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EuCAD基因CRISPR/Cas9敲除载体构建及基因编辑效果验证
1
作者 陈博雯 肖玉菲 +4 位作者 李军集 钟连香 魏秋兰 覃子海 刘海龙 《分子植物育种》 北大核心 2025年第7期2226-2231,共6页
为了对尾叶桉(Eucalyptus urophylla)木质素合成关键基因开展基因编辑研究,本研究构建了Eu-CAD基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。对EuCAD基因序列进行分析,设计两条位于外显子的靶位点序列,使... 为了对尾叶桉(Eucalyptus urophylla)木质素合成关键基因开展基因编辑研究,本研究构建了Eu-CAD基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。对EuCAD基因序列进行分析,设计两条位于外显子的靶位点序列,使用Golden Gate技术构建得到基因编辑载体pRGEB35-CAD。以尾叶桉继代苗茎尖为材料建立原生质体转化体系,用pGFP质粒进行转化,依据GFP荧光激发结果统计体系的转化率为2.47%。将pRGEB35-CAD转化至原生质体,PCR鉴定显示在原生质体中EuCAD发生了预期的基因编辑,pRGEB35-CAD取得了预期基因编辑效果。本研究构建的EuCAD基因CRISPR/Cas9敲除载体可对目标基因进行基因编辑,为进一步创制EuCAD敲除突变体奠定了研究基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9敲除载体 原生质体转化 CAD基因 尾叶桉
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甜菜BvNLP2-like基因敲除载体构建与拟南芥中模拟敲除
2
作者 王希 陶艳昵 +3 位作者 张西宁 张琦 李志烨 赵春雷 《中国糖料》 2025年第2期20-26,共7页
【目的】为研究此前自甜菜中发现的BvNLP2-like基因的功能,需要观察其过表达与基因敲除对性状的影响。本研究旨在构建该基因的敲除载体,同时构建拟南芥中同源基因敲除载体并进行模拟敲除。【方法】以甜菜BvNLP2-like基因为研究对象,利用... 【目的】为研究此前自甜菜中发现的BvNLP2-like基因的功能,需要观察其过表达与基因敲除对性状的影响。本研究旨在构建该基因的敲除载体,同时构建拟南芥中同源基因敲除载体并进行模拟敲除。【方法】以甜菜BvNLP2-like基因为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑基础载体,设计构建BvNLP2-like基因的敲除载体;同时寻找拟南芥中与之同源的基因,构建该拟南芥基因的敲除载体,最后利用农杆菌介导法将拟南芥基因敲除载体转化拟南芥以验证敲除效果。【结果】设计并构建了BvNLP2-like基因的敲除载体pHK2-Cas9-U6-BV,拟南芥中同源基因的敲除载体pHK2-Cas9-U6-AT,通过模拟敲除得到了基因组中目的基因发生缺失突变的植株,表明使用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以成功实现该NLP基因的敲除。【结论】本研究得到了2种可用于NLP基因基因敲除的载体,为此基因在甜菜中的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 甜菜 NLP基因 CRISPR/Cas9 载体构建 基因敲除
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一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法 被引量：9
3
作者 陈恒玲 许杰 +1 位作者 黄玉连 林显光 《中南民族大学学报（自然科学版）》 CAS 2018年第3期68-71,共4页
利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6... 利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体. 展开更多
关键词 CRISPR/cas9系统 基因敲除 载体构建 Spata49
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人白细胞介素-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒的构建及其在HEK293T细胞中的活性验证
4
作者 周海金 吴珊 +5 位作者 刘丽媛 蒋丹 许涛 蓝华滔 舒纬童 徐广贤 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第2期151-159,共9页
目的 构建人白细胞介素(interleukin,IL)-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒,为研究IL-26基因在细胞信号通路及细胞自噬中的功能奠定基础。方法 利用RT-PCR从人外周血单个核细胞中扩增IL-26基因序列,克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP真核表... 目的 构建人白细胞介素(interleukin,IL)-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒,为研究IL-26基因在细胞信号通路及细胞自噬中的功能奠定基础。方法 利用RT-PCR从人外周血单个核细胞中扩增IL-26基因序列,克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP真核表达载体中,构建过表达质粒;并根据IL-26外显子序列设计4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2,利用CRISPR/Cas9技术构建至lentiCRISPRv2载体中,构建基因敲除质粒。将过表达质粒和基因敲除质粒分别瞬时转染至HEK293T细胞,利用RT-qPCR和Western blot验证IL-26 mRNA和蛋白的表达情况。并对IL-26进行氨基酸序列分析、结构预测及亚细胞定位观察。结果 通过酶切、测序鉴定及生物信息学分析显示,IL-26全长516 bp,编码171个氨基酸。IL-26过表达质粒转染的HEK293T细胞与正常对照组相比,IL-26 mRNA水平升高了656.789倍,蛋白质水平升高了1.978倍,差异均有统计学意义(t分别为17.976和7.859,P分别<0.000 1和<0.001)。4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2质粒转染至HEK293T细胞中后,IL-26的表达水平分别下降了0.930、0.980、0.523 3和0.316 9倍,其中Exon3-sgRNA2质粒能够显著下调IL-26的表达(t=7.440,P <0.001)。IL-26蛋白的前22个氨基酸存在信号肽结构,且具有一定的跨膜功能,IL-26存在于细胞质中。结论 成功构建了IL-26过表达和基因敲除质粒,为后续IL-26功能的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 白细胞介素-26 过表达质粒 基因敲除质粒 生物信息学
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鲁西黄牛成纤维细胞MSTN基因敲除研究 被引量：6
5
作者 冯霞 李树峰 +4 位作者 佟慧丽 徐婷婷 卢丽 严云勤 李光鹏 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期53-59,共7页
肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又称GDF-8,属于转化生长因子超家族,是在骨骼肌中广泛表达的一类糖蛋白。试验根据已知牛MSTN基因的序列设计引物,通过PCR技术克隆获得同源长短臂,利用pPNT质粒为骨架构建含有loxP-Neo-loxP结构的打靶载体... 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又称GDF-8,属于转化生长因子超家族,是在骨骼肌中广泛表达的一类糖蛋白。试验根据已知牛MSTN基因的序列设计引物,通过PCR技术克隆获得同源长短臂,利用pPNT质粒为骨架构建含有loxP-Neo-loxP结构的打靶载体,然后利用脂质体转染鲁西黄牛成纤维细胞,G418和GANC双向筛选,收集打靶细胞,PCR法进行鉴定,初步确定筛选到的细胞为MSTN基因敲除细胞,为后续试验获得MSTN基因敲除牛奠定了基础。 展开更多
关键词 鲁西黄牛 肌肉生长抑制素 打靶载体 基因敲除
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用Red/ET重组酶构建基因打靶载体 被引量：11
6
作者 杨建岭 顾淑萍 +4 位作者 陈臣 王铸钢 许燕 费俭 YANG Jian-Ling1, GU Shu-Pir 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期919-924,共6页
基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源。采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点。因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节。为研究Resp1... 基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源。采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点。因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节。为研究Resp18未知功能分泌肽基因,应用一种新的DNA工程平台——Red/ET同源重组技术来构建其打靶载体,并比较了这一方法在构建不同长度同源臂中的效率。研究表明,Red/ET重组方法构建打靶载体具有很高的效率,可以获得较长的同源臂,并且不会引入突变,有助于获得更高的打靶效率。因此Red/ET重组为构建打靶载体提供了一种新的可靠的方法。 展开更多
关键词 Red/ET重组 基因打靶 载体
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弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体构建方法探讨 被引量：2
7
作者 韦相才 钟兴明 +1 位作者 郑焕钦 陈观今 《热带医学杂志》 CAS 2004年第3期243-246,共4页
目的探讨构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的方法,为建立基因敲除弓形虫基因突变株打下基础。方法用PCR方法扩增弓形虫SAG3基因同源序列,将所获得的1.53kb和2.81kb序列连接克隆插入TUB5/CAT质粒中,构建置换型打靶载体,采用PCR扩增、酶... 目的探讨构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的方法,为建立基因敲除弓形虫基因突变株打下基础。方法用PCR方法扩增弓形虫SAG3基因同源序列,将所获得的1.53kb和2.81kb序列连接克隆插入TUB5/CAT质粒中,构建置换型打靶载体,采用PCR扩增、酶切分析鉴定。结果将SAG3基因中1.53kb和2.81kb两个同源序列分别插入TUB5/CAT质粒中,构建了弓形虫RH株5'SAG3-TUB5/CAT-3'SAG3置换型载体,经鉴定所获得的打靶载体结构准确。结论建立了弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体,并获得了弓形虫RH株SAG3基因置换型打靶载体,为分析弓形虫基因功能提供了可行的方法。 展开更多
关键词 弓形虫 膜抗原 SAG3 基因打靶 载体
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CRISPR/Cas9介导CPED1基因敲除载体活性的验证 被引量：2
8
作者 王飞 何娜娜 +3 位作者 王颖洁 纪艳芹 张亚妮 李碧春 《中国家禽》 北大核心 2017年第7期11-14,共4页
试验旨在利用CRISPR/Cas9技术分别在鸡成纤维细胞DF-1和鸡胚胎干细胞(Em-bryomic stem cell,ESCs)上介导CPED1基因敲除,以期为后续研究CPED1基因功能提供技术依据。克隆CPED1基因全长;构建cas9/g RNA载体并转染DF-1和ESCs,经流式分选阳... 试验旨在利用CRISPR/Cas9技术分别在鸡成纤维细胞DF-1和鸡胚胎干细胞(Em-bryomic stem cell,ESCs)上介导CPED1基因敲除,以期为后续研究CPED1基因功能提供技术依据。克隆CPED1基因全长;构建cas9/g RNA载体并转染DF-1和ESCs,经流式分选阳性细胞,采用T7E1酶切法选择活性最佳的敲除载体并分析其敲除效率;同时,对DF-1中的脱靶效率进行检测。结果成功克隆鸡CPED1基因,并构建3个cas9/g RNA载体;T7E1酶切结果表明cas9/g RNA1载体在DF-1阳性细胞中的敲除活性(37%)最佳,该载体也可定点敲除ESCs中的CPED1基因,敲除活性为25%,且在DF-1细胞中未发生脱靶。表明CRISPR/Cas9可有效介导鸡CPED1基因在DF-1和ESCs上敲除。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 CPED1基因 鸡 敲除载体
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利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因打靶载体 被引量：1
9
作者 张传山 李峰 +3 位作者 姚刚 郭毅 鲍柳君 陈学进 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期68-76,共9页
利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。实验首先在已经筛选... 利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47kb无启动子的HPRT基因组片段(不含有第1个外显子)克隆到pBACLinkSp质粒上,产生pBACLinkSp-rHPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHPRT质粒,设计不同的同源臂,从而删除了HPRT基因的不同编码区,成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打靶载体,为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HPRT基因敲除动物疾病模型奠定了基础。 展开更多
关键词 RED重组 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因 基因敲除 载体
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苏云金芽孢杆菌外孢囊蛋白基因敲除载体的构建 被引量：2
10
作者 李今煜 潘智雄 黄天培 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2012年第2期159-162,共4页
以苏云金芽孢杆菌(Bt)库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010的外孢囊蛋白基因上下游序列,以含有卡那基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含外孢囊蛋白基因上游序列、卡那基因、外孢囊... 以苏云金芽孢杆菌(Bt)库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010的外孢囊蛋白基因上下游序列,以含有卡那基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含外孢囊蛋白基因上游序列、卡那基因、外孢囊蛋白基因下游序列的基因敲除载体pRN5101UKD,为后续外孢囊蛋白基因敲除工作做准备. 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 外孢囊蛋白基因 基因敲除载体
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梭菌氢酶基因部分片段的同源克隆及敲除载体的构建 被引量：1
11
作者 闫倩 闫苗章 +1 位作者 王保莉 曲东 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期61-66,共6页
为从分子水平探索典型铁还原菌-梭菌的铁还原能力与其氢酶产氢之间的关系,以从水稻土中分离得到一株具有高铁还原能力和高产氢能力的梭菌为材料,通过同源克隆获得长度为761bp氢酶基因的部分序列。生物信息分析发现,该基因片段覆盖氢酶... 为从分子水平探索典型铁还原菌-梭菌的铁还原能力与其氢酶产氢之间的关系,以从水稻土中分离得到一株具有高铁还原能力和高产氢能力的梭菌为材料,通过同源克隆获得长度为761bp氢酶基因的部分序列。生物信息分析发现,该基因片段覆盖氢酶的活性中心,是氢酶的主要功能结构域。采用Overlap PCR的方法构建含有四环素抗性基因的氢酶基因敲除载体(pMD-19-HTH),以期进一步构建氢酶基因缺失的梭菌突变体,为分析氢酶产氢与铁还原的关系奠定基础。 展开更多
关键词 氢酶 同源克隆 重叠PCR 敲除载体
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苏云金芽孢杆菌NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的克隆和敲除载体的构建 被引量：2
12
作者 李今煜 肖水华 黄天培 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2012年第5期508-512,共5页
以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建... 以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含待敲除NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游片段、卡那霉素抗性基因的重组质粒pRN5101DKU,为后续Bt8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的敲除做准备. 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 NAD(P)H:醌氧化还原酶基因 基因敲除载体
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耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因的敲除对其生物被膜产量的影响 被引量：1
13
作者 金琨琪 施晓晨 +5 位作者 张巧丽 安雅男 王超 程威 杨志强 于录 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期378-382,共5页
探索出一套分枝杆菌基因敲除的可靠方案,并研究耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因对其生物被膜产量的影响,结核分枝杆菌相关基因的敲除对其致病机理的深入研究有重要意义。利用融合PCR方法将MSMEG_6935基因的上、下游基因以及替代目的基因的ka... 探索出一套分枝杆菌基因敲除的可靠方案,并研究耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因对其生物被膜产量的影响,结核分枝杆菌相关基因的敲除对其致病机理的深入研究有重要意义。利用融合PCR方法将MSMEG_6935基因的上、下游基因以及替代目的基因的kan基因融合,并将产物克隆到温敏型穿梭质粒pPR27,再电转入耻垢分枝杆菌mc2155中,筛选获得MSMEG_6935基因缺失株mc2155-6935。进一步研究MSMEG_6935基因的敲除对细菌生长曲线和生物被膜产量的研究。成功构建了MSMEG_6935基因的缺失株,并研究证明耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因的缺失对耻垢分枝杆菌的生长曲线没有影响,但会对其生物被膜的产量产生较大影响。 展开更多
关键词 MSMEG6935 基因敲除 穿梭载体 生物被膜
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小鼠性激素结合球蛋白条件基因打靶载体的构建 被引量：1
14
作者 王越 金镇 +1 位作者 孙磊 郑晋华 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期203-208,213,共7页
目的构建小鼠性激素结合球蛋白(Shbg)条件基因打靶载体。方法运用ET克隆的方法构建Shbg基因第4-7号外显子两侧插入loxp位点的条件性剔除载体。首先以BAC DNA为模板克隆出Shbg及其上、下游基因并打靶质粒载体(p BR322-MKAB),利用该质粒和... 目的构建小鼠性激素结合球蛋白(Shbg)条件基因打靶载体。方法运用ET克隆的方法构建Shbg基因第4-7号外显子两侧插入loxp位点的条件性剔除载体。首先以BAC DNA为模板克隆出Shbg及其上、下游基因并打靶质粒载体(p BR322-MKAB),利用该质粒和BAC克隆,通过同源重组方式,获得套取质粒(p BR322-Shbg-Re);再分别以PL452及PL451为模板扩增出含Neo片段,经过再一轮的Red/ET重组成功实现条件性基因敲除打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)的构建。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的p BR322-MK-AB、p BR322-Shbg-Re、SHBG-Ln重组质粒和Shbg条件基因打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Shbg条件基因打靶载体,为后续Shbg基因条件敲除小鼠模型的构建奠定了基础。 展开更多
关键词 性激素结合球蛋白 条件性基因敲除 载体 Red/ET重组
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奶山羊BLG基因敲除载体的构建 被引量：2
15
作者 陈华涛 李倩 +4 位作者 胡林勇 王爱华 靳亚平 刘军 杨艳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期858-863,共6页
根据已知的BLG序列设计引物,通过PCR技术克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外显子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外显子3、4、5、6、7,分别连入克隆载体pMD18-T Simple载体中并测序。然后以含有正负筛选标记基因的ploxpⅡ载体... 根据已知的BLG序列设计引物,通过PCR技术克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外显子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外显子3、4、5、6、7,分别连入克隆载体pMD18-T Simple载体中并测序。然后以含有正负筛选标记基因的ploxpⅡ载体为基础,将5′端和3′端同源臂片段先后连入其中,进行酶切、PCR鉴定。将构建好的基因敲除载体转化组成型表达Cre重组酶的大肠杆菌BM25.8,验证Loxp位点的活性。结果表明,构建了奶山羊BLG基因第2外显子缺失的基因敲除载体pBLG2T,且pBLG2T载体中的正选neo基因可以被Cre重组酶去除。为获得BLG 1条等位基因缺失型细胞株以及培育高产优质奶山羊新品种奠定基础。 展开更多
关键词 奶山羊 BLG基因 基因敲除 打靶载体
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小鼠T279基因敲除胚胎干细胞的构建 被引量：1
16
作者 杨超 王朝亮 +2 位作者 张天标 殷正伟 王瑞 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2018年第4期448-452,共5页
目的:利用打靶载体技术构建小鼠T279基因敲除胚胎干细胞模型。方法:订购含小鼠T279基因的129BAC质粒和PL452,PCR扩增Retrieving同源臂及loxp-neo-loxp片段,利用PL253质粒进行目的片段的连接,并在EL350大肠杆菌中进行同源重组,构建T279... 目的:利用打靶载体技术构建小鼠T279基因敲除胚胎干细胞模型。方法:订购含小鼠T279基因的129BAC质粒和PL452,PCR扩增Retrieving同源臂及loxp-neo-loxp片段,利用PL253质粒进行目的片段的连接,并在EL350大肠杆菌中进行同源重组,构建T279打靶载体,将其电转染小鼠胚胎干细胞,利用Southern blot方法鉴定同源重组的阳性克隆。结果:经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序鉴定,T279打靶载体构建成功。Southern blot结果显示成功筛选到同源重组的敲除T279基因的胚胎干细胞克隆。结论:T279基因敲除打靶载体构建成功并筛选到了同源重组阳性的胚胎干细胞克隆。 展开更多
关键词 T279 基因敲除 打靶载体 同源重组 小鼠
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小鼠bcl10基因敲除载体的构建 被引量：1
17
作者 王宏 奚涛 +2 位作者 沈子龙 吴国祥 成国祥 《药物生物技术》 CAS CSCD 2004年第4期211-215,共5页
根据已知的cDNA序列设计引物 ,通过RT PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针 ,用噬斑原位杂交法克隆 12 9品系小鼠的bcl10基因组DNA ,在亚克隆完成序列结构分析的基础上 ,利用常规分子克隆技术 ,构建完成了针对bcl10基因的替代型基因... 根据已知的cDNA序列设计引物 ,通过RT PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针 ,用噬斑原位杂交法克隆 12 9品系小鼠的bcl10基因组DNA ,在亚克隆完成序列结构分析的基础上 ,利用常规分子克隆技术 ,构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体。两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游 2 .4kb和exon4下游 4 .5kb的基因片段。构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体 ,为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础。 展开更多
关键词 小鼠 bcl10基因 基因敲除 打靶载体 亚克隆
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副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用 被引量：16
18
作者 刘霞 高鹤 +6 位作者 杨琳 张义全 谭亚芳 郭兆彪 黄新祥 杨瑞馥 周冬生 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2011年第3期188-192,276,共6页
目的摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义。方法通过融合PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合... 目的摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义。方法通过融合PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合转移到副溶血性弧菌菌株内,经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株。结果成功构建了副溶血性弧菌RIMD2210633菌株ΔopaR,ΔtoxR和ΔaphA三个基因突变株。结论通过自杀载体同源重组成功获得精确敲除的无痕突变株更有利于基因功能的研究,使后续副溶血性弧菌突变株与野生株的对比研究成为可能。 展开更多
关键词 自杀载体 同源重组 无痕突变
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CRISPR/Cas9技术敲除人前列腺癌PC-3细胞BLM解旋酶基因的研究 被引量：4
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作者 陈琨 许厚强 +2 位作者 赵佳福 段志强 吴萍 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2018年第9期1547-1553,共7页
BLM解旋酶是人类RecQ解旋酶家族的重要一员,在DNA的复制、修复、重组、转录、端粒的维持等细胞代谢过程中具有重要的作用。BLM基因与前列腺癌易感性相关,可作为治疗前列腺癌的候选基因。该研究设计了5个Cas9/SgRNA载体,并通过T7E1酶筛... BLM解旋酶是人类RecQ解旋酶家族的重要一员,在DNA的复制、修复、重组、转录、端粒的维持等细胞代谢过程中具有重要的作用。BLM基因与前列腺癌易感性相关,可作为治疗前列腺癌的候选基因。该研究设计了5个Cas9/SgRNA载体,并通过T7E1酶筛选出活性最强的SgRNA3载体,利用脂质体LTX将其与供体载体共同导入前列腺癌PC-3细胞。BLa和Puro抗性筛选及荧光蛋白标记甄别获得带阳性标记的细胞。Western blot及RTq-PCR检测证明,前列腺癌PC-3细胞中的BLM解旋酶基因被成功敲除,为深入研究BLM解旋酶基因在前列腺癌中的作用提供了重要的科学数据。 展开更多
关键词 BLM解旋酶基因 CRISPR/Cas9表达载体 基因敲除 前列腺癌PC-3细胞
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双元载体提供组蛋白H3/H4拷贝1的elp3Δ菌株的构建 被引量：1
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作者 李芬 田树娟 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期95-98,共4页
人Elongator是在转录中有功能的组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合物,为研究其催化亚基Elp3功能,构建了酵母组蛋白H3/H4拷贝1的双元表达载体pRS316CFT,通过PCR介导的基因敲除,获酵母基因组H3/H4缺失由双元载体提供单拷贝H3/H4的elp3Δ菌株.敏... 人Elongator是在转录中有功能的组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合物,为研究其催化亚基Elp3功能,构建了酵母组蛋白H3/H4拷贝1的双元表达载体pRS316CFT,通过PCR介导的基因敲除,获酵母基因组H3/H4缺失由双元载体提供单拷贝H3/H4的elp3Δ菌株.敏感性实验表明该载体提供H3/H4可维持酵母正常生长.本工作为构建H3/H4乙酰化位点突变菌株,用功能互补在体内研究人Elp3 HAT活性功能奠定了基础. 展开更多
关键词 双元表达载体 基因敲除 酵母突变株
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