新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白的可溶性原核表达与纯化

1

作者 董慧 王劭 +3 位作者 朱小丽 郑欣 陈少莺 陈仕龙 《福建农业学报》 北大核心 2025年第7期656-661,共6页

【目的】以新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)NP03株σB基因为研究对象,通过原核表达体系优化,获得可溶性表达的NDRVσB蛋白,为该病毒的检测及防治提供参考。【方法】将双酶切鉴定后的重组质粒pET-32a-σB转化大肠杆菌BL21(D... 【目的】以新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)NP03株σB基因为研究对象,通过原核表达体系优化,获得可溶性表达的NDRVσB蛋白,为该病毒的检测及防治提供参考。【方法】将双酶切鉴定后的重组质粒pET-32a-σB转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG诱导表达重组σB(rσB)蛋白。菌体超声破碎后,SDS-PAGE分析rσB蛋白的表达情况。进一步利用His标签蛋白纯化试剂盒对上清液中的rσB蛋白进行亲和层析纯化,并以纯化后的rσB蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法。【结果】在0.5 mmol·L^(−1) IPTG、16℃条件下诱导12 h时,超声破碎后的上清液中可检测到目的蛋白,rσB蛋白的可溶性表达水平显著提高。SDS-PAGE分析显示纯化的rσB蛋白纯度高于90%,分子量约为60 kDa。Western blot结果显示,纯化的rσB蛋白可与His标签单克隆抗体特异性反应;基于该蛋白建立的间接ELISA检测方法显示,NDRV阳性血清的OD_(450)值为1.75,显著高于番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)和番鸭小鹅瘟病毒(Muscovy duck-origin goose parvovirus,MDGPV)等对照病毒阳性血清(OD_(450)均小于0.3)。Western blot和ELISA结果表明,纯化后的rσB蛋白具有较好的特异性的反应原性。【结论】通过低温与低浓度IPTG诱导,成功建立了NDRV σB蛋白的可溶性原核表达体系,突破了该蛋白因包涵体形式表达导致的功能与应用研究瓶颈,为开发NDRV血清抗体ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 σb基因 原核表达 蛋白纯化

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新型鸭呼肠孤病毒I3-σB/σC蛋白疫苗的制备与免疫研究

2

作者 刘喆 罗烈柱 +3 位作者 周新瑞 黄允真 高诗敏 孙敏华 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第11期1445-1452,共8页

新型鸭呼肠孤病毒感染(NDR)是由NDRV引起的雏鸭高发病率和高病死率的传染病,主要导致患病鸭肝脾坏死。为开发安全高效的新型疫苗预防NDRV感染,通过构建NDRV-CD株σB/σC蛋白原核表达质粒p ET28a-NDRV-I3-σB/σC,重组蛋白经纯化后,联合... 新型鸭呼肠孤病毒感染(NDR)是由NDRV引起的雏鸭高发病率和高病死率的传染病,主要导致患病鸭肝脾坏死。为开发安全高效的新型疫苗预防NDRV感染,通过构建NDRV-CD株σB/σC蛋白原核表达质粒p ET28a-NDRV-I3-σB/σC,重组蛋白经纯化后,联合赛比克ISA 201 VG双相佐剂制备基于I3-01载体的亚单位疫苗,选取1日龄雏鸭分为I3-σB免疫组、I3-σC免疫组、全病毒灭活组及对照组进行免疫保护评价。结果显示,I3-σC免疫组一免后抗体效价极显著高于对照组,间隔13 d二免后抗体效价持续升高,并显著高于I3-σB免疫组及全病毒灭活组。二免后间隔14 d攻毒,并于攻毒后7 d测定各组肝脾病毒载量及第1~7天的排毒量,I3-σC免疫组肝脾病毒载量及肛拭子排毒量均显著低于I3-σB免疫组和全病毒灭活组;I3-σC免疫组肝脾无病变,保护效果最优。结果表明,I3-σC蛋白疫苗通过诱导高效中和抗体及抑制病毒复制,优于I3-σB蛋白疫苗和灭活疫苗的免疫效力。该试验为NDRV亚单位疫苗开发提供了理论依据,未来需优化免疫程序并探索多价疫苗策略以提升应用潜力。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒CD株 I3-01载体 I3-σb/σC蛋白疫苗 免疫攻毒

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新型鸭呼肠孤病毒σB和σC蛋白间接ELISA方法的建立 被引量：10

3

作者 王锦祥 程晓霞 +5 位作者 陈少莺 陈仕龙 林锋强 王劭 朱小丽 肖世峰 《福建农业学报》 CAS 北大核心 2016年第9期903-907,共5页

以纯化的新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)NP03株重组σB和σC蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测NDRV抗体的间接ELISA方法。优化后的最佳条件为:σB蛋白包被浓度为12.5μg·mL^(-1);σC蛋白包被浓度为6.25μg·mL^(-1);封闭... 以纯化的新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)NP03株重组σB和σC蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测NDRV抗体的间接ELISA方法。优化后的最佳条件为:σB蛋白包被浓度为12.5μg·mL^(-1);σC蛋白包被浓度为6.25μg·mL^(-1);封闭液为15%FBS;血清稀释度为1∶80;酶标二抗稀释度为1∶400;底物37℃显色5min。该方法对MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。该方法与NDRV全病毒间接ELISA相比较,符合率高达92.5%。本研究进一步丰富了NDRV抗体的检测方法。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 原核表达 σb蛋白 σC蛋白 间接ELISA

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番鸭呼肠孤病毒σB和σNS基因克隆及序列分析 被引量：5

4

作者 林锋强 胡奇林 +4 位作者 欧阳岁东 陈仕龙 程晓霞 王劭 朱小丽 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期672-675,共4页

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,DRV)σB和σNS基因序列设计合成引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB和σNS基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物分别为1154bp和1113 bp,与预期的目的片... 参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,DRV)σB和σNS基因序列设计合成引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB和σNS基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物分别为1154bp和1113 bp,与预期的目的片段大小一致。核苷酸序列经BLAST软件分析表明：番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB基因与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为88．1%；氨基酸同源性为94．0%：σNS基因与法国89026株和89330株同源性分别为93．8%和93．1%；氨基酸同源性为95．9%和95．1%。而σB和σNS基因与禽呼肠孤病毒的同源性约为60%～80%。表明番鸭呼肠孤病毒是不同于禽呼肠孤病毒的独立基因群。 展开更多

关键词 番鸭呼肠孤病毒 σb基因 σNS基因 序列分析

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新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定 被引量：5

5

作者 华炯钢 叶伟成 +4 位作者 倪征 陈柳 朱寅初 云涛 张存 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期428-434,共7页

B蛋白是新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的外衣壳蛋白之一,可诱导宿主机体产生群特异性抗体。为制备NDRVσB蛋白的单克隆抗体(MAb),并鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达后纯化的重组σB蛋白(rσB)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合... B蛋白是新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的外衣壳蛋白之一,可诱导宿主机体产生群特异性抗体。为制备NDRVσB蛋白的单克隆抗体(MAb),并鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达后纯化的重组σB蛋白(rσB)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,以纯化的rσB为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选出3株杂交瘤细胞,其分泌的MAb分别命名为10-A5、A1-A9和B7-E5。将NDRV ZJ00M株以MOI 0.01感染DF-1细胞72 h后收获细胞,通过western blot鉴定获得的MAb与天然表达的σB蛋白的反应性;分别将NDRV ZJ00M株、鸭经典呼肠孤病毒(CDRV)ZJ2000M株和鸡呼肠孤病毒(ARV)S1133株均以MOI 0.01感染DF-1细胞,48 h后经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定MAb的交叉反应性。Western blot结果显示,3株MAb均在41 ku出现特异性条带,表明其均能够与NDRVσB蛋白发生特异性反应;IFA结果显示:3株MAb均与NDRV反应,而不与CDRV和ARV发生交叉反应。上述结果表明,本研究制备的MAb反应原性和特异性均较强。利用人工合成的37条NDRVσB蛋白多肽及其截短的多肽,采用肽扫描法结合间接ELISA方法对3株MAb识别的抗原表位进行鉴定,并通过抗原表位氨基酸序列比对,分析该抗原表位在禽正呼肠孤病毒各成员中的保守性。结果显示,3株MAb识别的最小抗原表位均为33DIEEFHTPDVI43,且该抗原表位氨基酸序列在不同地域和不同宿主来源的NDRV分离株间的保守性均较高。本研究首次制备了NDRVσB蛋白的MAb,并鉴定了其抗原表位及该表位的保守性,为NDRV检测方法和表位标记疫苗的研究奠定基础。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 σb蛋白 单克隆抗体 抗原表位

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新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备 被引量：8

6

作者 梅敏敏 梁国智 +2 位作者 黄雯晶 李晓文 黄淑坚 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第12期3149-3155,共7页

为制备新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a(+)-σB,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白... 为制备新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a(+)-σB,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白。SDS-PAGE显示成功表达出约55ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度分别为3h和0.25mmol/L。经Ni 2+柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,将蛋白经Western blotting和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白,将纯化后σB重组蛋白按合理免疫程序免疫家兔,获得多抗隆抗体经Western blotting分析显示出特异性的反应。本试验结果为NDRVσB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 σb 蛋白 原核表达 多克隆抗体

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原核表达番鸭呼肠孤病毒σC与σB蛋白对雏番鸭的免疫保护 被引量：8

7

作者 吴晓平 吴异健 +2 位作者 韩典霖 吴宝成 黄一帆 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第14期3040-3045,共6页

【目的】探讨原核表达的番鸭呼肠孤病毒(DRV)外壳蛋白σC与σB对于雏番鸭的免疫保护作用,为研制有效的DRV亚单位疫苗提供理论基础。【方法】对pET-30a-S3/BL21重组菌与pET-30a-S4 ORF2/BL21重组菌进行稳定性检验,表达的重组蛋白进行纯... 【目的】探讨原核表达的番鸭呼肠孤病毒(DRV)外壳蛋白σC与σB对于雏番鸭的免疫保护作用,为研制有效的DRV亚单位疫苗提供理论基础。【方法】对pET-30a-S3/BL21重组菌与pET-30a-S4 ORF2/BL21重组菌进行稳定性检验,表达的重组蛋白进行纯化和复性后,进行油乳剂制备,50只1日龄雏番鸭随机平均分为5组,即DRVσB蛋白免疫组、DRVσC蛋白免疫组、DRVσB+σC蛋白免疫组及PBS对照组和攻毒对照组,免疫组皮下接种剂量为500μg/只,7日龄时进行二次免疫,14日龄时进行攻毒试验,ELISA和琼扩(AGP)检测抗体水平并计算保护指数。【结果】重组菌具有良好的稳定性,各免疫组的雏番鸭均在第2次免疫后7 d产生了一定效价的抗体,其中DRVσB+σC蛋白免疫组和DRVσC蛋白免疫组的雏番鸭血清抗体ELISA效价均为1﹕200,高于DRVσB蛋白免疫组的1﹕100。攻毒保护试验结果表明,联合免疫的保护指数最高,可达70,重组DRVσC保护指数次之,为60,重组DRVσB蛋白保护指数最低,仅为40。【结论】使用原核表达的DRV外壳蛋白σC与σB制备油乳剂,联合免疫可诱导雏番鸭快速产生一定效价的抗体,并提供良好的免疫保护力。 展开更多

关键词 番鸭呼肠孤病毒 σC与σb蛋白 免疫保护

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广东新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因克隆及序列分析 被引量：6

8

作者 黄雯晶 梁国智 +2 位作者 梅敏敏 李晓文 黄淑坚 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第2期327-335,共9页

为研究广东新型呼肠孤病毒(NDRV)的基因变异及遗传演化情况,本试验从广东不同鸭场病死鸭肝脏、脾脏等组织脏器中分离到8株流行毒株,用RT-PCR方法进行σB蛋白基因扩增、克隆与序列分析,并与其他毒株σB蛋白的氨基酸特性、蛋白抗原和蛋白... 为研究广东新型呼肠孤病毒(NDRV)的基因变异及遗传演化情况,本试验从广东不同鸭场病死鸭肝脏、脾脏等组织脏器中分离到8株流行毒株,用RT-PCR方法进行σB蛋白基因扩增、克隆与序列分析,并与其他毒株σB蛋白的氨基酸特性、蛋白抗原和蛋白基因进行系统进化比对分析。结果表明,广东省鸭群中感染的NDRV与国内其他地区报道的DRV核苷酸序列同源性很高,达96.6%~99.5%,而与禽呼肠孤病毒(ARV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的同源性则较低,分别为64.6%~66.5%和66.2%~67.1%;8株NDRV之间的核苷酸序列同源性高达97.7%~99.7%。与其他毒株比较结果显示,本试验分离的NDRV毒株磷酸化位点均比参考毒株ARV和MDRV少,且大多数区域的抗原指数都较高,抗原性与MDRV较为接近,遗传进化分析结果表明,NDRV和国内其他DRV处于独立的进化分支,ARV和MDRV则处于不同分支。结果表明,广东省流行的NDRV毒株σB蛋白基因序列高度保守,且广东地区分离的NDRV与国内其他地区分离的DRV没有明显的地域差异。 展开更多

关键词 新型呼肠孤病毒 σb蛋白 克隆 序列分析

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番鸭呼肠孤病毒YB株σB蛋白的基因序列分析及其原核表达 被引量：2

9

作者 吴晓平 张红星 +4 位作者 吴异健 韩典霖 王劭 吴宝成 黄一帆 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期185-191,共7页

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)是造成雏番鸭高死亡率的重要病原体,深入其检测与免疫研究对于防控DRV感染意义重大。利用RT-PCR和测序技术,对3株福建DRV分离株的S3基因进行序列分析,发现DRV-YH、YJL株与禽呼肠孤病毒(Avian ... 番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)是造成雏番鸭高死亡率的重要病原体,深入其检测与免疫研究对于防控DRV感染意义重大。利用RT-PCR和测序技术,对3株福建DRV分离株的S3基因进行序列分析,发现DRV-YH、YJL株与禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)遗传距离较近,同源性高达94.6%～98.9%,而DRV-YB株与ARV同源性仅为60.6%～61.7%。构建和鉴定DRV YB株重组原核表达质粒pET-30a-S3,并转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE表明,表达的目的蛋白分子量约为42ku,IPTG最适诱导浓度为0.1mM,最适诱导时间为5h,最适诱导温度为37℃,以包涵体形式存在。薄层扫描显示重组DRVσB蛋白占菌体总量的67.7%。以Ni 2+柱亲和层析纯化蛋白,纯化后的目的蛋白纯度为93%,质量浓度为0.86g/L。Western blot分析该融合蛋白能与抗DRV阳性血清发生特异性反应,表明重组DRVσB蛋白具有良好的免疫反应性。 展开更多

关键词 番鸭呼肠孤病毒 σb蛋白 序列分析 原核表达

原文传递

一株新型鸭呼肠孤病毒的致病性及其σB基因进化情况分析 被引量：3

10

作者 张博 陈立功 +7 位作者 郭康康 孟利佳 崔欢 武华 阴雅洁 张诚 王迎春 董世山 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第9期83-87,165,共6页

为了研究新型鸭呼肠孤病毒(novel Duck reovirus,NDRV)的致病性及其σB基因进化情况,试验采集河北地区病鸭的病变组织,经处理后接种SPF鸡胚进行病毒分离,鉴定该病毒的血凝特性,采用DNAStar等分子生物学软件对NDRVσB基因进行分析,以Reed... 为了研究新型鸭呼肠孤病毒(novel Duck reovirus,NDRV)的致病性及其σB基因进化情况,试验采集河北地区病鸭的病变组织,经处理后接种SPF鸡胚进行病毒分离,鉴定该病毒的血凝特性,采用DNAStar等分子生物学软件对NDRVσB基因进行分析,以Reed-Muench法计算分离病毒的鸡胚半数致死量(ELD50),并研究该病毒对雏鸭的致病性。结果表明:用处理的第3代尿囊液接种9日龄鸡胚,鸡胚在48小时时开始死亡,死亡高峰集中在60小时,鸡胚主要病变表现为全身出血、水肿和肝脏坏死。分离毒株不能凝集SPF鸡红细胞。PCR扩增得到大小约为1162 bp的目的条带,分离病毒与GenBank中16株参考病毒核苷酸序列同源性为66.2%~99.5%,其中与NDRV Duck/N-DRV-XT18/China/2018参考株的核苷酸序列同源性最高为99.5%。分离病毒对鸡胚的半数致死量为1×10^(-5.67) ELD_(50)/0.2 mL,可致健康雏鸭死亡,剖检可见脾脏组织中散在分布大量坏死灶,坏死灶区域淋巴细胞变性、坏死,组织丧失固有结构;肝脏组织中肝细胞脂肪变性,局灶性肝细胞坏死。说明从河北地区病鸭组织中分离的病毒为NDRV,将其命名为CH-HB株,该病毒具有传播迅速、地域性等特征。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 分离 鉴定 σb基因 致病性 分析

原文传递

番鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：1

11

作者 张云 陈晓丹 +3 位作者 李永锋 刘明 葛明 魏萍 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期786-789,共4页

以纯化复性的原核表达的番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σB蛋白为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,通过间接ELISA、Western-blot和免疫组织化学试验进行筛选及鉴定。结果显示,获得4株能够稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的杂交瘤... 以纯化复性的原核表达的番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σB蛋白为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,通过间接ELISA、Western-blot和免疫组织化学试验进行筛选及鉴定。结果显示,获得4株能够稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3F、B2B、C3E和D2G),其亚型分别属于IgG2bI、gG2bI、gM和IgM。采用小鼠体内诱生法制备的腹水均能与MDRV的σB蛋白发生特异性反应,表明,制备的单克隆抗体能够识别天然构象的σB蛋白。 展开更多

关键词 番鸭呼肠孤病毒 σb蛋白 单抗

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禽呼肠孤病毒99G株σB编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达 被引量：1

12

作者 张云 郝雪 +1 位作者 耿宏伟 郭东春 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期407-411,共5页

采用RTPCR方法扩增禽呼肠孤病毒（ARV）99G株σB编码基因，序列分析表明，99G株σB编码基因与其他禽呼肠孤病毒的同源性为90％～99％，而与我国番鸭呼肠孤病毒S12株的同源性仅有60％；用BamHⅠ和XhoⅠ酶将σB编码基因切下并克隆到表达载... 采用RTPCR方法扩增禽呼肠孤病毒（ARV）99G株σB编码基因，序列分析表明，99G株σB编码基因与其他禽呼肠孤病毒的同源性为90％～99％，而与我国番鸭呼肠孤病毒S12株的同源性仅有60％；用BamHⅠ和XhoⅠ酶将σB编码基因切下并克隆到表达载体pGEX-6p-1中，构建了重组表达质粒pGEX-σB；鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，σB基因在大肠杆菌中得到了高效表达，表达的融合蛋白占总蛋白的41．46％，融合蛋白的分子质量为66ku，主要以包涵体形式存在；Western-blot结果显示，该融合蛋白能与抗ARV阳性血清发生特异性反应，表明重组蛋白具有良好的反应原性，可用于禽呼肠孤病毒病诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制。 展开更多

关键词 禽呼肠孤病毒 σb基因 原核表达

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北京鸭呼肠孤病毒σA、σB蛋白的二级结构及B细胞抗原表位的预测 被引量：1

13

作者 刘红 樊惠英 +3 位作者 朱朝辉 罗琼 吴志新 廖明 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期90-94,共5页

应用SOPMA方法和DNAStar Protean软件综合分析了北京鸭呼肠孤病毒分离株DRV-GZ株的σA、σB蛋白的二级结构、亲水性、表面特性、柔韧性和抗原指数，并对各个蛋白的B细胞抗原表位进行了预测．结果表明，σA蛋白的32～37，56—61，82—85... 应用SOPMA方法和DNAStar Protean软件综合分析了北京鸭呼肠孤病毒分离株DRV-GZ株的σA、σB蛋白的二级结构、亲水性、表面特性、柔韧性和抗原指数，并对各个蛋白的B细胞抗原表位进行了预测．结果表明，σA蛋白的32～37，56—61，82—85，107～116，128～141，202～207，239—246，256～260，274—280，312～317，381—391和σB蛋白的62～86，117～125，141～163，179～186，270—275，287～289，343～345区域内或附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域． 展开更多

关键词 北京鸭呼肠孤病毒 σA蛋白 σb蛋白 b细胞表位

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新型鸭呼肠孤病毒QY株σB蛋白基因特征、二级结构预测及其细胞抗原表位分析 被引量：4

14

作者 吴阳开 范文胜 +4 位作者 张雪莲 李智丽 郭锦玥 李文锋 黄淑坚 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第10期2851-2859,共9页

本研究旨在对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)QY株σB蛋白的遗传变异规律和结构及功能进行分析。从GenBank数据库中获取QY株和25株参考株的σB蛋白编码序列,通过Mega 6.0软件进行序列比对分析和系统进化树构建;使用Datamonkey软件进行选择压力分... 本研究旨在对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)QY株σB蛋白的遗传变异规律和结构及功能进行分析。从GenBank数据库中获取QY株和25株参考株的σB蛋白编码序列,通过Mega 6.0软件进行序列比对分析和系统进化树构建;使用Datamonkey软件进行选择压力分析;运用生物信息学软件预测QY株σB蛋白二级结构功能及B细胞和T细胞抗原表位。相似性分析结果显示,NDRV QY株与国内其他地区分离的鸭呼肠孤病毒(DRV)氨基酸相似性达到94.9%~98.9%,与禽呼肠孤病毒(ARV)及番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的相似性仅为66.5%~68.4%和67.6%~68.4%;选择压力分析显示,σB蛋白承受净化选择压力,但存在一个正向选择位点;σB蛋白属于亲水蛋白,不具有信号肽和跨膜区,含有潜在的O-糖基化位点;结构预测分析显示,σB蛋白具有α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲等丰富的二级结构;表位分析显示,σB蛋白含有潜在的B细胞和T细胞抗原表位。本研究成功进行了QY株σB蛋白的基因特征和结构功能预测及其细胞表位分析,为深入了解该蛋白的免疫学特性及研发NDRV新型疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒(NDRV) σb蛋白 基因特征 二级结构 抗原表位

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新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1

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作者 王玮珠 王俊丽 +7 位作者 李丽杰 雷白时 孙茂源 张武超 赵卓 赵款 袁万哲 王林 《中国兽药杂志》 2024年第11期1-8,共8页

为建立一种高效、便捷的新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)抗体检测方法,以大肠杆菌表达系统表达的重组σB蛋白作为包被抗原,建立了NDRV抗体的间接ELISA检测方法。对该检测方法的反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性和重... 为建立一种高效、便捷的新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)抗体检测方法,以大肠杆菌表达系统表达的重组σB蛋白作为包被抗原,建立了NDRV抗体的间接ELISA检测方法。对该检测方法的反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。结果显示建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:0.5μg/mL抗原4℃包被过夜,待检血清1∶400稀释37℃孵育60 min,显色时间为15 min,Cut off值为0.432。该方法对新城疫病毒(NDV)、鸭圆环病毒(DuCV)、新型鹅细小病毒(NGPV)和鸭坦布苏病毒(DTMUV)阳性血清均不存在交叉反应,且检测阳性血清的敏感度为1∶6400,批间和批内重复试验的变异系数均小于8%,该检测方法与市售NDRV抗体ELISA检测试剂盒的总符合率为96.88%。本研究成功建立了间接ELISA检测方法,为NDRV抗体检测提供了有效便捷的方法。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 σb蛋白 原核表达 间接ELISA

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表达基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒σB和σC的重组4型禽腺病毒的拯救及鉴定

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作者 许壮壮 郭茹 +12 位作者 王素艳 高立 陈运通 张涛 高宁玉 吴龙波 祁小乐 张艳萍 崔红玉 刘永振 段雨路 王牟平 高玉龙 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1175-1181,共7页

为获得1株能够融合表达基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒(avian reovirusⅠ-sub,ARV GCⅠ-sub)σB和σC的重组4型禽腺病毒(fowl adenovirus 4,FAdV-4)株,以禽腺病毒rHN20为病毒载体,构建表达σB和σC蛋白的重组黏粒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub,使... 为获得1株能够融合表达基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒(avian reovirusⅠ-sub,ARV GCⅠ-sub)σB和σC的重组4型禽腺病毒(fowl adenovirus 4,FAdV-4)株,以禽腺病毒rHN20为病毒载体,构建表达σB和σC蛋白的重组黏粒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub,使用新型Fosmid黏粒拯救系统进行病毒拯救。通过PCR、间接免疫荧光试验(ⅠFA)、Western-blot以及体外复制动力学曲线鉴定重组毒株。结果显示,在感染的LMH细胞中成功检测到ARVGCⅠ-sub的σB和σC基因;Western-blot结果显示,在感染重组病毒的LMH细胞中成功检测到FAdV-4的Fiber蛋白、ARVGCⅠ-subσB和σC蛋白;ⅠFA结果显示,能特异性检测到FAdV-4的Fiber蛋白、ARVGCⅠ-subσB和σC蛋白;重组毒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub与亲本毒rHN20的复制能力无明显差异;表明重组病毒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub拯救成功。重组病毒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub的成功构建为同时靶向ARVσB和σC蛋白的ARV防控疫苗的研制提供了技术支撑,为ARV与FAdV-4的防控奠定了基础。 展开更多

关键词 基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒 4型禽腺病毒 σb σC 重组病毒

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禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白二级结构及其细胞抗原表位预测 被引量：16

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作者 黄莉 谢芝勋 +8 位作者 谢丽基 邓显文 谢志勤 范晴 罗思思 黄娇玲 曾婷婷 张艳芳 王盛 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第11期2880-2885,共6页

研究旨在运用DNAStar生物软件及Garnier-Robson、Chou-Fasman等方法分析禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)标准毒株S1133重要结构蛋白σB和σC的二级结构及其T细胞和B细胞抗原表位。通过分析其亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原指数等特... 研究旨在运用DNAStar生物软件及Garnier-Robson、Chou-Fasman等方法分析禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)标准毒株S1133重要结构蛋白σB和σC的二级结构及其T细胞和B细胞抗原表位。通过分析其亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原指数等特性,对σB和σC蛋白的B细胞抗原表位进行预测;以Rothbard-Taylor和AMPHI方法预测σB和σC蛋白的T细胞抗原表位。结果显示,σB和σC蛋白形成α-螺旋结构的能力较差,但与σB蛋白相比,σC蛋白含有较多的β-折叠结构、转角及无规则卷曲等二级结构,因而σC蛋白二级结构较复杂。分析结果还表明σB和σC蛋白均含有潜在B细胞和T细胞抗原表位,尤其是σC蛋白具有较多的B细胞和T细胞抗原表位。本试验为深入研究σB和σC蛋白的免疫学特性及研发ARV新型疫苗和药物靶标奠定基础。 展开更多

关键词 禽呼肠孤病毒 σb和σC结构蛋白 二级结构 抗原表位

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新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因密码子的优化及原核表达 被引量：11

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作者 李文锋 梅敏敏 +5 位作者 黄兴国 黄雯晶 李晓文 Saeed El-Ashram 黄淑坚 李智丽 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第10期2700-2706,共7页

试验旨在优化新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的原核表达系统,并评价sσB蛋白的免疫原性。根据已测得的NDRV-XX的σB蛋白基因序列,在不改变氨基酸序列的前提下,按照大肠杆菌密码子偏好性对σB蛋白全基因进行... 试验旨在优化新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)XX株σB蛋白的原核表达系统,并评价sσB蛋白的免疫原性。根据已测得的NDRV-XX的σB蛋白基因序列,在不改变氨基酸序列的前提下,按照大肠杆菌密码子偏好性对σB蛋白全基因进行优化、合成并连接至pET-32a(+)质粒中,构建原核表达重组质粒pET-32a(+)-sσB,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达并优化表达条件。SDS-PAGE结果显示,最佳诱导表达时间、温度及IPTG浓度分别为3h、32℃和0.25mmol/L;可溶性分析结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。表达菌经超声破碎、变性、复性和Ni 2+柱亲和层析后,得到纯度高于90%的sσB可溶性蛋白,sσB重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株上的表达量较σB蛋白提升了14.6%,前者占细菌总蛋白量的32.3%。Western blotting结果显示,sσB重组蛋白具备NDRV抗原免疫反应原性。本试验成功构建并优化了NDRV-XX株σB蛋白的原核表达系统,提高了σB蛋白的表达量,并获得具有良好NDRV抗原免疫反应原性的σB重组蛋白,为后续NDRVσB蛋白功能及其应用的深入研究、基因工程疫苗的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒(NDRV) σb蛋白 密码子优化 原核表达 纯化

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禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白在昆虫细胞中的共表达 被引量：3

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作者 王盛 谢芝勋 +9 位作者 沈文康 谢丽基 范晴 罗思思 张艳芳 曾婷婷 黄娇玲 张民秀 谢志勤 邓显文 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第5期1334-1341,共8页

本研究旨在获得具有天然构象和活性良好的禽呼肠孤病毒(ARV)σB和σC蛋白,采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达σB和σC蛋白,并对其活性进行鉴定。根据NCBI数据库中ARVσB和σC基因序列设计引物,将两个基因克隆至pFast-Dual载体,转... 本研究旨在获得具有天然构象和活性良好的禽呼肠孤病毒(ARV)σB和σC蛋白,采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达σB和σC蛋白,并对其活性进行鉴定。根据NCBI数据库中ARVσB和σC基因序列设计引物,将两个基因克隆至pFast-Dual载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭杆粒。通过转染sf9细胞,筛选到含有σB和σC基因的重组病毒。将重组病毒感染sf9细胞,通过优化接毒量和收获时间等参数,确定最佳表达条件,在sf9细胞中高效共表达σB和σC蛋白。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,成功在sf9细胞中共表达了ARVσB和σC蛋白,并具有很好的生物学活性。本试验结果为开发鉴别诊断试剂以及ARV颗粒疫苗的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 禽呼肠孤病毒(ARV) σb基因 σC基因 杆状病毒表达系统 SF9细胞

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禽呼肠孤病毒σB基因在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定 被引量：2

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作者 王盛 谢芝勋 +9 位作者 沈文康 谢丽基 范晴 罗思思 张艳芳 曾婷婷 黄娇玲 张民秀 谢志勤 邓显文 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期479-484,共6页

本研究旨在通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物学活性的禽呼肠孤病毒σB蛋白。首先,根据NCBI中ARVσB基因序列,设计引物构建σB基因重组供体质粒pFast-σB。随后转化DH10bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-σB。通过... 本研究旨在通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物学活性的禽呼肠孤病毒σB蛋白。首先,根据NCBI中ARVσB基因序列,设计引物构建σB基因重组供体质粒pFast-σB。随后转化DH10bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-σB。通过脂质体介导法转化sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-σB。将重组病毒感染sf9细胞,表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光(IFA)检测表明,ARVσB蛋白在sf9细胞中成功表达,分子量约为41 ku,并具有良好的生物学活性,为进一步研究ARVσB基因的功能及其基因工程亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 禽呼肠孤病毒 σb基因 杆状病毒表达系统 SF9细胞

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