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非洲猪瘟病毒pB602L蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立
1
作者 张向阳 矫健 +8 位作者 黄培 焦翠翠 张梦瑶 黄静波 龚志远 李海伦 李媛媛 张海丽 王化磊 《病毒学报》 北大核心 2026年第1期126-134,共9页
目的为了建立非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)pB602L蛋白抗体间接ELISA检测方法。方法本研究利用大肠杆菌表达系统表达了His-pB602L重组蛋白,并以纯化的His-pB602L重组蛋白为包被抗原,以表达pB602L的重组狂犬病病毒免疫... 目的为了建立非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)pB602L蛋白抗体间接ELISA检测方法。方法本研究利用大肠杆菌表达系统表达了His-pB602L重组蛋白,并以纯化的His-pB602L重组蛋白为包被抗原,以表达pB602L的重组狂犬病病毒免疫后的小鼠阳性血清和ASFV猪阳性血清为一抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)作为广谱二抗,采用棋盘滴定法优化各反应条件,建立针对pB602L蛋白的间接ELISA抗体检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行评价。结果ASFV pB602L蛋白间接ELISA抗体检测方法的最优反应条件为:抗原包被浓度为4μg/mL,4℃包被16 h~18 h,5%脱脂奶粉37℃封闭0.5 h,待检血清孵育0.5 h,SPA-HRP 1:10000倍稀释后37℃孵育0.5 h。该方法仅对ASFV阳性血清检测结果为阳性,与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪乙型脑炎病毒和猪圆环病毒2型阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测稀释度为1∶6400的猪ASFV临床阳性血清时仍呈现阳性,检测分别稀释3200倍和1600倍的ASFVⅠ型和Ⅱ型阳性血清均为阳性;批内重复和批间重复变异系数均小于10%。结论本研究建立的ASFV pB602L蛋白间接ELISA抗体检测方法不仅可用于ASF的临床诊断和流行病学调查,亦能够为ASF疫苗研发过程中免疫动物的特异性抗体评价提供技术支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 pB602L蛋白 pB602L抗体 间接ELISA
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鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ抗体间接ELISA检测方法的建立与应用
2
作者 曲哲会 张孟云 +7 位作者 陈晶晶 聂雅诺 王凤瑞 刘志科 焦凤超 郝香琪 梁成成 郭晓秋 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第4期2082-2092,共11页
【目的】建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白结构域Ⅲ(E-DⅢ)抗体间接ELISA检测方法,为DTMUV血清学监测提供一种检测手段。【方法】利用PCR扩增DTMUV E-DⅢ基因,连接至pET-30a(+)载体构建重组质粒pET-E-DⅢ,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细... 【目的】建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白结构域Ⅲ(E-DⅢ)抗体间接ELISA检测方法,为DTMUV血清学监测提供一种检测手段。【方法】利用PCR扩增DTMUV E-DⅢ基因,连接至pET-30a(+)载体构建重组质粒pET-E-DⅢ,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物,建立E-DⅢ蛋白抗体间接ELISA检测方法,优化抗原浓度和抗体稀释度、封闭条件、待检血清反应条件、酶标二抗反应条件和显色时间,明确临界值判断标准,评价所建立抗体间接ELISA检测方法的特异性、敏感性和重复性,并对背景清楚的126份血清进行检测。【结果】成功构建含大小约300 bp目的条带的重组质粒pET-E-DⅢ,诱导表达获得分子质量约16 ku的重组蛋白E-DⅢ,且以可溶性和包涵体共存表达,浓度为284.5 mg/L。经筛选确定最佳间接ELISA工作条件为:E-DⅢ蛋白包被浓度为250 ng/mL,待检血清稀释度为1∶80,封闭条件为25℃封闭1.5 h,待检血清反应条件为37℃孵育1 h,酶标二抗为1∶7500稀释,37℃孵育1 h,显色时间为10 min。确定D_(450nm)值≥0.337为阳性,D_(450nm)值≤0.282为阴性。特异性试验结果显示,该方法仅DTMUV阳性血清检测结果为阳性,新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒1型和3型阳性血清检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法检测阳性血清的最大稀释度为1∶1280。重复性试验结果显示,批内试验和批间试验变异系数分别为2.11%~5.09%和3.25%~6.95%。126份背景清楚血清检测结果显示,阳性和阴性血清符合率分别为95.83%和96.30%。【结论】本研究表达纯化了DTMUV E-DⅢ蛋白,并成功建立了基于E-DⅢ蛋白的特异性好、敏感性高、重复性良好的抗体间接ELISA检测方法。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒(DTMUV) E蛋白结构域Ⅲ 原核表达 间接ELISA 抗体
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基于RdRp蛋白的兔出血症病毒感染与免疫鉴别诊断ELISA方法的建立
3
作者 朱薇 仇汝龙 +7 位作者 陈萌萌 胡波 魏后军 范志宇 葛雷 伍孟婷 宋艳华 王芳 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第1期414-422,共9页
为建立区别兔出血症病毒(RHDV)感染与疫苗免疫的诊断ELISA方法,本研究通过原核表达系统表达RHDV1和RHDV2 RdRp蛋白,成功纯化获得这两种可溶性RdRp蛋白,并以RdRp蛋白作为包被抗原,建立检测抗RdRp血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,经纯... 为建立区别兔出血症病毒(RHDV)感染与疫苗免疫的诊断ELISA方法,本研究通过原核表达系统表达RHDV1和RHDV2 RdRp蛋白,成功纯化获得这两种可溶性RdRp蛋白,并以RdRp蛋白作为包被抗原,建立检测抗RdRp血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,经纯化和酶切后,获得不含标签蛋白的RdRp蛋白,约为57 ku。经Western blot验证,2种RdRp蛋白均与RHDV1或RHDV2感染血清发生特异性反应且无型别间差异。因此,选择RHDV2-RdRp作为包被抗原,包被浓度为2.5μg·mL^(-1);最佳血清稀释度为1∶100,孵育时间为37℃60 min;酶标抗体的最佳稀释度为1∶10000;临界值为0.225。经验证,该ELISA方法具有较好的特异性和敏感性;其批内、批间重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的稳定性。通过对RHDV攻毒后样本及基因工程疫苗免疫后血清样本进行检测。结果显示,RHDV感染后可以诱导机体产生针对RdRp蛋白的血清抗体,而基因工程疫苗免疫后血清检测为阴性。本研究基于RHDV-RdRp蛋白所建立的ELISA方法可以对基因工程疫苗免疫和RHDV感染进行区分,为筛查RHDV的临床感染提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp) 间接ELISA
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牛结节性皮肤病病毒A33R蛋白的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
4
作者 包燕玲 宋昱庆 +6 位作者 户鑫兵 钟匀汝 田占成 苟惠天 关贵全 殷宏 独军政 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第3期335-341,共7页
为了建立一种快速准确的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ELISA抗体检测方法,本研究参考GenBank中的LSDV A33R基因序列,设计截去编码跨膜区片段,密码子优化后合成该截短基因并克隆至原核表达质粒pET-28a,构建了重组质粒pET-28a-A33R_(Δ45-67 a... 为了建立一种快速准确的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ELISA抗体检测方法,本研究参考GenBank中的LSDV A33R基因序列,设计截去编码跨膜区片段,密码子优化后合成该截短基因并克隆至原核表达质粒pET-28a,构建了重组质粒pET-28a-A33R_(Δ45-67 aa),IPTG诱导表达A33R_(Δ45-67 aa)蛋白,纯化后以其作为诊断抗原建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示,利用大肠杆菌成功表达并纯化获得分子质量为21 k Da的重组A33R_(Δ45-67aa)蛋白,并建立了LSDV间接ELISA抗体检测方法,该方法具有良好的特异性和敏感性。批间和批内重复试验变异系数均低于10%,表明该间接ELISA方法重复性良好,稳定性高。该方法与IDScreen^(®)Capripox双抗原夹心ELISA试剂盒检测结果总符合率为97.7%,表明其可用于LSDV的抗体检测,将为LSD的防控提供技术支撑。 展开更多
关键词 牛结节性皮肤病病毒 A33R_(Δ45-67aa)蛋白 截短表达 间接ELISA
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基于牛病毒性腹泻病毒核心蛋白C间接ELISA抗体检测方法的建立
5
作者 贾东鹭 阮武营 +11 位作者 刘飞飞 李星仪 杨澳飞 尹波 陈慧敏 陈建 魏颖 何雷 余祖华 马雪连 丁轲 陈松彪 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期63-70,共8页
为建立基于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C的间接ELISA检测方法,通过PCR扩增出BVDV C基因,克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-C,经IPTG诱导表达纯化后免疫BABL/c小鼠制备多克隆抗体,以C蛋白为包被抗原,建立间接ELISA检... 为建立基于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C的间接ELISA检测方法,通过PCR扩增出BVDV C基因,克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-C,经IPTG诱导表达纯化后免疫BABL/c小鼠制备多克隆抗体,以C蛋白为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,pET-32a-C重组质粒构建成功,重组C蛋白大小约为30 k Da,能够以可溶形式表达,30℃、0.8 mmol/L IPTG诱导6 h可溶性表达最佳;该蛋白免疫BABL/c小鼠后制备血清抗体效价为1∶128000,能够特异性识别C蛋白。该ELISA检测方法的最适条件为:0.5μg/m L抗原37℃包被2 h,10 g/L BSA溶液37℃封闭3 h,1∶16000稀释血清孵育2 h,二抗孵育40 min,避光显色10 min,阴阳性临界值判定标准为0.224,具有良好的特异性和重复性。利用本方法对未免疫接种的疑似BVDV感染的牛血清进行检测,与RT-qPCR核酸检测方法相比,二者阳性符合率达94.73%。上述结果表明,基于C蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为BVDV临床诊断及开发基于C蛋白的间接ELISA检测试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 核心蛋白C 原核表达 多克隆抗体 间接ELISA
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动物源弯曲杆菌免疫显性抗原鉴定及间接ELISA检测方法的建立
6
作者 杨欢 王策 +6 位作者 王玉飞 赵晶 张会强 曹易博 姬钰浩 邓兴梅 张辉 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第3期1418-1433,共16页
【目的】筛选胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)血清免疫显性抗原,初步建立动物弯曲杆菌病血清学ELISA诊断方法。【方法】利用生物信息学分析软件对候选抗原进行分析筛选,用pET-28a(+)原核表达载... 【目的】筛选胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)血清免疫显性抗原,初步建立动物弯曲杆菌病血清学ELISA诊断方法。【方法】利用生物信息学分析软件对候选抗原进行分析筛选,用pET-28a(+)原核表达载体构建重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白。通过SDS-PAGE和His标签抗体Western blotting检测蛋白表达情况。制备兔源弯曲杆菌多克隆抗体并将其作为Western blotting一抗验证抗原与多克隆抗体反应原性。建立间接ELISA检测方法,优化抗原包被浓度、封闭液及封闭时间、一抗和二抗稀释度及反应时间等反应条件,确定临界值,评价其特异性、灵敏性、重复性。【结果】利用生物信息学分析软件筛选出胎儿弯曲杆菌抗原SapA、空肠弯曲杆菌抗原FlaA。原核表达纯化后,Western blotting检测SapA蛋白大小为101 ku,FlaA蛋白大小为59 ku。制备的胎儿弯曲杆菌兔多克隆抗体血清效价为1∶64000,空肠弯曲杆菌兔多克隆抗体效价为1∶128000。Western blotting结果表明,抗原SapA、FlaA特异性识别弯曲杆菌多克隆抗体,具有良好的反应原性。以纯化的SapA蛋白作为包被抗原,确定的最优包被浓度为2.5μg/mL,封闭液为5%BSA,封闭时间30 min,一抗、二抗稀释度分别为1∶500和1∶8000,孵育时间分别为30和90 min。以纯化的FlaA蛋白作为包被抗原,确定最优包被浓度为0.4μg/mL,封闭时间1 h,其余条件与前者一致。二者与结核分枝杆菌(MTB)、副结核分枝杆菌(MAP)及布鲁氏菌(Brucella)均无交叉反应,特异性强。SapA间接ELISA方法的灵敏性最低达到1∶6400,FlaA间接ELISA方法的灵敏性达到1∶12800。批内和批间重复性试验变异系数均<10%,证明其重复性好。【结论】本研究成功鉴定了胎儿弯曲杆菌免疫显性抗原SapA、空肠弯曲杆菌免疫显性抗原FlaA,建立了动物弯曲杆菌病血清学间接ELISA诊断方法,为弯曲杆菌病防控提供了有效的诊断抗原及快速诊断方法。 展开更多
关键词 弯曲杆菌 免疫显性抗原 原核表达 Western blotting 间接ELISA
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小鼠莱姆病血清学间接ELISA实验室诊断方法的建立
7
作者 翟斌涛 包碧波 +4 位作者 马少霞 李甲 周雅馨 李冰 张继瑜 《中国比较医学杂志》 北大核心 2026年第3期93-99,共7页
目的本研究建立了一种基于伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)SZ株全菌抗原的小鼠莱姆病血清学间接ELISA实验室诊断方法,为莱姆病的实验室诊断及流行病学监测提供标准化技术支撑。方法通过系统优化实验条件,确定最佳抗原包被浓度、血清稀... 目的本研究建立了一种基于伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)SZ株全菌抗原的小鼠莱姆病血清学间接ELISA实验室诊断方法,为莱姆病的实验室诊断及流行病学监测提供标准化技术支撑。方法通过系统优化实验条件,确定最佳抗原包被浓度、血清稀释比和酶标二抗浓度。制备小鼠感染模型,采集不同时间点血清,评估伽氏疏螺旋体与伯氏疏螺旋体B31株及阿氏疏螺旋体BO23株的交叉反应。结果确定间接ELISA最佳反应体系为:抗原包被浓度0.2μg/μL、血清稀释比1∶200、酶标二抗浓度1∶2000。该方法在保持高灵敏度(OD值>0.8)的同时,显著降低了抗原用量。小鼠感染后12~25 d抗体水平达到峰值,特异性抗体比率(ABR%)阈值为41.7%,用于区分阳性和阴性样本。交叉反应分析表明,该方法与BO23株存在一定交叉,与B31株无明显交叉。结论本研究成功建立了一种操作简便、经济高效的小鼠莱姆病间接ELISA诊断方法,适用于基层实验室及小规模筛查,为莱姆病的实验室诊断和流行病学监测提供了可靠的技术支持。 展开更多
关键词 莱姆病 间接ELISA 小鼠模型 伽氏疏螺旋体 血清学诊断
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羊副结核分枝杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用
8
作者 高云洁 郭若男 +9 位作者 陈春文 段祎凡 张镇均 聂蝉蝉 李梦雨 王慧 冯婷婷 崔莹莹 党光辉 刘思国 《中国农业科学》 北大核心 2026年第3期655-667,共13页
【目的】建立一种基于间接ELISA法的检测技术,用于检测羊副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis, MAP)特异性抗体,以期为羊副结核病(Johne’s disease, JD)的流行病学监测与防控提供一种高效、可靠的血清学方法。... 【目的】建立一种基于间接ELISA法的检测技术,用于检测羊副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis, MAP)特异性抗体,以期为羊副结核病(Johne’s disease, JD)的流行病学监测与防控提供一种高效、可靠的血清学方法。【方法】选用前期分离菌株(MAP-XJB13)的培养上清作为MAP包被抗原,通过对包被液和包被条件、封闭液和封闭条件、抗原包被浓度、血清稀释比例、抗体孵育和显色时间、显色液品牌、样品稀释液和酶标二抗保护液的筛选和优化,确定间接ELISA最佳反应条件和临界值。通过敏感性、特异性、重复性、保存期和符合率评价已建立的羊MAP间接ELISA抗体检测方法的效果。最后,使用初步组装的试剂盒应用于黑龙江和内蒙古羊的临床样品检测。【结果】确定ELISA最佳反应条件为:包被液为CBS缓冲液,包被条件为37℃4 h,封闭液为5%鱼明胶+5%海藻糖+12%PEG4000,封闭条件为37℃2 h,抗原包被浓度为80µg·mL-1,血清稀释度为1﹕40,酶标二抗血清稀释度为1﹕30 000,孵育条件为25℃条件下、一抗孵育30 min、酶标二抗孵育30 min、显色15 min,显色液为博奥龙,样品稀释液为1%卵清蛋白+0.5%海藻糖,酶标二抗保护液为0.1%卵清蛋白;建立的羊MAP间接ELISA抗体检测方法临界值为0.460,敏感性为95.89%,特异性为96.12%;交叉反应结果显示,在阴阳性结果成立的前提下,与羊布鲁氏菌阳性血清、绵羊丝状支原体阳性血清、山羊伪结核棒状杆菌阳性血清、羊结核阳性血清、山羊小反刍兽疫阳性血清、绵羊小反刍兽疫阳性血清和羊痘病毒阳性血清无交叉反应性;批内和批间变异系数分别在0.754%—7.812%和1.252%—7.277%之间,可稳定保存8个月;羊MAP间接ELISA抗体检测试剂盒与ID.vet副结核菌ELISA抗体检测试剂盒阳性符合率为95.89%,阴性符合率为95.55%,总符合率为95.56%。黑龙江和内蒙古两地的羊MAP的抗体阳性率为10.81%。【结论】成功开发了一种针对羊MAP的间接ELISA抗体检测方法。该方法表现出优良的特异性、较高的敏感性以及较长的保存期限,为JD的防控提供了有力的技术支持。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 羊副结核 间接ELISA 抗体检测 MAP-XJB13菌株
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E种牛肠道病毒VP1蛋白的截短表达及抗体间接ELISA检测方法的建立
9
作者 崔平 刘澜 +3 位作者 李本科 白耀国 李玉坤 管宇 《中国兽医杂志》 北大核心 2026年第2期40-48,共9页
为了开展E种牛肠道病毒(BEV-E)的流行病学调查和抗体筛查,本试验采用原核表达技术对BEV-E外衣壳蛋白VP1进行体外截短表达,采用His-Tag蛋白纯化柱对VP1重组蛋白进行纯化,采用蛋白免疫印迹(WB)方法对重组蛋白进行鉴定。以纯化的VP1重组蛋... 为了开展E种牛肠道病毒(BEV-E)的流行病学调查和抗体筛查,本试验采用原核表达技术对BEV-E外衣壳蛋白VP1进行体外截短表达,采用His-Tag蛋白纯化柱对VP1重组蛋白进行纯化,采用蛋白免疫印迹(WB)方法对重组蛋白进行鉴定。以纯化的VP1重组蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化和确定临界值,建立了检测BEV-E抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,并进行特异性、灵敏性、重复性、符合率试验和临床样品检测。结果显示,成功表达VP1重组蛋白;间接ELISA检测方法的最佳抗原工作浓度为15.0μg/mL,最佳一抗稀释倍数为1∶80,最佳酶标二抗稀释倍数为1∶3000,最佳封闭液为10%马血清,最佳一抗、酶标二抗、封闭液工作时间分别为30、30、60 min;临界值为0.386;与牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、产肠毒素性大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,特异性良好;BEV-E阳性血清1∶25600稀释时仍可检测出阳性,灵敏性较高;批内和批间变异系数均小于10%,重复性良好;该方法与间接免疫荧光检测方法的符合率为92.5%;临床样品检测结果显示,BEV-E抗体平均阳性率为7.88%。结果表明,本试验建立的BEV-E VP1抗体间接ELISA检测方法为开展BEV-E临床诊断和流行病学调查提供了试验依据。 展开更多
关键词 E种牛肠道病毒(BEV-E) VP1蛋白 截短表达 抗体检测 间接ELISA
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利用InlB蛋白检测小鼠血清中产单核细胞李氏杆菌抗体的间接ELISA建立
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作者 宁文晴 樊沪成 +1 位作者 张文鑫 杨晓雯 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第3期1766-1771,共6页
旨在建立一种快速有效的检测产单核细胞李氏杆菌(LM)感染样品的间接ELISA方法。本研究采用原核表达系统体外诱导表达InlB蛋白,通过优化并确定间接ELISA方法的最佳参数,建立间接ELISA方法。本研究发现,利用pColdⅡ-10×His载体能够... 旨在建立一种快速有效的检测产单核细胞李氏杆菌(LM)感染样品的间接ELISA方法。本研究采用原核表达系统体外诱导表达InlB蛋白,通过优化并确定间接ELISA方法的最佳参数,建立间接ELISA方法。本研究发现,利用pColdⅡ-10×His载体能够可溶性表达InlB蛋白;棋盘法优化后的条件为InlB蛋白包被浓度为4μg·mL^(-1),10%脱脂奶粉室温封闭2 h,血清最适稀释倍数为1∶400,37℃孵育1 h,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 500,37℃避光显色8 min,阴阳性临界值为0.37。本研究建立的间接ELISA方法仅与产单核细胞李氏杆菌阳性血清反应,当血清稀释度为1∶800时检测仍为阳性;批内重复变异系数为2.79%~6.64%,批间重复的变异系数为2.61%~7.75%,重复性好;与商品化试剂盒相比,整体符合率为95.83%。本研究建立的LM感染样品的间接ELISA检测方法特异性强,敏感性高,可用于产单核细胞李氏杆菌感染样品的快速检测,为李斯特菌病的监测提供参考。 展开更多
关键词 产单核细胞李氏杆菌 InlB蛋白 间接酶联免疫吸附试验
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四种检测方法对牛羊布鲁氏菌病检测结果差异性比较
11
作者 陆思婷 《福建畜牧兽医》 2026年第1期20-22,共3页
为优化牛羊布鲁氏菌病防控监测和净化工作中的血清学检测策略,本研究对比分析四种常用检测方法的性能表现。采用虎红平板凝集试验(RBT)、间接ELISA(i-ELISA)、竞争ELISA(c-ELISA)和荧光偏振试验(FPA)对350份牛羊血清样本进行平行检测。... 为优化牛羊布鲁氏菌病防控监测和净化工作中的血清学检测策略,本研究对比分析四种常用检测方法的性能表现。采用虎红平板凝集试验(RBT)、间接ELISA(i-ELISA)、竞争ELISA(c-ELISA)和荧光偏振试验(FPA)对350份牛羊血清样本进行平行检测。以c-ELISA检测结果作为参考标准,统计显示RBT、i-ELISA和FPA的敏感性均较高,其中i-ELISA特异性最优(98.2%)。三种方法与c-ELISA的符合率均超过95%,Kappa值≥0.75,表明检测结果一致性良好,但均存在一定假阳性现象。综合评估显示,不同方法在敏感性、特异性、操作便捷性及成本效益方面各具优势,建议根据实际工作需求(如大规模筛查或精准复核)选择适配方法,以提升检测准确性。 展开更多
关键词 布鲁氏菌病 虎红平板凝集试验 间接ELISA 竞争ELISA 荧光偏振 差异性比较
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变异链球菌卵黄抗体间接ELISA方法的建立
12
作者 纪姝亦 赵晓锋 +2 位作者 侯博雅 林倚祈 刘环宇 《山西化工》 2026年第1期50-52,72,共4页
变异链球菌(Streptococcus mutans)是龋齿的主要致病菌;卵黄抗体作为动物体内的免疫球蛋白能够有效中和病毒粒子,从而发挥疾病防治的作用。因此探究变异链球菌卵黄抗体的效价对于口腔致病菌抗体研究及疫苗评价中具有潜在应用价值和意义... 变异链球菌(Streptococcus mutans)是龋齿的主要致病菌;卵黄抗体作为动物体内的免疫球蛋白能够有效中和病毒粒子,从而发挥疾病防治的作用。因此探究变异链球菌卵黄抗体的效价对于口腔致病菌抗体研究及疫苗评价中具有潜在应用价值和意义。由于目前缺少对变异链球菌卵黄抗体进行效价评估检测方法的建立,本实验通过建立间接ELISA检测方法以优化其评估方法。实验采用变异链球菌抗原免疫母鸡制备特异性Ig Y,进行关键参数优化,包括:抗原最佳包被条件(1∶2稀释,37℃1 h后4℃过夜)、封闭条件(37℃1 h后4℃过夜)、二抗工作浓度(1∶5 000稀释,孵育2 h)及TMB显色时间(60 min)。研究建立的间接ELISA方法稳定且灵敏度高,为变异链球菌Ig Y研究提供了标准化技术方案。 展开更多
关键词 变异链球菌 卵黄抗体 间接ELISA
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一种基于截短N蛋白的猪丁型冠状病毒抗体ELISA检测方法的建立 被引量：2
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作者 王东升 于瑞明 +5 位作者 张莉萍 白英杰 刘霞 王永录 杜晓华 刘新生 《生物工程学报》 北大核心 2025年第7期2760-2773,共14页
为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdⅡ中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV... 为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdⅡ中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)阳性血清的反应原性和特异性。同时对重组真核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2进行Western blotting和间接免疫荧光实验验证分析。最后使用重组原核蛋白PDCoV-N2建立间接ELISA方法,优化反应条件,检测敏感性、特异性及重复性,并对102份临床血清进行了检测。重组原核蛋白PDCoV-N2与PEDV抗血清交叉反应较低。以PDCoV-N2蛋白制备的间接ELISA方法的最优条件为:抗原包被浓度1.25μg/mL,37℃包被1 h,BSA封闭液4℃过夜,血清最佳稀释浓度1:50,37℃孵育1 h,酶标二抗最佳稀释比例为1:80000,37℃孵育1 h,加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色液37℃反应10 min。待检样品的S/P值(样本值–阴性对照值)/(阳性对照值–阴性对照值)≥0.45为阳性,S/P值≤0.38为阴性,S/P值介于0.45和0.38之间,则为可疑。检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis of swine,TGEV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,ASFV)阳性血清,结果显示,其他冠状病毒的S/P值均小于0.38,表明其具有良好的特异性;PDCoV抗血清800倍稀释后仍为阳性;批间和批内重复性实验结果显示,本方法变异系数均小于10%;临床血清样本检测结果显示,该方法与中和实验的符合率为94.12%。本研究基于截短的PDCoV N蛋白,建立了能够检测抗PDCoV特异性IgG抗体的ELISA方法,且该方法敏感、特异、稳定、重复性好,为PDCoV的临床诊断提供了新的方法。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 截短N蛋白 IGG抗体 间接ELISA
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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1
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作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页
为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接ELISA
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禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量：1
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作者 苏晓月 吕转平 +2 位作者 沈亚安 赵明明 唐思静 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第1期64-69,共6页
为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间... 为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV、AIV-H9、ILTV阳性血清均为阴性,最低抗体检出效价为1︰12800,与进口试剂盒的符合率为94.87%,检测临床血清样品的阳性率为14.02%。结果说明该研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、符合性好,可为ALV的检测和净化等提供一种简单快速的方法。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 间接ELISA方法 抗体检测 净化
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牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用 被引量：1
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作者 刘兵 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第5期68-75,共8页
为了建立一种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗体检测方法,本研究对IBRV gD蛋白进行原核表达,以表达蛋白为包被抗原建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示:gD基因PCR扩增产物约945 bp,构建原核表达载体pET30a-gD,经IPTG诱导表达,Weste... 为了建立一种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗体检测方法,本研究对IBRV gD蛋白进行原核表达,以表达蛋白为包被抗原建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示:gD基因PCR扩增产物约945 bp,构建原核表达载体pET30a-gD,经IPTG诱导表达,Western blot检测显示重组蛋白具有良好的反应活性,以纯化蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)阳性血清均为阴性,检测IBRV阳性血清的最低抗体检出效价为1∶12800,与病毒中和试验方法的符合率为96.15%,批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和8%,检测825份免疫疫苗牛血清样品和514份未免疫疫苗牛血清样品的阳性率分别为90.67%和7.39%。本研究建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、准确性、重复性,为IBRV的临床诊断、流行病学调查、免疫抗体监测、疫苗免疫效果评价等提供了一种简单快速的血清学检测方法。 展开更多
关键词 牛传染性鼻气管炎病毒 gD蛋白 原核表达 间接ELISA
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施马伦贝格病毒N蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1
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作者 李阳 孙睿雪 +3 位作者 陈天杰 刘思彤 曹家慧 赵建军 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期3877-3887,共11页
[目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌... [目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的SBV N蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种iELISA方法,并对其包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育时间等反应条件进行优化,检测其阴阳性临界值、特异性、灵敏性和重复性。[结果]SDS-PAGE结果显示,SBV N蛋白分子质量为30 ku;Western blotting结果显示,纯化后SBV N蛋白与SBV阳性血清能产生特异性反应。本研究建立的SBV iELISA检测方法最佳条件为:SBV N抗原包被浓度4μg/mL、4℃包被12 h、1%明胶37℃封闭1 h、血清稀释度为1:200、37℃孵育1 h、1:6 000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h,其阴阳性临界值为0.371。该iELISA检测方法仅与SBV阳性血清产生特异性反应,与牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和阿卡斑病毒(AKAV)阳性血清均无明显交叉反应,灵敏性较高,SBV阳性血清稀释度为1:1280时仍有明显反应。批间重复试验和批内重复试验变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其总符合率为94.57%。[结论]本研究建立了一种以SBV N蛋白为检测抗原的SBV iELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于SBV血清学检测,试验结果为SBV的快速诊断提供更多选择。 展开更多
关键词 施马伦贝格病毒(SBV) N蛋白 间接ELISA(iELISA) 原核表达
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鸡痘病毒ORF127蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用
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作者 华炯钢 朱寅初 +6 位作者 叶加林 张存 陈柳 倪征 付媛 霍苏馨 云涛 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第10期2057-2065,共9页
为建立快速、准确的鸡痘病毒(fowlpox virus,FPV)抗体检测方法,将FPV ORF127基因的抗原表位区域克隆于pET-28a(+)原核表达载体,诱导表达并纯化获得FPV ORF127截短蛋白,以纯化的蛋白作为包被抗原,通过优化各反应条件,建立检测FPV抗体的间... 为建立快速、准确的鸡痘病毒(fowlpox virus,FPV)抗体检测方法,将FPV ORF127基因的抗原表位区域克隆于pET-28a(+)原核表达载体,诱导表达并纯化获得FPV ORF127截短蛋白,以纯化的蛋白作为包被抗原,通过优化各反应条件,建立检测FPV抗体的间接ELISA方法,经特异性、敏感性、重复性等试验和临床血清样本检测进行系统验证。结果显示,间接ELISA检测FPV抗体的最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为10μg·mL^(-1),待检血清稀释度为1∶100,酶标二抗稀释度为1∶25000;特异性试验结果显示,除FPV阳性血清呈阳性反应外,与其他6种病毒(新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽腺病毒4型、火鸡疱疹病毒)的阳性血清均无交叉反应;敏感性结果显示,FPV阳性血清稀释800倍后检测结果仍为阳性;批内、批间重复试验结果显示,批内变异系数为1.81%~7.07%,批间变异系数为2.12%~7.16%,均小于10%。临床血清样品检测结果显示,180份血清样本总阳性率为79.4%(143/180)。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好,可为免疫鸡群FPV抗体水平监测和FPV流行病学调查提供技术支撑。 展开更多
关键词 鸡痘病毒 ORF127蛋白 间接ELISA 抗体
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猪圆环病毒4型Cap蛋白间接ELISA检测方法的建立及临床应用
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作者 陈如敬 吴学敏 +4 位作者 吴仁杰 严山 陈秋勇 何冰 周伦江 《福建农业学报》 北大核心 2025年第10期1014-1021,共8页
【目的】构建一种基于猪圆环病毒4型(porcine circovirus 4,PCV4)衣壳蛋白(capsid protein,Cap)的血清学检测技术,用于筛查PCV4感染状况,为后续开展PCV4流行病学研究提供切实可行的方法。【方法】选用PCV4FJ2010001株基因组作为PCR扩增... 【目的】构建一种基于猪圆环病毒4型(porcine circovirus 4,PCV4)衣壳蛋白(capsid protein,Cap)的血清学检测技术,用于筛查PCV4感染状况,为后续开展PCV4流行病学研究提供切实可行的方法。【方法】选用PCV4FJ2010001株基因组作为PCR扩增模板,针对PCV4的衣壳蛋白基因设计特异性扩增引物。通过PCR技术成功获取Cap基因全长编码序列,并将其定向克隆至pET30a(+)原核表达系统。经亲和层析法纯化重组蛋白后,采用SDSPAGE和Western blotting验证蛋白抗原性。基于优化后的抗原包被浓度(1.25μg·mL^(-1))、血清稀释度(1︰200)及二抗工作浓度(1∶10 000)等关键参数,建立特异性检测体系。应用该体系对福建省2020–2024年间采集的1 195份规模猪场血清样本进行回溯性检测,并系统分析PCV4与PCV2、PCV3的共感染特征。【结果】SDS-PAGE分析显示:重组Cap蛋白在15℃低温诱导16 h条件下呈现高效可溶性表达,其分子量约为28.3 kDa;Western blotting证实纯化的蛋白条带单一,且可与PCV4阳性血清发生特异性免疫反应。方法学验证数据显示:该检测体系对常见猪源病原(猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等)阳性血清无交叉反应;敏感性试验确定最低检测阈值为1∶3 200稀释度;批内与批间变异系数均低于10%。近5年的血清流行病学调查显示:PCV4抗体总阳性率为7.62%(91/1 195),其中2021年阳性率较其他年份有升高趋势。多重感染分析表明:26.37%(24/91)的PCV4阳性样本同时存在PCV2感染,而14.29%(13/91)的样本呈现3种病毒共感染状态。【结论】本研究建立的间接ELISA检测体系具备优良的检测效能,其标准化操作流程和可靠的检测数据为PCV4的临床诊断提供重要技术支撑,同时为揭示该病毒的感染机制奠定了方法学基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒4型 衣壳蛋白 原核表达 间接ELISA
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鸭短喙矮小综合征病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用
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作者 朱小丽 王劭 +5 位作者 董慧 程晓霞 江丹丹 肖世峰 陈少莺 陈仕龙 《福建农业学报》 北大核心 2025年第7期649-655,共7页
【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法。【方法】以蔗糖密度梯度离心纯化的SBDSV流行株M15,以此灭活全病毒作为固相包被抗原,通过系统性优化反应参数,构建一... 【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法。【方法】以蔗糖密度梯度离心纯化的SBDSV流行株M15,以此灭活全病毒作为固相包被抗原,通过系统性优化反应参数,构建一种高特异性的间接ELISA检测方法,用于鸭短喙矮小综合征病毒(SBDSV)血清抗体的定性分析。【结果】建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:抗原包被浓度0.1 mg·mL^(−1),37℃孵育2 h后再4℃过夜包被;1%BSA 37℃封闭2 h;血清样本1∶200稀释;阴阳性临界值为0.3214。该检测方法特异性好,与其他常见水禽病毒阳性血清均无交叉反应;敏感性高,阳性高免血清(LPAI效价2^(8))1∶204800倍稀释时检测结果仍为阳性;批内、批间重复性好,变异系数均小于6%;利用所建立的ELISA方法对70份SBDSV疑似感染病鸭的血清样品进行检测,检测结果与LPAI检测结果符合率为90%。对福建省648份临床送检1日龄雏鸭血清样品进行检测,抗体阳性率约为48.30%,显示福建省养鸭场存在不同程度的SBDSV感染。【结论】本研究建立的SBDSV血清抗体间接ELISA检测方法,该方法特异性高,适合大规模血清学检测,可为监测SBDSV在我国的流行情况以及雏鸭母源抗体水平评价提供技术支撑。 展开更多
关键词 鸭短喙矮小综合征 间接ELISA 抗体检测
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