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降低T细胞DAPK1表达以促进BCG疫苗诱导的抗结核菌感染反应的机制
1
作者 刘子炫 刘敏 潘勤 《解剖学研究》 2025年第2期105-114,共10页
目的探讨死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)促进CD4^(+)T细胞死亡的机制;并在小鼠结核病疫苗BCG免疫过程中下调CD4^(+)T细胞DAPK1水平,评估以上干预提升疫苗效能以对抗结核菌(M.tb)感染的效果。方法体外实验:利用慢病毒载体系统对CD4^(+)T细胞系... 目的探讨死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)促进CD4^(+)T细胞死亡的机制;并在小鼠结核病疫苗BCG免疫过程中下调CD4^(+)T细胞DAPK1水平,评估以上干预提升疫苗效能以对抗结核菌(M.tb)感染的效果。方法体外实验:利用慢病毒载体系统对CD4^(+)T细胞系MOLT‑4进行DAPK1过表达、敲低或敲低后回补,同时使用CD3、CD28抗体活化细胞后行流式细胞术检测细胞死亡,免疫印迹验证凋亡蛋白Caspase‑3的表达水平;利用腺相关病毒载体(AAV)‑shDapk1系统敲低小鼠脾脏CD4^(+)T细胞DAPK1,RT‑qPCR以及WB检测敲低效果。动物实验:利用AAV‑shDapk1敲低小鼠脾脏CD4^(+)T细胞DAPK1,BCG免疫小鼠后,FCM检测小鼠体内记忆性CD4^(+)T细胞水平和细胞因子水平;进行M.tb H37Ra感染实验,通过病理切片和肺组织菌落计数,验证下调DAPK1对BCG疫苗效能的提升作用。结果DAPK1敲低后MOLT‑4细胞死亡率由(2.36±0.38)%降至(0.94±0.11)%(P<0.01),并且Caspase‑3蛋白水平也因DAPK1的敲低而减少;同样地,过表达DAPK1后细胞死亡率由(2.00±0.10)%增加至(5.54±0.23)%(P<0.01);在敲低DAPK1细胞中回补DAPK1后死亡率由(0.90±0.35)%增加至(3.04±0.14)%(P<0.01)。AAV‑shDapk1体外转染小鼠脾淋巴细胞后WB以及RT‑qPCR结果显示DAPK1表达水平降低。动物实验,AAV‑shDapk1处理组小鼠体内CD4^(+)中央记忆性T细胞(T_(CM))死亡率由(23.74±2.22)%降至(18.46±2.89)%(P<0.01),AAV‑shDapk1处理小鼠相比空载对照组CD4^(+)T细胞中T_(CM)百分率由(8.93±0.52)%升至(10.94±0.71)%(P<0.01);AAV‑shDapk1处理小鼠TNF‑α、IFN‑α、IL‑2的上升水平较为明显,相比于AAV空载对照组,shDapk1处理组CD4^(+)T细胞中TNF‑α百分率由(0.21±0.04)%升至(1.99±0.20)%(P<0.01);IFN‑α百分率由(0.33±0.06)%升至(0.77±0.15)%(P<0.01);IL‑2百分率由(0.71±0.10)%升至(2.48±0.08)%(P<0.01);M.tb H37Ra攻毒后,菌落计数显示AAV‑shDapk1处理小鼠体内感染细菌数量显著减少,病理组织切片显示该组肺脏坏死程度较轻,脾脏中淋巴样白髓和红髓更加明显,AAV‑shDapk1处理小鼠的肺脏和肝脏病理组织评分相比空载对照组也有所改善。结论DAPK1可在T细胞中提高凋亡蛋白Caspase‑3表达水平并抑制T细胞存活,将小鼠体内CD4^(+)T细胞的DAPK1敲低有利于CD4^(+)T细胞存活以及CD4^(+)T_(CM)的增多,这有助于提升BCG疫苗效能以帮助宿主对抗M.tb感染。 展开更多
关键词 死亡相关蛋白激酶1 CD4^(+)T细胞 腺相关病毒载体 中央记忆性T细胞
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基于RCMFFDE和SSA-RVM的旋转机械损伤检测模型 被引量：2
2
作者 王显彬 孙阳 《机电工程》 北大核心 2025年第3期510-519,共10页
针对旋转机械系统的振动信号具有明显的非线性,严重影响故障特征提取从而导致其识别精度不佳的问题,建立了一种基于精细复合多尺度分数波动散布熵(RCMFFDE)、t-分布随机邻域嵌入(t-SNE)和麻雀搜索算法优化相关向量机(SSA-RVM)的旋转机... 针对旋转机械系统的振动信号具有明显的非线性,严重影响故障特征提取从而导致其识别精度不佳的问题,建立了一种基于精细复合多尺度分数波动散布熵(RCMFFDE)、t-分布随机邻域嵌入(t-SNE)和麻雀搜索算法优化相关向量机(SSA-RVM)的旋转机械损伤检测模型。首先,进行了基于RCMFFDE方法的特征提取,生成了特征样本,以定量反映旋转机械的不同损伤情况;然后,采用t-SNE方法,将原始高维故障特征映射至低维空间,获得了对故障更敏感的低维特征;最后,将敏感的低维故障特征向量输入至SSA-RVM多分类器中,进行了训练和测试,实现了旋转机械样本的故障识别目的;采用两种旋转机械数据集进行了实验,并从准确率、效率和抗噪性方面,将RCMFFDE-SSA-SVM方法与多种特征提取方法进行了对比。研究结果表明:RCMFFDE能用于有效提取旋转机械的故障特征,分别取得99.2%和100%的识别精度;而对敏感特征进行分类所获得的精度优于对原始特征进行分类的情形,前者比后者提高了4%;在模式识别中,SSA-RVM优于其他分类器;自制数据集的诊断精度达到了97%,特征提取的时间为16.05 s。 展开更多
关键词 非线性振动信号 特征提取时间 故障识别精度(诊断精度) 精细复合多尺度分数波动散布熵 t-分布随机邻域嵌入 麻雀搜索算法优化相关向量机
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球矢量波函数在地下旋电磁各向异性介质球电磁散射中的应用
3
作者 贾永冰 耿友林 《物理学报》 北大核心 2025年第12期107-115,共9页
给出了一种T矩阵法、球矢量波函数加法定理和镜像法结合研究地下旋电磁各向异性介质球电磁散射的解析方法.针对传统方法主要集中于单点电场求解而缺乏电场分布全面分析的局限性,计算了沿目标中心轴平行的Y轴直线L的地面上的散射场,并与F... 给出了一种T矩阵法、球矢量波函数加法定理和镜像法结合研究地下旋电磁各向异性介质球电磁散射的解析方法.针对传统方法主要集中于单点电场求解而缺乏电场分布全面分析的局限性,计算了沿目标中心轴平行的Y轴直线L的地面上的散射场,并与FEKO仿真结果进行对比验证.结果表明,所提出的球矢量波函数方法与FEKO仿真结果高度吻合,验证了该方法的正确性.在此基础上,比较了两种方法在计算地下旋电磁各向异性介质球目标的计算效率.最后,给出了入射波频率和埋藏深度的变化对地面电场分布的影响,验证了该方法在多场景下的适用性.本文是现有的电磁散射理论的扩展,可应用于地下目标探测等领域. 展开更多
关键词 地下旋电磁各向异性介质球体 电磁散射 球矢量波函数 T矩阵法
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T克隆载体的构建
4
作者 胡学军 李江 +2 位作者 袁晓东 李晶泉 安利佳 《大连大学学报》 1998年第6期81-83,共3页
以高拷贝克隆载体pUC118为骨架载体,在pUC118质粒Amp^r基因的Eam11057酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam11051酶切位点,将一人工合成的具有两个Eam11051酶切位点的互补寡聚核苷酸链(两端具有BamHI接头)插入已封闭Eam1105I酶切位点的pUC... 以高拷贝克隆载体pUC118为骨架载体,在pUC118质粒Amp^r基因的Eam11057酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam11051酶切位点,将一人工合成的具有两个Eam11051酶切位点的互补寡聚核苷酸链(两端具有BamHI接头)插入已封闭Eam1105I酶切位点的pUC118质粒的BamHI位点,构成新的克隆载体,此质粒命名为pUC118E,该载体经Eam11051酶切后,可产生3’端突出一个T碱基的T-vector,能与PCR产物直接连接,经转化大肠杆菌JM109证实,该改造过的pUC118质粒,仍可使宿主细胞具有氨苄抗性,可作为氨苄选择标记的克隆载体。 展开更多
关键词 t-vector pUC118 PCR产物 Eam11051
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T克隆载体的构建
5
作者 胡学军 徐红梅 +2 位作者 赵东利 李晶泉 袁晓东 《北京农学院学报》 2001年第4期6-8,共3页
本文描述了一种构建与PCR产物直接连接的克隆载体的方法。以高拷贝克隆载体 pUC118为骨架载体,在 pUC118质粒Ampr 基因的Eam110 5I酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam110 5I酶切位点。经转化大肠杆菌JM 10 9证实,该改造过的pUC118质粒,... 本文描述了一种构建与PCR产物直接连接的克隆载体的方法。以高拷贝克隆载体 pUC118为骨架载体,在 pUC118质粒Ampr 基因的Eam110 5I酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam110 5I酶切位点。经转化大肠杆菌JM 10 9证实,该改造过的pUC118质粒,可使宿主细胞具有氨苄抗性,仍可作为氨苄选择标记的克隆载体。将一人工合成的具有两个Eam110 5I酶切位点的互补寡聚核苷酸链(两端具有BamHI接头)插入已封闭Eam110 5I酶切位点的pUC118 载体的BamHI位点,构成新的克隆载体,此质粒命名为pUC118E。该载体经Eam110 5I酶切后,可产生 3 端突出一个T碱基的T -vector,能与PCR产物直接连接。 展开更多
关键词 t-vector pUC118 PCR产物 限制酶Eam1105I
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非病毒CAR-T开发工艺的研究进展
6
作者 李海鹏 朱启宇 +1 位作者 朱家良 闵静婷 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第5期461-467,共7页
嵌合抗原受体T(CAR-T)淋巴细胞是过继性免疫疗法中的研究热点,这项技术将肿瘤免疫治疗的应用前景推至巅峰。CAR-T对淋巴细胞起源的血液肿瘤已经取得了极佳的疗效,并为实体瘤治疗提供了可能性。CAR-T制备工艺目前以病毒载体转染T细胞为主... 嵌合抗原受体T(CAR-T)淋巴细胞是过继性免疫疗法中的研究热点,这项技术将肿瘤免疫治疗的应用前景推至巅峰。CAR-T对淋巴细胞起源的血液肿瘤已经取得了极佳的疗效,并为实体瘤治疗提供了可能性。CAR-T制备工艺目前以病毒载体转染T细胞为主,但产生病毒载体的过程长、成本高,同时病毒载体载荷量低且伴随插入不稳定性。因此目前急需努力寻找更便捷、更精确的非病毒基因传递方法。本文综述了目前最有前途的非病毒基因传递技术的现状,成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑、转座子系统,如睡美人(SB)和PiggyBac(PB)和mRNA,并对非病毒载体CAR-T的未来发展做出展望。 展开更多
关键词 非病毒载体 嵌合抗原受体T(CAR-T) 转座子 CRISPR/Cas9 综述
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基于t-SNE和ECOC-ISSA-SVM的变压器故障诊断
7
作者 刘蒙 赵晨晓 +4 位作者 朱乔波 李梁 姚旭 李鑫 赵明 《辽宁工程技术大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第5期606-613,共8页
为解决电力变压器故障诊断中支持向量机(support vector machine,SVM)超参数优化和多分类性能不足的问题,采用t-分布的随机邻居嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding,t-SNE)对26维溶解气体分析(DGA)数据进行非线性降维,引... 为解决电力变压器故障诊断中支持向量机(support vector machine,SVM)超参数优化和多分类性能不足的问题,采用t-分布的随机邻居嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding,t-SNE)对26维溶解气体分析(DGA)数据进行非线性降维,引入纠错输出码(error correction output codes,ECOC),将改进麻雀搜索算法(improved sparrow search algorithm,ISSA)与切比雪夫混沌映射、柯西-高斯变分策略相结合,优化SVM超参数,处理多分类问题。研究结果表明:ECOC-ISSA-SVM(t-SNE)模型的诊断精度、召回率、特异性和F1值分别为95.6%、97.8%、99.6%和97.8%,各项指标较传统模型提升效果显著,诊断时间缩短至11 ms,诊断效率显著提高。研究结论为电力设备智能运维提供技术支持。 展开更多
关键词 故障诊断 变压器 油中溶解气体 支持向量机 麻雀搜索算法 t-SNE降维 纠错输出码
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利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌缺失突变株 被引量：15
8
作者 白耀霞 杨毅 +7 位作者 王玉飞 王同坤 于爽 陈燕芬 付思美 黄留玉 田晋红 陈泽良 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期62-67,共6页
目的:建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率。方法:采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将... 目的:建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率。方法:采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得布鲁氏菌的缺失突变株。结果:结合融合PCR和T载体快速克隆,能够在48h之内构建好突变载体,与传统的酶切连接相比,效率高、周期短。结论:基于T载体快速克隆是一种非常高效的构建突变株的方法,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一种新方法。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 T载体 突变株构建
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使用与Gateway技术兼容的T载体获得入门克隆 被引量：10
9
作者 陈其军 安瑞 +2 位作者 周海梦 陈珈 王学臣 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第10期951-954,共4页
与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究 ,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题 ,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆 .为此 ,将传统的TA克隆技术与... 与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究 ,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题 ,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆 .为此 ,将传统的TA克隆技术与Gateway重组克隆技术进行整合 ,构建了与Gateway技术兼容的两种TA克隆载体 ,用于在克隆PCR产物或其他来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆 .利用兼容Gateway技术的TA克隆载体有效地解决了上述瓶颈问题 . 展开更多
关键词 Gateway克隆技术 TA克隆技术 入门载体 T载体 入门克隆
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人神经生长因子的基因克隆和序列分析 被引量：7
10
作者 马巍 吴玲 +4 位作者 刘淼 任惠民 扬广笑 王全颖 王德利 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期338-341,共4页
目的　克隆人神经生长因子基因编码区。方法　由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ,利用PCR法 ,从DNA中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA片段 ;将获得的基因片段插入 pGEM T Easy质粒中 ,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制... 目的　克隆人神经生长因子基因编码区。方法　由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ,利用PCR法 ,从DNA中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA片段 ;将获得的基因片段插入 pGEM T Easy质粒中 ,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果　经质粒DNA酶切分析及序列测定 ,获得了人神经生长因子DNA片段序列。结论　首次由人白细胞DNA中克隆获得了人神经生长因子基因 ,为神经生长因子的基因治疗提供了前提条件。 展开更多
关键词 人神经生长因子 基因克隆 序列分析 聚合酶链反应
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T载体研究进展 被引量：10
11
作者 林陈水 武胜伟 杨丹燕 《浙江工业大学学报》 CAS 北大核心 2009年第6期623-628,共6页
T载体是直接克隆或表达PCR产物的新型载体,重组过程无需酶切和纯化,简便高效.在总结国内外研究的基础上,概述了构建T载体的方法,其中内切酶法是T载体制备方法中最先进的方式.阐述了T载体在抗体库构建、目的基因克隆、某些蛋白的融合表... T载体是直接克隆或表达PCR产物的新型载体,重组过程无需酶切和纯化,简便高效.在总结国内外研究的基础上,概述了构建T载体的方法,其中内切酶法是T载体制备方法中最先进的方式.阐述了T载体在抗体库构建、目的基因克隆、某些蛋白的融合表达方面的应用以及目前T载体的商业化.对表达型T载体与克隆型T载体进行了比较,其中表达型T载体可以同时满足基因克隆和表达的需要,还具有其他独特的优势.介绍了表达型T载体的构建难点,探讨了今后T载体的研究发展方向. 展开更多
关键词 T载体 克隆 表达
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一种lacZ报告基因T载体的构建及其在沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC表达活性测定中的应用 被引量：4
12
作者 刘蕾 李永霞 +2 位作者 刘金泽 王明晓 余旭平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期711-716,共6页
为研究5'-非翻译区(UTR)对沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC表达的影响,本研究以鼠伤寒沙门氏菌542(STM542)基因组DNA为模板,扩增含不同长度5'-UTR的flhDC全长基因(共5种),并将其克隆至含阿拉伯糖启动子的质粒PBAD33中。通过测定含... 为研究5'-非翻译区(UTR)对沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC表达的影响,本研究以鼠伤寒沙门氏菌542(STM542)基因组DNA为模板,扩增含不同长度5'-UTR的flhDC全长基因(共5种),并将其克隆至含阿拉伯糖启动子的质粒PBAD33中。通过测定含阿拉伯糖的半固体平板上包含不同长度flhDC基因的重组大肠杆菌菌落的直径,初步评估不同5'-UTR调控序列对flhDC基因表达的影响。为精确测定不同调控序列的活性差异,本实验室进一步构建了以lacZ为报告基因的T载体,并将扩增的对应于前4种flhDC基因调控序列片段克隆于构建的T载体,通过测定其β-半乳糖苷酶活性获得相应调控序列的活性参数。结果显示,在阿拉伯糖诱导下,对应于1572bp的flhDC基因片段的调控序列活性最低,对应于1201bp的flhDC基因片段的调控序列活性最高,本实验为进一步研究flhDC基因的调控功能奠定基础。 展开更多
关键词 flhDC基因 鞭毛 lacZ报告基因 T载体
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奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌16s rRNA3’-23s rRNA 5’间序列的克隆及测序 被引量：5
13
作者 石磊 沈宜 +2 位作者 顾大勇 王华 周元国 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2006年第6期783-786,835,共5页
目的:对奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌16s rRNA 3’~23s rRNA 5’间序列(16S^23S rRNA intergenic spacer region,ISR)进行克隆测序,为分子探针技术鉴定两菌奠定基础。方法:针对临床常见致病菌16s rRNA 3’~23s rRNA 5’间序列两端的16S... 目的:对奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌16s rRNA 3’~23s rRNA 5’间序列(16S^23S rRNA intergenic spacer region,ISR)进行克隆测序,为分子探针技术鉴定两菌奠定基础。方法:针对临床常见致病菌16s rRNA 3’~23s rRNA 5’间序列两端的16S及23S rRNA保守序列设计PCR扩增的通用引物,对两菌进行扩增,利用PMD-18TVector质粒对两菌的PCR产物进行T载体克隆构建,测序后申报Genbank。结果:两菌的通用引物扩增产物构建的T载体克隆,测序结果经Blast分析,确定为两菌的ISR序列,申报Genbank获得接收。结论:成功的对奇异变形杆菌、洛菲氏不动杆菌ISR序列进行了克隆测序,该序列可以用于两种菌的通用引物PCR扩增技术鉴定。 展开更多
关键词 奇异变形杆菌 洛菲氏不动杆菌 16s^23s rRNA间区 T载体
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特异基因的PCR扩增及其快速克隆 被引量：4
14
作者 张大军 钱明 +3 位作者 李东 梁驹卿 皇甫永穆 陈秋生 《同济医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1994年第3期167-170,共4页
采用聚合酶链反应(PCR)技术，直接从微生物基因组中扩增卡介苗Ag85-B和HBsAg编码基因。虽然在引物5'端设计了限制性内切酶识别顺序以及附加顺序，但因限制性内切酶不能切开这些顺序，使扩增基因产物不能克隆到质粒载体中。因此，我... 采用聚合酶链反应(PCR)技术，直接从微生物基因组中扩增卡介苗Ag85-B和HBsAg编码基因。虽然在引物5'端设计了限制性内切酶识别顺序以及附加顺序，但因限制性内切酶不能切开这些顺序，使扩增基因产物不能克隆到质粒载体中。因此，我们构建了新的克隆载体即T载体，专门用于克隆未经任何修饰的PCR产物；这种方法价廉，快速有效，值得推广应用。 展开更多
关键词 聚合酶链反应 克隆 T载体 基因
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人BDNF成熟肽基因克隆及序列分析(英文) 被引量：3
15
作者 马东亮 任惠民 +4 位作者 胡海涛 刘勇 陈新林 刘朝辉 李卫敏 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期75-78,共4页
为研究人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗 Alzheimer病中的作用 ,本文作者等克隆了其成熟肽基因并进行了序列分析。提取健康成人末梢血白细胞基因组 DNA作为模板 ,应用 PCR技术扩增人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段 ... 为研究人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗 Alzheimer病中的作用 ,本文作者等克隆了其成熟肽基因并进行了序列分析。提取健康成人末梢血白细胞基因组 DNA作为模板 ,应用 PCR技术扩增人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段 ,并将其插入 p GEM-T质粒。限制性内切酶鉴定重组质粒并进行序列测定和分析。与 Gen Bank提供的已知序列(M61181)比较 ,所克隆的人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段长 3 5 7bp,序列完全相同。人脑源性神经营养因子成熟肽基因的克隆 ,为其在原核细胞中的表达。 展开更多
关键词 脑源性神经营养因子 聚合酶链反应 T-载体 基因克隆 人
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一种构建新型T载体的简便方法及应用 被引量：4
16
作者 齐向辉 陈辉 +5 位作者 沈琦 何晨曦 刘学 郭齐 陈华友 徐虹 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期163-165,174,共4页
T载体能够用于PCR产物的快速克隆且易于操作。以常用的克隆载体pGEM-3zf(+)为出发材料,将其进行改造为通用的T载体。通过一步反向PCR方法在该载体中插入带有Xcm I酶切位点的一段序列,在Xcm I酶的切割下产生两端含有T核苷酸的线型核苷酸... T载体能够用于PCR产物的快速克隆且易于操作。以常用的克隆载体pGEM-3zf(+)为出发材料,将其进行改造为通用的T载体。通过一步反向PCR方法在该载体中插入带有Xcm I酶切位点的一段序列,在Xcm I酶的切割下产生两端含有T核苷酸的线型核苷酸序列,最终获得用于克隆PCR产物的T载体。外源基因xdh克隆试验表明该载体构建成功,此载体完全可以用于PCR产物的基因克隆试验,为相关载体的改造提供了思路。 展开更多
关键词 T载体 一步反向PCR Xcm I
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转基因水稻T-DNA侧翼序列的扩增与分析 被引量：20
17
作者 方进 翟文学 +2 位作者 王文明 李素文 朱立煌 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第4期345-351,共7页
利用现有的转抗白叶枯病基因Ｘａ２１的水稻材料，通过ＴＡＩＬ－ＰＣＲ技术扩增出携带Ｘａ２１基因的Ｔ－ＤＮＡ的侧翼序列。对２４个有效扩增片段的序列分析结果表明，其中１４个侧翼序列是水稻ＤＮＡ，９个含载体主干序列，１个是外... 利用现有的转抗白叶枯病基因Ｘａ２１的水稻材料，通过ＴＡＩＬ－ＰＣＲ技术扩增出携带Ｘａ２１基因的Ｔ－ＤＮＡ的侧翼序列。对２４个有效扩增片段的序列分析结果表明，其中１４个侧翼序列是水稻ＤＮＡ，９个含载体主干序列，１个是外源基因Ｘａ２１片段。１４个Ｔ－ＤＮＡ侧翼的水稻ＤＮＡ序列与直接转化法外源基因整合位点的基因组序列具有不同的特点。这些Ｔ－ＤＮＡ在水稻染色体上整合后其两端序列的特点类似于在转基因双子叶植物中观察到的现象。在含主干序列的侧翼序列（３７．５％，９ ／ ２４）中，载体主干序列是以不同的类型出现的。 展开更多
关键词 转基因水稻 T-DNA 整合 载体主干序列 扩增
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一种PCR产物克隆的新方法——T-A克隆法 被引量：23
18
作者 李新波 赵小松 +2 位作者 田德志 朱依纯 姚泰 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1999年第2期187-189,共3页
介绍一种ＰＣＲ产物克隆的新方法———ＴＡ克隆法．用改良碱裂解法抽提ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒，用ＥｃｏＲⅤ将ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒切成平端，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶及ｄＴＴＰ制备ｐＢｌｕｅｓｃ... 介绍一种ＰＣＲ产物克隆的新方法———ＴＡ克隆法．用改良碱裂解法抽提ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒，用ＥｃｏＲⅤ将ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒切成平端，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶及ｄＴＴＰ制备ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ＴＡ载体．将βａｃｔｉｎｃＤＮＡ片段克隆入自制的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ＴＡ载体，经ＥｃｏＲⅠ及ＨｉｎｄⅢ双酶切得到与设定长度一致的βａｃｔｉｎｃＤＮＡ片段． 展开更多
关键词 T-A克隆载体 PCR产物 T-A克隆法
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伪狂犬病毒粤A毒株TK基因的扩增、克隆与序列测定 被引量：3
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作者 吴德铭 罗满林 +2 位作者 黄毓茂 刘镇明 邬苏晓 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期71-73,共3页
以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株 (PRVYA)的基因组为模板 ,利用聚合酶链反应 (PCR)扩增TK基因 ,获得预定大小的片段 ,将这一片段克隆到PMD18-T载体中 .对重组质粒PMD18-TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和... 以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株 (PRVYA)的基因组为模板 ,利用聚合酶链反应 (PCR)扩增TK基因 ,获得预定大小的片段 ,将这一片段克隆到PMD18-T载体中 .对重组质粒PMD18-TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较 ,证实了克隆片段的可靠性 . 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 粤A毒株 TK基因 扩增 克隆 序列测定 聚合酶链反应 PMD18-T载体
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人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆 被引量：3
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作者 吕勇刚 窦科峰 +5 位作者 吴昱彤 赵爱志 刘杰 陈刚 陶开山 药立波 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期558-561,共4页
目的　扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因 ,将其克隆到T载体来构建T载体文库。方法　收集乳腺癌患者外周转移淋巴结 30例 ,TRIzol法提取总RNA、纯化mRNA ,行RT PCR扩增 ,制备T载体 ,用于PCR产物的克隆。结果　总RNA纯度高 ,完整性好 ,mRN... 目的　扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因 ,将其克隆到T载体来构建T载体文库。方法　收集乳腺癌患者外周转移淋巴结 30例 ,TRIzol法提取总RNA、纯化mRNA ,行RT PCR扩增 ,制备T载体 ,用于PCR产物的克隆。结果　总RNA纯度高 ,完整性好 ,mRNA获得率为 1%。经RT PCR ,VH、Vλ、Vκ的每一条 5 '端引物均与其相应的 3'端引物成功地扩增出了可变区基因片段 ,轻、重链T载体库分别为 1.7× 10 8和 3.5× 10 8。结论　所采用的引物能够10 0 %扩增目的片段 ,T载体过渡能显著提高克隆效率 ,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。 展开更多
关键词 聚合酶链式反应 乳腺癌 抗体基因 T载体
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