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基于RT-RPA-LFD技术的烟草轻型绿花叶病毒高灵敏快速检测方法的建立与应用
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作者 秦艳红 鲁书豪 +9 位作者 于红卫 郝学政 薛凤杰 高素霞 文艺 李绍建 杨瑾 李雪梦 王飞 鲁传涛 《植物病理学报》 北大核心 2026年第1期159-165,共7页
根据烟草轻型绿花叶病毒(tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因设计引物和探针,将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相... 根据烟草轻型绿花叶病毒(tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因设计引物和探针,将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了一种TMGMV的快速检测方法,对该检测方法中的反应时间、反应温度进行了优化,并检测了该方法的特异性和灵敏度。试验结果表明,RT-RPA-LFD检测体系的最佳反应条件是温度37℃、反应时间30 min。该方法能够特异性检测TMGMV,与其它病毒无交叉反应,对TMGMV CP的最低检测限度为1.65×10^(0)拷贝·μL^(-1),比普通PCR检测灵敏度高10倍。该方法灵敏度高、特异性强,能够用于田间地黄样品中TMGMV的检测,便于基层科研单位对该病毒的准确检测和诊断。 展开更多
关键词 烟草轻型绿花叶病毒 地黄 RPA恒温扩增 快速检测
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猪链球菌2型和9型双重Basic-RPA检测方法的构建与应用
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作者 张慧辉 王可心 +6 位作者 李艳伟 魏小兵 王磊 胡建和 丁轲 刘明成 夏小静 《河南农业大学学报》 北大核心 2025年第5期849-858,共10页
【目的】通过构建猪链球菌(Streptococcus suis,SS)2型(SS2)和9型(SS9)双重快速检测方法,为监测SS的流行和传播提供技术支持。【方法】分别以SS2特有荚膜多糖糖编码基因(capsular polysaccharide 2J gene,cps2J)和SS9特有荚膜多糖糖编... 【目的】通过构建猪链球菌(Streptococcus suis,SS)2型(SS2)和9型(SS9)双重快速检测方法,为监测SS的流行和传播提供技术支持。【方法】分别以SS2特有荚膜多糖糖编码基因(capsular polysaccharide 2J gene,cps2J)和SS9特有荚膜多糖糖编码基因(capsular polysaccharide 9H gene,cps9H)为靶标设计引物和探针,对反应体系和反应条件进行优化,建立基础型重组酶聚合酶等温扩增(Basic-recombinase polymerase amplification,Basic-RPA)快速检测技术,并对其特异性、灵敏度、重复性和临床应用效果进行评价。【结果】构建的SS2/9双重Basic-RPA检测方法引物为CPS2J212和CPS9H304,引物体积V(CPS2J212/μL)∶V(CPS9H304/μL)为2.4∶1.8,反应温度为39℃,反应时间为20 min。特异性结果表明,该方法与其他常见病原体无交叉反应,特异性良好。灵敏度结果显示,该方法针对SS2/9检测限达到1×10^(-3) mg·L^(-1),优于常规PCR的1×10^(-2) mg·L^(-1)。重复性结果显示,该方法有良好的稳定性。用该方法对41例临床样品进行检测,其检出率为24.4%,与单重Basic-RPA方法检测结果一致,高于细菌分离方法的检出率12.2%,以及常规PCR方法的检出率19.5%。【结论】构建的SS2/9的双重Basic-RPA检测方法,特异性和稳定性好,灵敏度高,可应用于SS快速诊断和血清分型。 展开更多
关键词 猪链球菌 基础型重组酶聚合酶等温扩增 荚膜多糖 血清分型 双重检测
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葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系的建立 被引量:3
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作者 黄强 张强强 顾沛雯 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第4期89-97,共9页
【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜... 【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计了PF1/PR1、PF2/PR2和PF3/PR3共3对引物及探针RPA-P,对葡萄霜霉病菌DNA的ITS序列进行PCR扩增,建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,并对其反应条件进行优化,对其特异性和灵敏性进行检测。【结果】建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,引物PF1/PR1和探针RPA-P对靶标片段具有良好的特异性,检测条件为36℃扩增30 min,对葡萄霜霉病菌具有特异性;最低检测下限为10 pg/μL,灵敏性略低于常规PCR(1 pg/μL)和荧光定量PCR(100 fg/μL);对田间发病叶片的检测结果与常规PCR一致,准确性高。【结论】建立的葡萄霜霉病菌重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测体系,可以对目标物质进行快速、可视化检测,具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点,适宜推广使用。 展开更多
关键词 葡萄霜霉病 葡萄生单轴霉 重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测 病原检测
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基于RT-RPA-LFD等温扩增的西瓜银斑驳病毒快速检测技术的建立及应用
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作者 李文扬 修筠清 +7 位作者 徐志红 王敏 古勤生 康保珊 刘莉铭 赵胜杰 玉山江·麦麦提 吴会杰 《园艺学报》 北大核心 2025年第11期3079-3089,共11页
建立了一种基于逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术的西瓜银斑驳病毒(watermelon silver mottle virus,WSMoV)快速检... 建立了一种基于逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术的西瓜银斑驳病毒(watermelon silver mottle virus,WSMoV)快速检测方法。针对WSMoV的L基因保守序列设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,确定RT-RPA-LFD最佳引物浓度为0.1μmol·L^(-1)、探针浓度为0.06μmol·L^(-1)、反应温度为37℃和时间12 min。该方法对WSMoV具有高度特异性,与黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、新德里番茄曲叶病毒(tomato leaf curl new delhi virus,To LCNDV)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus,MYSV)等常见西甜瓜病毒无交叉反应;灵敏度与RT-PCR一致,最低检测限达总RNA的10^(-4)稀释度。对田间32份西甜瓜样品进行检测验证,RT-RPA-LFD与RT-PCR均检出14份阳性,结果一致。本研究建立的RT-RPA-LFD方法反应温度恒定,扩增时间约12 min,结合侧向层析检测,整个过程在20 min内完成,较传统RT-PCR(约2~3 h)更为简便快捷,且检测结果可视,可用于WSMo V的田间现场快速检测。 展开更多
关键词 西瓜 西瓜银斑驳病毒 RT-rpa-LFD 可视化检测
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甲型肝炎病毒RT-RPA结合侧流横向试纸条快检方法的建立
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作者 徐佳乐 汪艺涵 +1 位作者 王永杰 喻勇新 《生物学杂志》 北大核心 2025年第6期101-107,共7页
研究针对甲型肝炎病毒(HAV)的快速检测需求,开发一种基于逆转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)技术结合侧流横向试纸条(LFS)的新型检测方法。从GenBank核苷酸数据库下载HAVⅠ~Ⅲ基因型序列,进行基因分型、分析,设计RT-RPA引物和探针。该方... 研究针对甲型肝炎病毒(HAV)的快速检测需求,开发一种基于逆转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)技术结合侧流横向试纸条(LFS)的新型检测方法。从GenBank核苷酸数据库下载HAVⅠ~Ⅲ基因型序列,进行基因分型、分析,设计RT-RPA引物和探针。该方法能在42℃、20 min内完成HAV检测,灵敏度达到10 copies/μL,具有高度特异性,不与其他肠道病毒产生交叉反应,并且重复性达到71.4%,相较传统RT-qPCR技术,展现出更高的灵敏度和操作便捷性。RT-RPA-LFS检测技术的建立为HAV的现场快速诊断提供技术支持,对提高HAV检测效率、预防和控制HAV引起的食源性疫情具有重要意义。随着HAV疫苗的广泛使用,该检测技术的发展对区分疫苗株和野生株以及应对未来病毒多重检测的需求具有潜在的应用前景,为食品安全监测和公共卫生领域提供新的技术手段。 展开更多
关键词 甲型肝炎病毒 RT-rpa-LFS 灵敏度 特异性 现场诊断
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利用RT-RPA-CRISPR/Cas12a方法检测马铃薯纺锤块茎类病毒
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作者 徐司琦 韩春雪 +4 位作者 王欣宇 谢丽杨 王琰 周涛 范在丰 《植物检疫》 2025年第3期22-28,共7页
马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)是中国重要检疫性病原物之一,能够侵染茄科等多个科的植物,导致严重病害,具有高度侵袭性和潜伏期长的特点,极易传播。本研究针对PSTVd基因组,建立了基于反转录(reverse transcr... 马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)是中国重要检疫性病原物之一,能够侵染茄科等多个科的植物,导致严重病害,具有高度侵袭性和潜伏期长的特点,极易传播。本研究针对PSTVd基因组,建立了基于反转录(reverse transcription,RT)-重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)和CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas12a)的RT-RPA-CRISPR/Cas12a可视化核酸检测系统。结果表明,整个过程可在45 min内完成,只有PSTVd质粒检测结果呈阳性,作为对照的5种茄科植物病毒与空白对照检测结果均呈阴性反应,检测灵敏度为4.134×10^(-7)ng/μL。本研究建立的RT-RPA-CRISPR/Cas12a可视化核酸检测方法特异性强、灵敏度高,操作简便,适用于田间或口岸现场,利于PSTVd的监测与暴发流行的早期预警。 展开更多
关键词 马铃薯纺锤块茎类病毒 CRISPR/Cas12a RT-rpa 快速检测
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齿兰环斑病毒RT-RPA荧光实时检测体系的构建与应用
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作者 吴洁秋 庄华才 +4 位作者 谭志勇 李早文 范俊强 傅海平 徐匆 《热带作物学报》 北大核心 2025年第7期1745-1753,共9页
齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑... 齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是危害兰花的主要致病病毒之一,该病毒导致兰花叶片黄化、出现斑块,花朵畸形,对兰花的观赏性和商业价值影响极大。为实现ORSV的早期快速检测,本研究根据Gen Bank数据库中兰花齿兰环斑病毒外壳蛋白cp基因的保守区域设计、筛选RT-RPA引物和探针,优化扩增条件,建立基于RPA的ORSV快速检测技术;对RT-RPA特异性和灵敏性进行测定,并通过开展田间样品检测试验,以验证该检测技术在生产上的应用可行性。结果表明:RT-RPA的最佳扩增引物组合为F1/R1,荧光探针为P1,最佳扩增温度为41℃,扩增时间为20 min;特异性良好,对建兰花叶病毒、黄瓜花叶病毒无交叉反应;灵敏度较高,ORSV核酸最低检测浓度达到2.8×10^(–5 )ng/μL。田间样品检测中,采用齿兰环斑病毒为阳性对照,dd H_(2)O为阴性对照,20份蝴蝶兰样本均检出ORSV,与Taq Man探针RT-q PCR (real time quantitative PCR)检测结果一致。本研究建立的ORSV RT-RPA荧光实时检测技术,具有快速、灵敏、准确和简便的优点,且适用于田间样品检测,为兰花病害预防、切断感染源和控制ORSV的传播提供有效方法,有助于兰花产业的健康发展。 展开更多
关键词 兰花 齿兰环斑病毒 反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-rpa) 检测
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Exploring Distinct Ethical Challenges Deriving from AI-RPA Technical Characteristics
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作者 Jelle Tuls 《Journal of Computer and Communications》 2025年第2期16-27,共12页
Addressing the existing gap in ethical research surrounding distinct technical characteristics of Robotic Process Automation enhanced with Artificial Intelligence (AI-RPA), this analysis examines the unique ethical di... Addressing the existing gap in ethical research surrounding distinct technical characteristics of Robotic Process Automation enhanced with Artificial Intelligence (AI-RPA), this analysis examines the unique ethical dimensions by positioning AI-RPA as a distinct technological subdivision. From an analytical perspective, this study highlights key characteristics such as minimal reliance on programming, rapid development cycles, and restricted algorithmic control, which differentiate AI-RPA from traditional AI systems. These characteristics underscore the need for tailored ethical considerations, to identify ethical perils within AI-RPA’s technological origins. By positioning AI-RPA as a distinct subdivision and examining its unique characteristics alongside their emerging ethical challenges, this paper enriches the evolving discourse on AI ethics, providing valuable insights for researchers, policymakers, and organizations implementing AI-RPA technologies. 展开更多
关键词 Robotic Process Automation Artificial Intelligence AI-rpa Digital Ethics Distinct Characteristics
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RPA驱动的AI大模型出题系统构建
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作者 魏丽芬 庞晓晨 张丹 《福建电脑》 2026年第2期73-77,共5页
本文构建了基于RPA与AI大模型的自动化出题系统,以应对传统命题中效率低、覆盖不均及题型单一等问题。系统整合RPA流程自动化与AI生成能力,依托结构化知识点库与提示词工程技术,实现多题型、情境化试题的智能生成,并构建“机器生成—人... 本文构建了基于RPA与AI大模型的自动化出题系统,以应对传统命题中效率低、覆盖不均及题型单一等问题。系统整合RPA流程自动化与AI生成能力,依托结构化知识点库与提示词工程技术,实现多题型、情境化试题的智能生成,并构建“机器生成—人工审核—迭代优化”的人机协同机制。测试结果表明,“RPA+AI”模式每题出题时间约5秒,含人工审核后平均每题耗时约9秒,错误率仅为0.07%,在效率和稳定性方面显著优于“人工+AI”模式。该系统有效提升了命题效率与标准化水平,为教育测评智能化提供了可行的技术路径。 展开更多
关键词 机器人流程自动化 AI大模型 智能出题 提示词工程
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游客视角下禅武文化形象感知研究——以《禅宗少林·音乐大典》实景演出为例
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作者 安传艳 邱丽苹 岳贤锋 《资源开发与市场》 2026年第3期473-480,共8页
《禅宗少林·音乐大典》实景演出作为少林禅武文化的重要表现形式,已成为宣传地方文化、发展体育旅游的重要名片。基于“认知-情感-整体”模型,采用内容分析法探讨游客视角下《禅宗少林·音乐大典》中的禅武文化形象。结果发现... 《禅宗少林·音乐大典》实景演出作为少林禅武文化的重要表现形式,已成为宣传地方文化、发展体育旅游的重要名片。基于“认知-情感-整体”模型,采用内容分析法探讨游客视角下《禅宗少林·音乐大典》中的禅武文化形象。结果发现:①游客对禅武文化的认知形象主要围绕实景(自然环境)、文化(形象符号)、服务(旅游设施)和演出(艺术表现)4个方面展开;②游客的情感体验以积极情感为主,主要来自于演出中的舞台效果,灯光、音效和水幕等现代演艺手段的应用给游客带来更为深入的体验;③整体形象感知以演出为主、实景为辅,综合正面感知占比较高,催生了“不离世间觉”与“内外兼修、禅武合一”的禅武文化意象。 展开更多
关键词 《禅宗少林·音乐大典》 禅武文化 实景演出 形象感知
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A型动物流感病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用 被引量:9
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作者 王潇 曹琛福 +3 位作者 林彦星 黄超华 贾伟新 花群义 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期1-6,共6页
根据A型流感病毒M基因核苷酸序列设计引物及探针,建立了一种灵敏度高、特异性强、检测迅速、操作简便的重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)。选用常见动物疫病病原验证引物探针的特异性,设计多对引物及探针,筛选出最适反应体系及反应条件,... 根据A型流感病毒M基因核苷酸序列设计引物及探针,建立了一种灵敏度高、特异性强、检测迅速、操作简便的重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)。选用常见动物疫病病原验证引物探针的特异性,设计多对引物及探针,筛选出最适反应体系及反应条件,并与实时荧光RT-PCR方法比较。结果显示,本研究建立的RT-RPA方法特异性强,只有A型动物流感病毒呈阳性,其他相关常见病原均为阴性;反应时间短,检测反应时间仅需20 min;灵敏度高,最低可检测到A型动物流感病毒核酸浓度为0.96×10-2g/mL。与实时荧光RT-PCR方法相比,其灵敏度稍低。本研究建立的检测A型动物流感病毒的RT-RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,检测快速,适合现场检测以及在基层实验室推广应用。 展开更多
关键词 A型动物流感病毒 重组酶聚合酶扩增技术(RPA) 等温扩增
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南方菜豆花叶病毒RT-RPA检测方法的建立 被引量:11
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作者 魏霜 袁俊杰 +7 位作者 李桂芬 乾义柯 魏梅生 冯黎霞 胡学难 何日荣 武目涛 张永江 《植物检疫》 北大核心 2018年第1期50-53,共4页
本研究针对南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)保守序列设计了特异性PRA引物,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA),采用SBMV,BPMV,SMV,Ar MV和TRSV共5种病毒评价该方法的特异性,并对其灵敏... 本研究针对南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)保守序列设计了特异性PRA引物,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA),采用SBMV,BPMV,SMV,Ar MV和TRSV共5种病毒评价该方法的特异性,并对其灵敏度进行评价。结果显示,建立的RT-RPA方法特异性强;灵敏度达到0.1 ng。本研究建立的RT-RPA方法检测SBMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。 展开更多
关键词 南方菜豆花叶病毒 RPA 检测
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两种双生病毒ToLCNDV和TYLCV双重RPA快速检测方法的建立
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作者 员雅楠 韩雨菲 +5 位作者 高萍 徐丽慧 高士刚 宋志伟 曾蓉 戴富明 《植物病理学报》 北大核心 2026年第1期150-158,共9页
新德里番茄曲叶病毒(tomato leaf curl New Delhi virus, ToLCNDV)和番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)均由烟粉虱传播,在自然条件下能复合侵染番茄,危害巨大。因此,建立一种准确、快速、能够同时检测这两种病毒... 新德里番茄曲叶病毒(tomato leaf curl New Delhi virus, ToLCNDV)和番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)均由烟粉虱传播,在自然条件下能复合侵染番茄,危害巨大。因此,建立一种准确、快速、能够同时检测这两种病毒的检测方法,对于快速诊断和田间监测具有重要的意义。本研究基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)技术,开发了一种靶向ToLCNDV和TYLCV的双重RPA检测方法,其灵敏度为10^(4) copies·mL^(-1),反应仅需25 min,可用于植物和烟粉虱中ToLCNDV和TYLCV的检测,是鉴定和监测这两种病毒便捷和灵敏的新方法。 展开更多
关键词 新德里番茄曲叶病毒 番茄黄化曲叶病毒 双重RPA 快速检测
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鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i:-双重RT-RPA快速检测方法的建立 被引量:2
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作者 蒋增海 徐耀辉 +5 位作者 张晓战 彭志锋 陈益 唐光武 吕玉金 乐敏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1254-1261,共8页
为了保障食品公共卫生安全,基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA),针对鼠伤寒沙门菌、沙门菌血清型4,[5],12:i:-共同携带的STM4495基因以及鼠伤寒沙门菌携带的flj B1,2基因,设计2条探针和一系列候选引物,并进行引物筛选、特异性试... 为了保障食品公共卫生安全,基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA),针对鼠伤寒沙门菌、沙门菌血清型4,[5],12:i:-共同携带的STM4495基因以及鼠伤寒沙门菌携带的flj B1,2基因,设计2条探针和一系列候选引物,并进行引物筛选、特异性试验、敏感性试验、各种方法比较检测和人工污染试验,建立一种快速检测鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i:-的双重RT-RPA方法。结果显示,该方法在39℃条件下20 min内完成检测,鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i:-的检测下限分别为25.6和251CFU/0.1 m L,不能检出其他肠道致病菌,针对猪产业链及临床样品来源的99株沙门菌与PCR、RT-PCR方法的检测结果一致,针对人工污染样品的检测结果与传统培养法一致。本研究成功建立了一种快速检测鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i:-的双重RT-RPA方法,具有特异性高、敏感性强的特点,快速简便,20min获取检测结果,在新鲜猪肉、临床病猪肝样品中得到初步应用。 展开更多
关键词 鼠伤寒沙门菌 鼠伤寒单相变种 重组酶聚合酶扩增法 快速检测方法
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CRISPR/Cas13a与RPA联用技术在鲤浮肿病毒(CEV)现场快速检测中的应用
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作者 辛卓润 王津津 +8 位作者 廖立珊 赖晓芳 王飞帆 吴江 张磊 张子怡 刘荭 姜敬哲 孙洁 《南方水产科学》 北大核心 2026年第2期186-197,共12页
鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)是严重危害鲤科鱼类的一种重要病原体,对中国鲤鱼养殖业及观赏鱼进出口贸易造成了重大经济损失。该病毒具有高度传染性和强致病性,已成为威胁鲤科鱼类健康的主要因素之一。为实现CEV的现场即时检测,本... 鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)是严重危害鲤科鱼类的一种重要病原体,对中国鲤鱼养殖业及观赏鱼进出口贸易造成了重大经济损失。该病毒具有高度传染性和强致病性,已成为威胁鲤科鱼类健康的主要因素之一。为实现CEV的现场即时检测,本研究开发了一种基于重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas13a系统的现场检测技术,采用恒温扩增方式,无需依赖专业仪器设备,可实现病毒特异性单分子水平的核酸检测。全部检测过程可在30~60 min内完成,最低检测限可达1.256拷贝·μL-1,灵敏度高、特异性强;结果可通过试纸条直观呈现,实现可视化判读。这项技术适用于口岸检疫、养殖场监测和野外调查等场景,能够实现快速、精准的现场检测,显著提升检测效率并缩短检测周期,为CEV的防控提供有力的技术支撑。 展开更多
关键词 鲤浮肿病毒 重组酶聚合酶扩增(RPA) CRISPR/Cas13a 现场检测 核酸检测
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甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-RPA-LFD检测方法的建立与应用 被引量:3
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作者 王永江 乔奇 +4 位作者 王爽 赵付枚 田雨婷 张德胜 张振臣 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第14期2781-2790,共10页
【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV... 【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(west African strain,WA)的RT-RPA-LFD检测方法。【方法】根据SPCSV-WA外壳蛋白基因和热激蛋白基因的保守序列设计并筛选扩增效果好、特异性强的引物和探针。然后对引物和探针的浓度、扩增体系、温度、反应时间等条件进行优化,建立SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法。利用该方法对SPCSV-EA、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)等常见的甘薯病毒进行检测,验证方法的特异性;将感染SPCSV-WA甘薯叶片样品总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR和RT-RPA-LFD进行检测,比较RT-PCR和RT-RPA-LFD方法的灵敏度;对采自田间的甘薯样品和试管苗样品进行RT-RPA、RT-RPA-LFD和RT-PCR检测,验证该方法的实用性。【结果】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,最适引物为CSV357F/R,探针CSV-CP-Probe(47 bp),引物和探针工作浓度分别为0.2和0.06μmol·L^(-1),温度为42℃,时间5 min。该方法可对SPCSV-WA进行特异性检测,与甘薯上其他常见病毒无交叉反应。RT-RPA-LFD最低可检测到总RNA稀释至10^(-4)溶液,而RT-PCR最低检测到总RNA稀释至10^(-3)溶液,RT-RPA-LFD灵敏度是RT-PCR的10倍。田间采集的22份甘薯样品经RT-PCR、RT-RPA和RT-RPA-LFD检测,均检出11份阳性样品,3种方法检测结果一致。28份试管苗样品的检测结果表明,RT-PCR和RT-RPA-LFD检测结果一致,均检出5份阳性样品。【结论】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,该方法具有快速、简便、特异、灵敏、可视的特点,既可用于甘薯脱毒试管苗样品的病毒检测,也适用于基层单位田间甘薯病毒样品的现场快速检测。 展开更多
关键词 甘薯褪绿矮化病毒西非株系 逆转录酶重组酶聚合酶扩增 侧向流层析 快速检测 甘薯
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基于重组酶聚合酶扩增技术的大丽轮枝菌快速检测方法的建立
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作者 暴晓阳 田茜 +5 位作者 孟青青 张瑞平 潘磊 赵文军 刘记 蔡璐璐 《植物保护》 北大核心 2026年第1期248-257,共10页
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌Verticillium dahliae引起的一种毁灭性土传真菌病害,也是我国农业植物检疫性病害。本研究建立了基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)的实时荧光型(real-time RPA)和侧流层析... 棉花黄萎病是由大丽轮枝菌Verticillium dahliae引起的一种毁灭性土传真菌病害,也是我国农业植物检疫性病害。本研究建立了基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)的实时荧光型(real-time RPA)和侧流层析试纸条型(RPA-LFD)2种快速检测方法。通过文献检索和基因序列对比设计了7对引物,特异性扩增结果表明,引物XY-VDS-01F/R和VD-RPA-F/R对棉花黄萎病菌的特异性强,XY-VDS-01F/R作为RPA引物的灵敏度更高。灵敏度检测结果表明:RPA-LFD检测灵敏度为8.5×10^(-5)ng/μL,real-time RPA检测灵敏度为8.5×10^(-3)ng/μL。对来自室内接种和田间采集的土样和棉花植株样品进行检测,real-time RPA和RPA-LFD均能检测出带菌样品。与常规PCR检测方法相比,本研究建立的2种基于重组酶聚合酶扩增检测法能快速、准确地检测棉花黄萎病菌,用时短、易于操作,灵敏性高、特异性强,对棉花黄萎病的早期发现和防治具有重要的指导意义。 展开更多
关键词 棉花黄萎病 大丽轮枝菌 实时荧光型RPA 侧流层析试纸条型RPA 快速检测
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菊花B病毒和番茄不孕病毒RT-RPA双重荧光实时检测体系的构建与性能评价 被引量:3
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作者 姜自红 刘文干 孙钦花 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期174-184,共11页
菊花B病毒(Chrysanthemum virus B, CVB)和番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)是危害菊花的2种主要优势病毒。为构建一种同步检测CVB和TAV逆转录重组酶聚合酶恒温核酸扩增(Reverse transcriptionrecombinase polymerase amplifica... 菊花B病毒(Chrysanthemum virus B, CVB)和番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)是危害菊花的2种主要优势病毒。为构建一种同步检测CVB和TAV逆转录重组酶聚合酶恒温核酸扩增(Reverse transcriptionrecombinase polymerase amplification, RT-RPA)双重荧光实时检测方法,本研究以CVB和TAV编码外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守区域作为靶标设计RIA引物和探针,CVB和TAV探针的5’端分别标记FAM和VIC荧光素,通过对商业化的RT-RPA试剂筛选,引物探针的组合筛选,扩增体系的优化和扩增条件的摸索试验,构建了一种可同时用于CVB和TAV检测的RT-RPA双重荧光实时检测方法。并对该体系进行优化,优化后RT-RPA双重荧光扩增体系中CVB和TAV的最优引物浓度为400 nmol/L,最优探针浓度分别为100 nmol/L和120 nmol/L;最适反应温度为39℃,最适反应时间为15 min。在此扩增体系和条件下,对CVB和TAV的检测敏感性均为1拷贝/μL;对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、菊花矮化类病毒和褪绿斑驳类病毒核酸检测结果为阴性,对菊花B病毒、番茄不孕病毒核酸检测结果为阳性;对1.0×10^(4)拷贝/μL和10拷贝/μL的高、低两种浓度的质粒平行检测10次,检测荧光出现阳性扩增拐点所需的时间T变异系数均小于5%,重复性好。采用RTRPA和RT-qPCR方法同步对实验室留存的有症状的100株菊花进行核酸提取并检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,总符合率100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB和TAV的快速、灵敏的RT-RPA双重荧光实时检测方法。 展开更多
关键词 菊花B病毒 番茄不孕病毒 逆转录重组酶聚合酶恒温扩增(RT-rpa) 双重荧光实时检测
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铁皮石斛RPA-CRISPR/Cas12b一步法快速鉴定
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作者 邹俊 蒲雨婷 +2 位作者 孟祥霄 段宝忠 师玉华 《世界科学技术-中医药现代化》 北大核心 2026年第3期673-684,共12页
目的 开发一种基于重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)与CRISPR/Cas12b技术的一步法快速检测方法,以实现铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura&Migo)基原及其药材的快速、可视化现场鉴定。方法 对铁皮石斛及其13个常见混伪品的ITS2序列进... 目的 开发一种基于重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)与CRISPR/Cas12b技术的一步法快速检测方法,以实现铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura&Migo)基原及其药材的快速、可视化现场鉴定。方法 对铁皮石斛及其13个常见混伪品的ITS2序列进行比对,设计铁皮石斛特异的RPA引物和单链向导RNA(sgRNA),构建RPA-CRISPR/Cas12b一步法检测体系。优化体系的关键反应组分浓度和反应温度,系统评价优化后方法的特异性与灵敏度,并采用PCR测序法和本研究建立的一步法对市售药材进行双重检测验证。结果本研究建立并优化了铁皮石斛RPA-CRISPR/Cas12b的一步法检测体系,优化后的关键组分参数如下:Cas12b与sgRNA浓度配比为1∶1,Cas12b蛋白浓度为100 nmol/L、ss-DNA荧光报告基因浓度为1.2µmol/L,RPA引物浓度为0.2µmol/L,最适反应温度为40℃。在优化条件下,反应35 min即可通过明显绿色荧光鉴定铁皮石斛物种。该方法特异性良好,仅铁皮石斛可产生显著荧光信号,灵敏度高达0.005 ng/µL。18份市售铁皮石斛药材的鉴定结果显示,一步法与PCR测序结果完全一致,均准确鉴定出15份正品与3份伪品,表明该方法准确性高。结论 本研究成功建立的RPA-CRISPR/Cas12b一步法检测方法具有准确、快速、操作简便及可视化判读等优势,适用于铁皮石斛基原及药材的现场快速筛查,为解决中药材现场鉴定困难问题提供了可靠的解决方案,也为其他中药材的快速筛查提供了技术参考。 展开更多
关键词 铁皮石斛 现场鉴定 重组酶聚合酶恒温扩增(RPA) CRISPR/Cas12b
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基于RPA/CRISPR-Cas12a技术的马铃薯种薯Ralstonia solanacearum快速检测方法
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作者 周健 刘文雯 +5 位作者 杨巧梅 吴彦瑢 司立平 罗展宏 唐唯 海洋 《植物病理学报》 北大核心 2026年第1期123-131,共9页
马铃薯(Solanum tuberosum L.)为粮菜兼用作物,是我国四大主粮之一。近年,由Ralstonia solanacearum引起的植株青枯及块茎腐烂,在我国西南马铃薯主产区普遍发生,严重影响马铃薯的产量及品质。病原菌的早期诊断是建立病害综合防控体系的... 马铃薯(Solanum tuberosum L.)为粮菜兼用作物,是我国四大主粮之一。近年,由Ralstonia solanacearum引起的植株青枯及块茎腐烂,在我国西南马铃薯主产区普遍发生,严重影响马铃薯的产量及品质。病原菌的早期诊断是建立病害综合防控体系的重要环节。因此,亟需建立一种快速、准确和灵敏度高的田间检测方法。本研究根据GenBank中fliC全长基因序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)引物和CRISPR-Cas12a crRNA,建立RPA与CRISPR-Cas12a相结合的等温扩增方法,并通过荧光和试纸条两种可视化方法进行结果判定。研究通过优化RPA/CRISPR-Cas12a的反应条件,发现在37℃恒温条件下,以R.solanacearum侵染后处于潜育期的种薯为研究对象,分别进行荧光检测及试纸条检测,两种方法均可特异性检测出R.solanacearum,而对其他马铃薯主要病原及土壤常见菌株均无有效扩增。此外,研究发现荧光法检测极限可达10 fg·μL^(-1),试纸条检测极限为100 fg·μL^(-1)。研究进一步利用试纸条法开展现场快速检测,发现该方法操作简便且无需昂贵的实验设备,适合田间即时诊断。通过对不同批次种薯的现场检测,RPA/CRISPR-Cas12a试纸条法能够准确检测出被R.solanacearum潜伏侵染的种薯。本研究所开发的RPA/CRISPR-Cas12a方法可用于种薯感染R.solanacearum的早期检测,有利于马铃薯病害的早期预防及病害诊断。 展开更多
关键词 马铃薯 青枯雷尔氏菌 种薯 快速检测 重组酶聚合酶扩增 CRISPR-Cas12a
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