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基于CRISPR/Cas9系统的HEK293T细胞DMD基因第51号外显子的靶向敲除
1
作者 李双 马珊珊 +4 位作者 崔思颖 屈素真 蔡奥捷 关方霞 孔祥东 《基础医学与临床》 CSCD 2018年第3期375-380,共6页
目的应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中DMD基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除。方法设计靶向人DMD基因exon51 5'端及3'端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使... 目的应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中DMD基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除。方法设计靶向人DMD基因exon51 5'端及3'端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使用Surveyor法检测切割活性;使用目标外显子两端切割活性最高的sgRNA构建PX459-2sgRNA质粒,转染至HEK293T细胞后用PCR及T载体测序检测靶向外显子切除情况。结果50%的HEK293T细胞中DMD基因exon51被定向切除,编辑效率较高。结论建立使用CRISPR/Cas9单质粒敲除人DMD基因exon51的平台,为DMD及其他遗传病的基因治疗研究奠定实验基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 DMD基因 单载体质粒 HEK293T细胞 外显子敲除
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Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响 被引量：3
2
作者 周志强 杨志伟 雍伟东 《中国比较医学杂志》 北大核心 2017年第5期31-36,共6页
目的通过分析Fkbp51基因敲除(knock out,KO)与野生型(wild type,WT)小鼠肝脏表达谱,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响。方法利用二代测序对Fkbp51 KO与WT小鼠肝脏进行表达谱测序,用Top Hat对RNA测序结果进行可变剪接分析... 目的通过分析Fkbp51基因敲除(knock out,KO)与野生型(wild type,WT)小鼠肝脏表达谱,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响。方法利用二代测序对Fkbp51 KO与WT小鼠肝脏进行表达谱测序,用Top Hat对RNA测序结果进行可变剪接分析,筛选出KO与WT小鼠肝组织中差异的内含子保留(intron retetion,RI)和外显子跳跃(exon skipping,SE)。通过在线工具DAVID对这些差异可变剪接体进行基因功能(gene ontology,GO)和代谢通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,同时用NCBI基因数据库对这些基因进行注释。结果(1)Fkbp51缺失可导致小鼠肝脏mRNA可变剪接发生变化;(2)Fkbp51基因敲除造成小鼠肝脏mRNA可变剪接表达量的变化;(3)通过GO与KEGG分析,我们发现这些发生差异可变剪切的基因主要与脂肪相关衍生物的代谢、免疫、胆汁酸分泌等通路相关。(4)与差异内含子保留相关的基因主要与肌动蛋白细胞骨架调控,氨基酸及其衍生物代谢相关。结论Fkbp51基因敲除能够改变基因组中mRNA的可变剪切,进而影响小鼠肝脏的代谢功能。 展开更多
关键词 Fkbp51基因敲除小鼠 肝脏 RNA-SEQ 可变剪接 内含子保留 外显子跳跃
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利用CRISPR／Cas9技术建立基因外显子敲除小鼠模型
3
作者 刘燕 张晓萍 +1 位作者 王绿娅 杜杰 《中华老年医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期768-772,共5页
目的利用CRISPR／Cas9系统建立钙结合蛋白S100a9基因外显子定向敲除小鼠。方法在S100a9基因第1个外显子5’端及第2个外显子3’端设计gRNA靶点，体外转录获得gRNA，利用Cas9蛋白体外检测gRNA切割效率。选取效率高的gRNA和Cas9mRNA注射C5... 目的利用CRISPR／Cas9系统建立钙结合蛋白S100a9基因外显子定向敲除小鼠。方法在S100a9基因第1个外显子5’端及第2个外显子3’端设计gRNA靶点，体外转录获得gRNA，利用Cas9蛋白体外检测gRNA切割效率。选取效率高的gRNA和Cas9mRNA注射C57BL／6小鼠受精卵，进行胚胎移植，利用PCR和测序方法检测F0代小鼠S100a9基因外显子敲除情况。结果F0代出生9只小鼠，PCR鉴定其中4只具有长片段删除，效率为44．4％；测序鉴定3只小鼠完全敲除了第1和第2外显子，1只敲除了第2外显子。结论成功建立利用CRISPR／Cas9系统定向敲除基因外显子的方法，获得了S100a9基因第1和第2外显子敲除的小鼠。 展开更多
关键词 小鼠 基因敲除 外显子
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