
10
作者 王晔 姜连连 +6 位作者 韩红玉 薛璞 赵其平 董辉 朱顺海 舒凡帆 黄兵 《中国动物传染病学报》 CAS 2012年第5期39-44,共6页
为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Te... 为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 棒状体颈部蛋白2 293t细胞 真核表达
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反义核酸抑制miR-20、miR-106表达对293T细胞增殖的影响 被引量：3
11
作者 李有杰 张帅 +4 位作者 高宗华 张文娟 谢书阳 张鹏举 姜安丽 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1665-1669,共5页
目的:通过反义核酸技术抑制miR-20、miR-106的表达,检测对293T细胞增殖的影响。方法:应用特异性针对miR-20、miR-106的反义核酸转染293T细胞,用形态学、流式细胞技术研究反义核酸对细胞增殖的抑制作用,用定量PCR和ELISA研究miRNA和相关... 目的:通过反义核酸技术抑制miR-20、miR-106的表达,检测对293T细胞增殖的影响。方法:应用特异性针对miR-20、miR-106的反义核酸转染293T细胞,用形态学、流式细胞技术研究反义核酸对细胞增殖的抑制作用,用定量PCR和ELISA研究miRNA和相关靶基因的表达。结果:研究发现反义核酸可有效抑制miR-20和miR-106的表达,并明显抑制293T细胞的增殖;研究还表明反义miR-106可明显上调抑癌基因Rb的表达。结论:反义核酸通过抑制miRNA表达,上调抑癌基因Rb的表达,能明显抑制293T细胞增殖。 展开更多
关键词 RNA 反义 MIRNA 293t细胞 细胞增殖 基因表达
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一种高效稳定的磷酸钙转染293T细胞方法的建立及评价 被引量：4
12
作者 华进 程志彬 +2 位作者 林春霖 戴起宝 朱广伟 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1177-1181,I0006,共6页
目的:探讨2种磷酸钙转染法转染293T细胞的效果,建立一种实现高效稳定磷酸钙转染293T细胞的方法。方法:荧光显微镜观察采用2种磷酸钙转染方法(传统磷酸钙转染法和改良磷酸钙转染法)转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞的转染效率... 目的:探讨2种磷酸钙转染法转染293T细胞的效果,建立一种实现高效稳定磷酸钙转染293T细胞的方法。方法:荧光显微镜观察采用2种磷酸钙转染方法(传统磷酸钙转染法和改良磷酸钙转染法)转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞的转染效率。采用Real-time PCR法和Western blotting法分别检测2种磷酸钙转染方法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞后,肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6) mRNA和flag蛋白表达水平。结果:荧光显微镜下观察,与传统磷酸钙转染法比较,改良磷酸钙转染法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24 和48 h后的转染效率明显升高( P <0.01);Real-time PCR法和Western blotting法检测,与传统转染方法比较,磷酸钙转染改良法转染pCDH-GFP-3xflag-TRAF6质粒进入293T细胞24 和48 h后,TRAF6 mRNA 和flag蛋白表达水平均明显升高( P <0.01)。结论:本研究建立的改良磷酸钙转染方法是一种高效、稳定的DNA转染方法。 展开更多
关键词 磷酸钙转染 293t细胞 肿瘤坏死因子受体相关因子6 flag蛋白
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鸡MHCⅠα和β2m链基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达 被引量：4
13
作者 戴银 胡晓苗 +5 位作者 赵瑞宏 侯宏艳 沈学怀 潘孝成 周学利 张丹俊 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第8期1938-1943,共6页
为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCh... 为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCherry-MHCⅠβ_2m,并通过脂质体法转染293T真核表达细胞。荧光显微镜观察可见,MHCⅠα和β_2m分子主要分布于真核细胞的内膜系统,改变了与之融合的荧光蛋白在细胞内的定位。此外,Western blotting检测可见大小约68.3和41.3ku的目的蛋白反应带,表明重组质粒能够在293T细胞中顺利表达,且表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应,具有良好的免疫学活性。 展开更多
关键词 鸡MHCⅠα基因 鸡MHCⅠβ2m链基因 真核表达载体 293t细胞
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一种高效稳定的磷酸钙转染HEK293T细胞的方法 被引量：4
14
作者 况野 房有荣 +6 位作者 刘丽 王蓉 严子琴 李海龙 孟凡国 盛清 欧文斌 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期407-413,共7页
为了克服磷酸钙转染法在真核细胞中转染效率低和不稳定性等缺点,适用于体外在哺乳细胞中高效表达外源蛋白,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达质粒通过常规的磷酸钙转染法导入到HEK293T细胞中,对影响质粒转染效率的条... 为了克服磷酸钙转染法在真核细胞中转染效率低和不稳定性等缺点,适用于体外在哺乳细胞中高效表达外源蛋白,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达质粒通过常规的磷酸钙转染法导入到HEK293T细胞中,对影响质粒转染效率的条件逐步予以优化,具体包括:在制备磷酸钙-DNA沉淀复合物时,对DNA质粒的用量和涡旋混匀时间的优化;磷酸钙-DNA沉淀形成后对转染促进剂(甘油、丁酸钠和氯喹)的浓度、作用时间及其组合进行优化和筛选。结果表明:GFP转染6孔板培养的HEK293T细胞的DNA质粒最适用量为3μg/孔,其转染效率较1和2μg/孔的平均转染效率提高了50%,较4和5μg/孔的平均转染效率提高了70%以上;涡旋混匀时间最佳为10s,比涡旋混匀5s时的转染效率提高了80%;在上述优化条件基础上加入不同的转染促进剂,其中单独使用15%甘油处理细胞6.5min时,所得转染效率较2.5、4.5、8.5和10.5min有明显提高,15%甘油+5mmol/L丁酸钠联用或者单独用500μmol/L氯喹处理细胞后,转染效率较常规方法分别提高了80%和75%,且荧光表达强度有所增强。总之,该文通过对磷酸钙转染时和转染后的条件进行优化,使其转染效率较常规方法有了显著提高,相对于脂质体转染法更加安全可靠,且价格低廉,因此可适用于大规模蛋白表达质粒转染或者病毒包装,尤其适用于各种糖基化蛋白如肿瘤诊断标志物在体外的高通量表达与制备。 展开更多
关键词 磷酸钙转染 HEK293t细胞 转染促进剂 甘油 丁酸钠 氯喹
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过表达泛素偶联酶E2C对293T细胞增殖的影响 被引量：2
15
作者 黄湘 邱玉林 +2 位作者 谭家余 乔亚峰 李明 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期634-636,共3页
目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用W... 目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用Western blot技术检测并鉴定UBE2C基因在293T细胞中的表达情况;用MTT法检测UBE2C对293T细胞增殖的影响。结果:Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的UBE2C蛋白表达水平明显高于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。MTT法检测结果显示转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的增殖速度明显快于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。结论:成功建立稳定过表达UBE2C的293T细胞株,过表达UBE2C可促进293T细胞的增殖。 展开更多
关键词 UBE2C 过表达 293t细胞株 增殖
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过表达Grx1抑制HEK293T细胞中H2O2诱导的p38MAPK信号通路 被引量：3
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作者 邹朝霞 李强 +4 位作者 刘莹莹 吴莉芳 张春晶 房绍红 周宏博 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期537-542,共6页
谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)是细胞内一种重要的巯基-二硫键氧化还原酶,在细胞内氧化还原状态的调控及抵抗氧化应激损伤过程中发挥重要作用.为进一步探讨Grx1的抗氧化机制,本实验将重组质粒pcDNA3.1(+)-hGrx1瞬时转染HEK293T细胞,... 谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)是细胞内一种重要的巯基-二硫键氧化还原酶,在细胞内氧化还原状态的调控及抵抗氧化应激损伤过程中发挥重要作用.为进一步探讨Grx1的抗氧化机制,本实验将重组质粒pcDNA3.1(+)-hGrx1瞬时转染HEK293T细胞,经RT-PCR和Western印迹验证,细胞转染后实现了Grx1的过表达;以不同浓度H2O2为损伤因素,建立细胞氧化应激模型,检测过表达Grx1后细胞存活率,丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活力和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的变化,观察过表达Grx1后细胞的抗氧化能力;用终浓度100μmol/L H2O2作用于细胞,利用Western印迹检测120 min内HEK293T细胞中p38MAPK磷酸化水平.实验结果表明,HEK293T细胞过表达Grx1后,缓解了细胞的氧化应激损伤;转染空载体组细胞p38MAPK磷酸化水平在H2O2刺激后5min开始升高,15min达到最高值,并可维持至120min左右;而过表达Grx1组细胞p38MAPK磷酸化水平在H2O2刺激后各时间段没有明显改变,提示Grx1通过抑制H2O2诱导的p38MAPK信号通路激活发挥其抗氧化作用. 展开更多
关键词 谷氧还蛋白 HEK293t细胞 氧化应激 P38MAPK 瞬时转染
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EGFP-CIDE-3及D sRed1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位 被引量：2
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作者 谷雨 李青 +6 位作者 叶菁 李烦繁 闵婕 张丽英 马钰 李航 刘芳 《医学研究生学报》 CAS 2008年第9期911-914,I0002,共5页
目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位。方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a(+)-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed1 ... 目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位。方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a(+)-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed1、CIDE-3克隆入真核表达载体pShuttle-CMV中。酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染入293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系。结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3构建成功。荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系。结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系。 展开更多
关键词 CIDE-3 融合蛋白 EGFP DsRed1 293t细胞
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柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3在293T细胞中的表达研究 被引量：3
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作者 王晔 韩红玉 +6 位作者 董辉 姜连连 赵其平 朱顺海 薛璞 舒凡帆 黄兵 《中国动物传染病学报》 CAS 2013年第6期33-38,共6页
为构建柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinases 3,EtCDPK3)基因的重组质粒pCAGGS-EtCDPK3,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其含完整开放阅读框的序... 为构建柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinases 3,EtCDPK3)基因的重组质粒pCAGGS-EtCDPK3,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其含完整开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM-T easy载体,构建pGEM-Teasy-EtCDPK3重组质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3。该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtCDPK3基因的表达情况。结果显示所构建的真核重组表达质粒pCAGGSEtCDPK3经过双酶切鉴定,可见1条大小约为1302 bp的目的条带,测序结果与实验室已获得的EtCDPK3序列完全一致;Western blot结果可见大小约为49 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光。这些研究结果表明已成功构建了EtCDPK3的真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtCDPK3的功能和制备DNA疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 钙依赖蛋白激酶3基因 293t细胞 真核表达
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鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达及其抗病毒活性 被引量：2
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作者 陈胜锋 王丙云 +3 位作者 高健潜 陈志胜 计慧琴 陈金顶 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第10期5879-5881,共3页
[目的]研究鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达并检测其抗病毒活性。[方法]将鸡的Mx基因克隆入pEGFP-C1载体,经筛选鉴定后磷酸钙法转染293T细胞,并对转染细胞进行荧光分析以及RT-PCR与Western blot鉴定,同时提取细胞蛋白质,微量细胞病变试验检... [目的]研究鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达并检测其抗病毒活性。[方法]将鸡的Mx基因克隆入pEGFP-C1载体,经筛选鉴定后磷酸钙法转染293T细胞,并对转染细胞进行荧光分析以及RT-PCR与Western blot鉴定,同时提取细胞蛋白质,微量细胞病变试验检测其抗新城疫病毒的活性。[结果]试验构建的pEGFP-C1-cMx真核表达载体转染293T细胞后,在胞浆中可检测到绿色荧光,RT-PCR与Western blot结果进一步证实,pEGFP-C1-cMx可在293T细胞中表达,微量细胞病变试验显示,表达的融合蛋白可保护鸡胚成纤维细胞免受新城疫病毒感染。[结论]试验构建的pEGFP-C1-cMx表达载体可在293T细胞中表达具有抗新城疫病毒活性的鸡Mx蛋白。 展开更多
关键词 鸡Mx蛋白 真核表达 293t 抗病毒
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蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2对去血清培养诱导的293T细胞凋亡的作用 被引量：2
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作者 王秀丽 董红岩 +5 位作者 杨金霞 张明爽 张卓然 吴博 徐长庆 张力 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期548-551,共4页
目的:探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2对去血清培养诱导人胚肾293T细胞凋亡的作用。方法:将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2(WT)野生型及pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体通过脂质体法转染293T细胞,MTT测定去血清培养对293T细胞增殖的抑制情况,... 目的:探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2对去血清培养诱导人胚肾293T细胞凋亡的作用。方法:将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2(WT)野生型及pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体通过脂质体法转染293T细胞,MTT测定去血清培养对293T细胞增殖的抑制情况,去血清培养293T细胞3 d后,电镜观察超微结构、流式细胞仪检测细胞凋亡率、免疫组织化学方法测定caspase-3表达。结果:去血清培养293T细胞3 d,转染pIRES-GFP-SHP-2(WT)野生型组的293T细胞凋亡率明显低于对照组和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体组;而2转染组超微结构均发生早期凋亡,但并无明显差异;caspase-3免疫组化结果显示SHP-2(WT)野生型组的caspase-3表达率明显低于SHP-2C459S突变体组。结论:SHP-2可能参与到去血清培养诱导细胞凋亡的信号转导通路中并通过caspase-3依赖途径,对细胞的生存起到正向调节作用。 展开更多
关键词 Sic同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2 293t细胞 细胞凋亡 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3
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