目的建立可检测早期区域1A(early region 1A,E1A)蛋白和猿猴病毒40大T抗原(simian virus 40 large T anti-gen,SV40LTA)残留DNA的质粒参考品,并探索基于数字PCR法对质粒参考品拷贝数标定的分析技术,从而准确定量质粒参考品,为生物制品...目的建立可检测早期区域1A(early region 1A,E1A)蛋白和猿猴病毒40大T抗原(simian virus 40 large T anti-gen,SV40LTA)残留DNA的质粒参考品,并探索基于数字PCR法对质粒参考品拷贝数标定的分析技术,从而准确定量质粒参考品,为生物制品中宿主DNA残留检测提供新的思路。方法构建质粒pUC19-E1A-SV40LTA,全基因合成后进行扩增,以得到足够的质粒参考品;采用数字PCR仪,分别用E1A和SV40LTA引物探针体系的双荧光通道对其进行拷贝数检测;将数字PCR标定拷贝数的参考品应用于qPCR中,建立检测E1A和SV40LTA特定序列的方法。对建立的qPCR体系进行质粒参考品线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性验证,并应用建立的qPCR体系对重组腺病毒(recombinant adenovirus,rAdV)、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)样本进行检测。结果用数字PCR双荧光通道检测质料参考品的E1A和SV40LTA靶点的拷贝数基本一致,其中用E1A引物探针体系检测值为3.55×10^(9)copies/μL,SV40LTA引物探针体系检测值为3.48×10^(9)copies/μL,这两种检测值的变异系数(CV)为1.42%,取平均值3.51×10^(9)copies/μL作为数字PCR的标定值。用数字PCR标定拷贝数建立的qPCR体系线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性良好,检测rAdV、rAAV样本的回收率均在70%130%之间。结论建立了可检测生物制品中E1A和SV40LTA残留的质粒参考品,并引入了更为灵敏和准确的数字PCR方法对其进行定量。该参考品可应用于以HEK293、HEK293T为宿主细胞生产的基因治疗产品中E1A和SV40LTA残留DNA检测。展开更多
目的分析福建省产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)宋内志贺菌基因组特征,并对共存于质粒的bla_(CTX-M)耐药基因进行快速鉴定。方法收集福建省6个地区2007—2024年产ESBLs宋内志贺菌26株,微量肉汤法检测抗菌素最小抑菌浓度(MIC);利用二代和三代...目的分析福建省产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)宋内志贺菌基因组特征,并对共存于质粒的bla_(CTX-M)耐药基因进行快速鉴定。方法收集福建省6个地区2007—2024年产ESBLs宋内志贺菌26株,微量肉汤法检测抗菌素最小抑菌浓度(MIC);利用二代和三代测序技术进行全基因组测序(WGS),预测耐药基因、质粒、插入序列(IS)和bla_(CTX-M)基因环境,Roary构建聚类树,cgSNP(core genome single nucleotide polymorphism)分析菌株的全球进化地位。S1核酸内切酶脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)、微滴式数字PCR(ddPCR)及质粒接合转移试验确认bla_(CTX-M)在质粒上的定位和水平传播。结果26株产ESBLs宋内志贺菌均为多重耐药菌,全部对头孢噻肟耐药,有6株对阿奇霉素耐药。WGS分析显示,26株菌共携带17种耐药基因、9种质粒复制子、15种插入序列和1种转座子Tn7。bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-15)和bla_(CTX-M-64)、ermB和mphA的阳性率分别为61.54%、30.77%、7.69%、11.54%和11.54%,bla_(CTX-M)基因环境可分为4种类型。Roary分析可将26株菌分为4个簇;cgSNP显示,它们均归属于独特的基因型3.7.6中国分支。除1株bla_(CTX-M-14)位于染色体外,所有bla_(CTX-M)分布于3种类型的质粒上,S1-PFGE和ddPCR鉴定结果与测序结果一致。结论福建产ESBLs宋内志贺菌基因组携带大量耐药因子,S1-PFGE和ddPCR可成为检测质粒携带耐药基因的有效工具。展开更多
文摘目的建立可检测早期区域1A(early region 1A,E1A)蛋白和猿猴病毒40大T抗原(simian virus 40 large T anti-gen,SV40LTA)残留DNA的质粒参考品,并探索基于数字PCR法对质粒参考品拷贝数标定的分析技术,从而准确定量质粒参考品,为生物制品中宿主DNA残留检测提供新的思路。方法构建质粒pUC19-E1A-SV40LTA,全基因合成后进行扩增,以得到足够的质粒参考品;采用数字PCR仪,分别用E1A和SV40LTA引物探针体系的双荧光通道对其进行拷贝数检测;将数字PCR标定拷贝数的参考品应用于qPCR中,建立检测E1A和SV40LTA特定序列的方法。对建立的qPCR体系进行质粒参考品线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性验证,并应用建立的qPCR体系对重组腺病毒(recombinant adenovirus,rAdV)、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)样本进行检测。结果用数字PCR双荧光通道检测质料参考品的E1A和SV40LTA靶点的拷贝数基本一致,其中用E1A引物探针体系检测值为3.55×10^(9)copies/μL,SV40LTA引物探针体系检测值为3.48×10^(9)copies/μL,这两种检测值的变异系数(CV)为1.42%,取平均值3.51×10^(9)copies/μL作为数字PCR的标定值。用数字PCR标定拷贝数建立的qPCR体系线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性良好,检测rAdV、rAAV样本的回收率均在70%130%之间。结论建立了可检测生物制品中E1A和SV40LTA残留的质粒参考品,并引入了更为灵敏和准确的数字PCR方法对其进行定量。该参考品可应用于以HEK293、HEK293T为宿主细胞生产的基因治疗产品中E1A和SV40LTA残留DNA检测。
文摘目的分析福建省产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)宋内志贺菌基因组特征,并对共存于质粒的bla_(CTX-M)耐药基因进行快速鉴定。方法收集福建省6个地区2007—2024年产ESBLs宋内志贺菌26株,微量肉汤法检测抗菌素最小抑菌浓度(MIC);利用二代和三代测序技术进行全基因组测序(WGS),预测耐药基因、质粒、插入序列(IS)和bla_(CTX-M)基因环境,Roary构建聚类树,cgSNP(core genome single nucleotide polymorphism)分析菌株的全球进化地位。S1核酸内切酶脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)、微滴式数字PCR(ddPCR)及质粒接合转移试验确认bla_(CTX-M)在质粒上的定位和水平传播。结果26株产ESBLs宋内志贺菌均为多重耐药菌,全部对头孢噻肟耐药,有6株对阿奇霉素耐药。WGS分析显示,26株菌共携带17种耐药基因、9种质粒复制子、15种插入序列和1种转座子Tn7。bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-15)和bla_(CTX-M-64)、ermB和mphA的阳性率分别为61.54%、30.77%、7.69%、11.54%和11.54%,bla_(CTX-M)基因环境可分为4种类型。Roary分析可将26株菌分为4个簇;cgSNP显示,它们均归属于独特的基因型3.7.6中国分支。除1株bla_(CTX-M-14)位于染色体外,所有bla_(CTX-M)分布于3种类型的质粒上,S1-PFGE和ddPCR鉴定结果与测序结果一致。结论福建产ESBLs宋内志贺菌基因组携带大量耐药因子,S1-PFGE和ddPCR可成为检测质粒携带耐药基因的有效工具。
