目的构建大肠杆菌双杂交系统的诱饵重组质粒。方法PCR扩增大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-ac-tivated prote in k inaseα2,AMPKα2)蛋白编码区cDNA,与大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建融合蛋白表达质粒pBT-AMPKα2。经酶切和测序鉴定后,将...目的构建大肠杆菌双杂交系统的诱饵重组质粒。方法PCR扩增大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-ac-tivated prote in k inaseα2,AMPKα2)蛋白编码区cDNA,与大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建融合蛋白表达质粒pBT-AMPKα2。经酶切和测序鉴定后,将pBT-AMPKα2转化XL-1 B lue MRF’大肠杆菌报告菌株,检测诱饵融合蛋白的表达。并用pBT-AMPKα2和pTRG空载体共转化XL-1 B lue MRF’菌株,通过3-氨基-1,2,4-三唑(3-am ino-1,2,4-triazole,3-AT)选择性筛选平板检测诱饵融合蛋白的自激活作用。结果酶切和测序结果表明AMPKα2蛋白编码序列成功克隆入pBT载体,融合区阅读框正确。诱饵重组质粒pBT-AMPKα2能表达λcI/AMPKα2融合蛋白。转化有pBT-AMPKα2和pTRG空载体的XL-1 B lue MRF’大肠杆菌报告菌株在3-AT选择性筛选平板上不生长,而在no 3-AT非选择性筛选平板上生长良好,表明pBT-AMPKα2重组质粒能在大肠杆菌细胞中正确表达且无自激活作用。结论构建的pBT-AMPKα2诱饵重组质粒可用于下一阶段的cDNA文库筛选。展开更多
构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;...构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。展开更多
文摘目的构建大肠杆菌双杂交系统的诱饵重组质粒。方法PCR扩增大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-ac-tivated prote in k inaseα2,AMPKα2)蛋白编码区cDNA,与大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建融合蛋白表达质粒pBT-AMPKα2。经酶切和测序鉴定后,将pBT-AMPKα2转化XL-1 B lue MRF’大肠杆菌报告菌株,检测诱饵融合蛋白的表达。并用pBT-AMPKα2和pTRG空载体共转化XL-1 B lue MRF’菌株,通过3-氨基-1,2,4-三唑(3-am ino-1,2,4-triazole,3-AT)选择性筛选平板检测诱饵融合蛋白的自激活作用。结果酶切和测序结果表明AMPKα2蛋白编码序列成功克隆入pBT载体,融合区阅读框正确。诱饵重组质粒pBT-AMPKα2能表达λcI/AMPKα2融合蛋白。转化有pBT-AMPKα2和pTRG空载体的XL-1 B lue MRF’大肠杆菌报告菌株在3-AT选择性筛选平板上不生长,而在no 3-AT非选择性筛选平板上生长良好,表明pBT-AMPKα2重组质粒能在大肠杆菌细胞中正确表达且无自激活作用。结论构建的pBT-AMPKα2诱饵重组质粒可用于下一阶段的cDNA文库筛选。
文摘构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。
