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犬冠状病毒与犬细小病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1
1
作者 傅宇飞 李传峰 +8 位作者 田传龙 李泽贤 麦嘉迅 程松 刘禹含 孟春春 朱杰 程国锋 刘光清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期75-83,共9页
根据GenBank中犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)已有基因序列设计其对应引物,通过对反应体系和扩增程序的优化,建立了CCoV和CPV双重荧光定量PCR检测方法,评估了其敏感性、特异性和重复性。结果显示,该方法最佳退火温度为60℃,引物浓... 根据GenBank中犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)已有基因序列设计其对应引物,通过对反应体系和扩增程序的优化,建立了CCoV和CPV双重荧光定量PCR检测方法,评估了其敏感性、特异性和重复性。结果显示,该方法最佳退火温度为60℃,引物浓度分别为CCoV 1.0μmol/L和CPV 0.1μmol/L,检测下限均为10~2 copies/μL。批内与批间的变异系数均小于2%。该方法用于检测犬腺病毒(CAV)、犬圆环病毒(CaCV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬流感病毒(CIV)、犬副流感病毒(CPIV)均无特异性扩增。对68份临床样品的检测,结果表明CCoV阳性率为22.0%,CPV阳性率为61.8%,与普通PCR检测结果相比,本研究建立的方法更加灵敏。本研究建立的CCoV和CPV检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,可用于对CCoV和CPV的鉴别诊断。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 犬细小病毒 双重荧光定量PCR 鉴别诊断
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鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的双重PCR检测方法建立及其在海南文昌鸡主养区感染情况调查
2
作者 薛琛璐 张艳 +5 位作者 刘海隆 陈素贞 董亚童 晁哲 魏立民 刘圈炜 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第8期100-107,共8页
皆在建立快速精准检测鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的双重PCR方法,并利用该方法检测分析海南文昌鸡主要养殖地区MG和MS感染现状及流行特点。针对MG mgC2基因和MS vlhA基因的保守序列,分别设计引物并合成,通过对反应条件及程序的... 皆在建立快速精准检测鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的双重PCR方法,并利用该方法检测分析海南文昌鸡主要养殖地区MG和MS感染现状及流行特点。针对MG mgC2基因和MS vlhA基因的保守序列,分别设计引物并合成,通过对反应条件及程序的优化,建立MG、MS双重PCR检测方法;对所建方法进行灵敏性、特异性及重复性验证,同时与国家农业行业标准进行比较,验证其准确性。应用所建方法对海南文昌鸡主要养殖地区采集的1510份未免疫MG、MS疫苗的文昌鸡咽喉拭子进行病原学检测。结果显示:建立的双重PCR检测方法对MG、MS的最低检测限度均达到2.1×10^(2)拷贝/μL;与新城疫、马立克氏病、传染性法氏囊病和传染性喉气管炎等4种鸡常见病的病原不发生交叉反应;与国家农业行业标准发布的MG、MS单一PCR方法检测结果的符合率分别达到100%与98.83%;病原学检测结果显示,海南文昌鸡主要养殖地区MG的感染率为11.79%(95%CI:10.16%~13.42%),MS的感染率为25.96%(95%CI:23.75%~28.17%),MG和MS的混合感染率为7.42%(95%CI:6.10%~8.74%);MG和MS在春季高发,以中型规模养殖场和成年鸡感染情况最为严重,商品代肉鸡的阳性率最高。结果表明,本研究建立的MG、MS双重PCR检测方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性和准确性,可应用于临床样本的检测;当前海南省文昌鸡主要养殖地区存在MG、MS感染,应加强防控。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 双重PCR 病原学 文昌鸡
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犬巴贝斯虫和犬埃立克体双重纳米PCR方法的建立及初步应用
3
作者 梁谦学 朱正 +4 位作者 王博永 李连燕 吴文德 李恭贺 郑喜邦 《动物医学进展》 北大核心 2025年第4期90-95,共6页
旨在建立一种同时检测犬巴贝斯虫(Babesia canis)和犬埃立克体(Ehrlichia canis)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法。以疑似犬巴贝斯虫病和埃立克体病血样DNA为模板,用常规双重PCR和双重纳米PCR检测犬巴贝斯虫18S rRNA和犬埃立克体16S rRNA... 旨在建立一种同时检测犬巴贝斯虫(Babesia canis)和犬埃立克体(Ehrlichia canis)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法。以疑似犬巴贝斯虫病和埃立克体病血样DNA为模板,用常规双重PCR和双重纳米PCR检测犬巴贝斯虫18S rRNA和犬埃立克体16S rRNA,并对PCR的退火温度和引物浓度等参数进行了优化。结果显示,双重纳米PCR方法具有良好特异性和灵敏性,与其他4种犬常见病原体无交叉反应,对犬巴贝斯虫和犬埃立克体的最低核酸检测量分别为2.07×10^(3)和1.92×10^(3)copies/μL,其灵敏性比常规PCR高100倍。为了解南宁地区犬巴贝斯虫和犬埃立克体的流行情况,采用该方法对来自南宁市5家宠物医院的152份血清样品进行了检测。结果显示,犬巴贝斯虫和犬埃立克体感染率分别为2.63%和9.87%,混合感染率为1.32%。该双重纳米PCR方法为犬巴贝斯虫和埃立克体病早期快速诊断提供了新方法。 展开更多
关键词 双重纳米PCR 犬巴贝斯虫 犬埃立克体 病原检测
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基于布鲁氏菌S2疫苗株缺失基因双重PCR检测方法的建立
4
作者 张昊 刘浩 +4 位作者 崔海霞 高娃 张丽丽 吕志远 王文龙 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第11期77-83,共7页
为了解决布鲁氏菌疫苗株与野毒株鉴别困难的技术难题,试验采用全基因组序列比对分析的方法,对布鲁氏菌S2疫苗株与布鲁氏菌1330野毒株进行比对,筛选一段S2疫苗株缺失基因,通过结合布鲁氏菌通用抗原BP26基因设计2对特异性引物,建立了一种... 为了解决布鲁氏菌疫苗株与野毒株鉴别困难的技术难题,试验采用全基因组序列比对分析的方法,对布鲁氏菌S2疫苗株与布鲁氏菌1330野毒株进行比对,筛选一段S2疫苗株缺失基因,通过结合布鲁氏菌通用抗原BP26基因设计2对特异性引物,建立了一种能够区分S2疫苗株与其他菌株的双重PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性试验,同时应用该方法对84份临床样品进行检测,计算符合率。结果表明:在试验建立的双重PCR检测方法中,S2疫苗株因缺失靶序列仅显示单一BP26条带,而野毒株及其他疫苗株(Rev.1、A19等)呈现双条带(BP26基因条带与S2疫苗株缺失片段条带)。该检测方法最佳引物浓度为6μmol/L,退火温度为54℃,退火时间为30 s,延伸时间为45 s,共35次循环,最低检测限为7.536×10^(-5)ng/μL,与大肠杆菌、链球菌无交叉反应,具有良好的重复性。用本试验建立的双重PCR检测方法检测临床样品84份,布鲁氏菌阳性率为61.9%(52/84),其中S2疫苗株阳性率为40.5%(34/84),与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合率为96.4%(81/84)。说明本试验建立的鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与其他菌株的双重PCR检测方法兼具高特异性和敏感性,可用于临床样品布鲁氏菌的检测。 展开更多
关键词 布鲁氏菌病 S2疫苗株 野毒株 双重PCR 基因缺失
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人星状病毒和人札幌病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
5
作者 林鹏 吴毓薇 +6 位作者 赵昕宇 蒋富凤 万强 薛亮 徐环 蔡芷荷 吴清平 《微生物学通报》 北大核心 2025年第4期1810-1829,共20页
【背景】人星状病毒(human Astrovirus,HAstV)和人札幌病毒(human Sapovirus,HuSaV)是引起人类急性胃肠炎的重要病原体,尤其对婴幼儿、老年人和免疫力低下等人群造成严重的威胁。目前尚无疫苗和特异性手段防控病毒的感染与传播,因此加... 【背景】人星状病毒(human Astrovirus,HAstV)和人札幌病毒(human Sapovirus,HuSaV)是引起人类急性胃肠炎的重要病原体,尤其对婴幼儿、老年人和免疫力低下等人群造成严重的威胁。目前尚无疫苗和特异性手段防控病毒的感染与传播,因此加强检测对防控病毒的传播具有重要的意义。【目的】建立能同时检测HAstV和HuSaV的双重荧光定量RT-PCR方法,为HAstV和HuSaV的快速检测和流行病学调查提供技术支持。【方法】针对HAstV和HuSaV保守区域基因序列,设计特异性检测引物和探针并优化反应体系,建立HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法,并分析其特异性、敏感性和重复性。【结果】HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法针对HAstV和HuSaV最低检测线分别为15 copies/μL和2.1 copies/μL;与其他常见的食源性病毒、致病菌和乳酸菌无交叉反应;批内和批间重复性试验变异系数均小于3.5%。采用人工模拟不同浓度的病毒污染牡蛎样品,结果显示HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法能检测出所有受污染的牡蛎样品,与阳性对照组检测结果差异不显著(P>0.05);利用所建立的HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法检测不同食品样品的HAstV和HuSaV,其阳性率分别为10.83%和0%。【结论】本研究建立的HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,适用于食品样品中HAstV和HuSaV的快速检测及大规模流行病学调查。 展开更多
关键词 人星状病毒 人札幌病毒 双重荧光定量RT-PCR检测方法
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转基因玉米MON87411双重微滴式数字PCR定量检测方法的建立 被引量：1
6
作者 闫邦奇 水克娟 +4 位作者 黎财慧 徐淼锋 林伟 廖力 张卫东 《现代食品科技》 北大核心 2025年第3期378-386,共9页
基于微滴式数字PCR技术,建立了转基因玉米MON87411双重微滴式数字PCR定量检测方法。试验结果显示,该方法仅有玉米MON87411能特异性检出,其他样品均无扩增反应。扩增稳定性试验,3次平行扩增内外源基因拷贝数RSD分别为0.56%和3.93%,均符合... 基于微滴式数字PCR技术,建立了转基因玉米MON87411双重微滴式数字PCR定量检测方法。试验结果显示,该方法仅有玉米MON87411能特异性检出,其他样品均无扩增反应。扩增稳定性试验,3次平行扩增内外源基因拷贝数RSD分别为0.56%和3.93%,均符合RSD小于25%的要求。线性相关性曲线显示,当模板DNA质量浓度在50~0.08 ng/μL之间时,目标序列拷贝数与模板DNA浓度具有良好的线性关系,相关系数R~2均大于0.99,品系特异性序列定量线性范围在26.6~17 086.6拷贝之间,定量限(LOQ)为1.34拷贝/μL。准确度试验,五个不同质量浓度模板DNA平均拷贝数含量分别为52.14%、63.09%、66.08%、60.50%、52.16%,均在理论拷贝数含量范围内。综上所述,该研究建立的双重微滴式数字PCR定量检测方法特异性强,稳定性好,定量范围广,灵敏度和准确度高,可以用于转基因玉米MON87411的定量检测。 展开更多
关键词 双重微滴式数字PCR 转基因玉米 MON87411 定量检测
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牛病毒性腹泻病毒和牛肠道病毒二重PCR检测方法的建立及病原学分析
7
作者 闫志浩 杨柳菲 +4 位作者 曹馨月 杨钦 李世玲 杨梦晗 陈红英 《养殖与饲料》 2025年第10期52-56,共5页
[目的]为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛肠道病毒(BEV)的早期诊断及防控提供技术支持。[方法]在靶向BVDV和BEV 5’-UTR保守区,各设计1对特异性引物,建立1种能同时检测BVDV和BEV的二重PCR方法,运用该方法对2024-2025年采自河南、四川以及河... [目的]为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛肠道病毒(BEV)的早期诊断及防控提供技术支持。[方法]在靶向BVDV和BEV 5’-UTR保守区,各设计1对特异性引物,建立1种能同时检测BVDV和BEV的二重PCR方法,运用该方法对2024-2025年采自河南、四川以及河北等地牛场患腹泻牛的50份粪便样品进行检测并进行遗传进化分析,评估该方法的特异性和灵敏度。[结果]该方法能同时扩增BVDV的223 bp和BEV的96 bp,而对其他的常见牛病原核酸扩增均为阴性。BVDV和BEV的最低检测值分别为815 copies/μL和783 copies/μL。在50份粪便样品中,BVDV和BEV的检出率分别为68%、42%,二者混合感染率为24%。测序获得12株BVDV和12株BEV的5′-UTR序列。遗传分析显示,获得的12株BVDV均属于BVDV-1m亚型。12株BEV中,有10株属于BEV-F种,余下2株属于BEV-E种。[结论]成功建立1种BVDV和BEV二重PCR检测方法,且我国部分省份牛场中主要流行的是BVDV-1m亚型和BEF-F种。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 牛肠道病毒 二重PCR 遗传进化
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双重TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应快速鉴别肉质金腰和长梗金腰
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作者 米雪 解盈盈 +6 位作者 达娃卓玛 孙仟 颜琪 崔伟亮 郑健 汪冰 林永强 《中国药学杂志》 北大核心 2025年第18期1908-1915,共8页
目的建立肉质金腰及其近缘物种长梗金腰的双重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴别方法。方法以ITS2序列为基础,根据肉质金腰及长梗金腰序列特点,寻找单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,... 目的建立肉质金腰及其近缘物种长梗金腰的双重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴别方法。方法以ITS2序列为基础,根据肉质金腰及长梗金腰序列特点,寻找单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,分别设计肉质金腰和长梗金腰的特异性引物及探针,通过对引物探针浓度、退火温度、循环次数等关键参数优化,建立双重实时荧光PCR反应条件;此外还对该方法的精密度、重复性、特异性、灵敏度等指标进行了评估。结果所建立的双重TaqMan探针实时荧光PCR方法的重复性良好。当掺入比例低至1%时,该方法均有典型荧光扩增曲线,进一步表明该方法灵敏度较高,特异性较强。结论本研究所建立的双重TaqMan探针实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高,可同时检测肉质金腰及近缘物种长梗金腰,为肉质金腰及长梗金腰的鉴别提供一种专属性更强的技术手段参考。 展开更多
关键词 肉质金腰 长梗金腰 双重实时荧光聚合酶链式反应 TAQMAN探针 藏药
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蛙病毒3型类和桑蒂库帕蛙病毒类双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用
9
作者 邓艳 柏建山 +5 位作者 徐浩 季新成 黄燕琼 何淑华 曾伟伟 蒋茗 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第1期48-53,79,共7页
为建立一种可快速鉴别检测蛙病毒3型(FV3)类和桑蒂库帕蛙病毒(SCRV)类的双重荧光定量PCR(qPCR)方法,本研究根据FV3类和SCRV类的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列,设计一对特异性引物和两种不同荧光标记的探针,采用特异性引物扩增虎纹蛙病毒(T... 为建立一种可快速鉴别检测蛙病毒3型(FV3)类和桑蒂库帕蛙病毒(SCRV)类的双重荧光定量PCR(qPCR)方法,本研究根据FV3类和SCRV类的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列,设计一对特异性引物和两种不同荧光标记的探针,采用特异性引物扩增虎纹蛙病毒(TFV)和大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)的目的基因,构建重组质粒标准品pMD19-T-TFV和pMD19-T-LMBV。采用矩阵法优化各反应条件后,初步建立了检测这两类蛙病毒的双重qPCR方法。标准曲线结果显示两个重组质粒标准品混合物与各自的Ct值均呈良好的线性关系。采用本研究建立的方法分别检测TFV、LMBV、伯勒虹彩病毒(BCV)、蛙病毒3型、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、锦鲤疱疹病毒、罗非鱼湖病毒、病毒性神经坏死病毒、斑点叉尾鮰病毒、鲤浮肿病毒、传染性造血器官坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、呼肠孤病毒Ⅱ型、疱疹病毒Ⅱ型,评估该方法的特异;以100~108稀释的重组质粒标准混合物为模板采用建立的双重qPCR方法检测,评估该方法的敏感性;以10^(2)~10^(8)稀释的重组质粒标准混合物为模板采用该双重qPCR方法分别进行组内和组间的重复性试验。结果显示,该方法仅能扩增出FV3类的TFV、BIV、FV3及EHNV和SCRV类的LMBV,其他病毒均无扩增曲线;对pMD19-T-TFV和pMD19-T-LMBV的检测限分别为1拷贝/µL和10拷贝/µL;组内变异系数和组间变异系数均小于2%。利用建立的双重qPCR方法和WOAH推荐的常规PCR方法分别对298份临床样品分别进行检测,结果显示,双重qPCR方法检出21份SCRV类,2份FV3类,普通PCR方法检出15份SCRV类,2份FV3类,双重PCR方法与常规PCR方法对FV3类和SCRV类的检测结果的阳性符合率均达100%。本研究建立的双重qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,对于多种蛙病毒属成员的鉴别检测和早期预警具有重要意义。 展开更多
关键词 蛙病毒 双重荧光定量PCR TAQMAN探针
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圆圈病毒禽源1型和圆圈病毒人源1型二重荧光定量PCR检测方法的建立
10
作者 余丹 谢芝勋 +5 位作者 赵俊柯 张艳芳 谢志勤 谢丽基 尹文巧 喻华英 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第1期59-65,73,共8页
圆圈病毒禽源1型(GyVg1)和圆圈病毒人源1型(GyH1)是两种新发现的可引起鸡腺胃炎相关症状的环形病毒,目前在全球多个地区均有检测报道。本研究旨在建立一种能快速同时鉴别GyVg1和GyH1的二重荧光定量PCR方法。使用GenBank中现有的GyVg1和G... 圆圈病毒禽源1型(GyVg1)和圆圈病毒人源1型(GyH1)是两种新发现的可引起鸡腺胃炎相关症状的环形病毒,目前在全球多个地区均有检测报道。本研究旨在建立一种能快速同时鉴别GyVg1和GyH1的二重荧光定量PCR方法。使用GenBank中现有的GyVg1和GyH1基因组序列,基于其保守区分别设计相应的特异性引物和探针,经过优化反应条件,建立了GyVg1和GyH1的二重荧光定量PCR检测方法。应用该检测方法对2023年在广西南宁8个地区采集的256份临床样本进行检测,与常规PCR检测和测序结果进行分析比较,进一步验证该方法的有效性。结果显示,所建立的二重荧光定量PCR方法可在1 h内鉴定出GyVg1和GyH1,两套引物探针均可有效扩增,且与其他病原体无交叉反应;检测下限为7.5拷贝/μL,标准曲线相关系数>0.99,批内和批间变异系数<0.45%。临床样品检测结果显示,当模板量≥100.0拷贝/μL时,二重荧光定量PCR测定与常规PCR测定之间的一致性分别为94.3%(GyVg1)和100%(GyH1)。综上,所建立的二重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于GyVg1和GyH1的快速鉴别检测。 展开更多
关键词 圆圈病毒禽源1型 圆圈病毒人源1型 二重荧光定量PCR
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赤羽病病毒和施马伦贝格病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立和应用
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作者 邓俊花 陈冬杰 +3 位作者 魏方 王晶晶 吕继洲 吴绍强 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第4期124-130,共7页
为建立一种能够同时检测赤羽病病毒(AKAV)和施马伦贝格病毒(SBV)的方法,本研究以AKAV和SBV的S基因为靶基因,设计其通用引物和特异性探针,通过优化反应条件,建立了AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行检... 为建立一种能够同时检测赤羽病病毒(AKAV)和施马伦贝格病毒(SBV)的方法,本研究以AKAV和SBV的S基因为靶基因,设计其通用引物和特异性探针,通过优化反应条件,建立了AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行检验。同时,评估其临床应用效果。结果显示:该方法AKAV以及SBV最低检测线均可达1.5 copies/μL;与牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒均无交叉反应,具有良好的特异性;50份临床样品检测结果与AKAV、SBV行业标准推荐方法符合率为100%。本研究建立的双重荧光RT-PCR方法,适用于AKAV和SBV的临床检测,为疫情防控提供了新的筛查手段。 展开更多
关键词 赤羽病病毒 施马伦贝格病毒 双重荧光RT-PCR 应用
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鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究 被引量：1
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作者 赵雪丽 闫若潜 +8 位作者 王华俊 王淑娟 马震原 谢彩华 柴茂 杨海波 王翠 刘影 王东方 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期165-173,共9页
建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性... 建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 rep基因 猪圆环病毒3型 cap基因 双重TaqMan MGB FQ-PCR
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基于二重实时荧光PCR方法精准快速鉴定大豆转基因种子转化体纯度
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作者 李允静 任雪贞 +10 位作者 肖芳 晋芳 高鸿飞 景琦 武玉花 孙全 李俊 王培 翟杉杉 金石桥 吴刚 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第23期4698-4711,共14页
【目的】耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004、中黄6106(ZH10-6)相继获得生产应用安全证书,针对这3个转化体建立二重实时荧光PCR检测方法,应用于大豆转基因转化体种子纯度的精准、快速鉴定,为大豆转基因品种种子质量安全监管提供技术支撑。... 【目的】耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004、中黄6106(ZH10-6)相继获得生产应用安全证书,针对这3个转化体建立二重实时荧光PCR检测方法,应用于大豆转基因转化体种子纯度的精准、快速鉴定,为大豆转基因品种种子质量安全监管提供技术支撑。【方法】搜集耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004和中黄6106 3个转化体以及4个大豆内标准基因Lectin的实时荧光PCR方法,通过比较ΔCt值,遴选出二重实时荧光PCR的最佳大豆内标准基因检测方法;设置转化体和Lectin不同引物/探针浓度,优化二重实时荧光PCR的反应体系;根据不同类型的特异性测试样品测试二重实时荧光PCR方法的特异性;设置2 000、200、20、10、5和1拷贝的梯度样品,测试方法的检出限。利用一步提取液快速研磨单粒种子,以稀释后的粗提液直接作为模板进行二重实时荧光PCR扩增,进而开展耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004和中黄6106单粒种子纯度的检测。【结果】经测试计算最小ΔCt值,在SHZD3201、DBN9004和中黄6106转化体二重实时荧光PCR中,遴选出最佳大豆内标准基因Lectin检测方法。经优化,SHZD3201/Lectin二重实时荧光PCR反应体系中,SHZD3201转化体的引物/探针浓度为0.3μmol·L^(-1)/0.15μmol·L^(-1),Lectin的引物/探针浓度为0.3μmol·L^(-1)/0.15μmol·L^(-1);DBN9004/Lectin二重实时荧光PCR反应体系中,DBN9004转化体的引物/探针浓度为0.4μmol·L^(-1)/0.2μmol·L^(-1),Lectin的引物/探针浓度为0.4μmol·L^(-1)/0.2μmol·L^(-1);中黄6106/Lectin二重实时荧光PCR反应体系中,中黄6106转化体的引物/探针浓度为0.4μmol·L^(-1)/0.2μmol·L^(-1),Lectin的引物/探针浓度为0.5μmol·L^(-1)/0.25μmol·L^(-1)。3种方法特异性良好,检出限均达10个拷贝。利用100粒模拟单粒种子样本,快速研磨,模板稀释5倍后,采用二重实时荧光PCR快速扩增,成功地检测了SHZD3201、DBN9004和中黄6106种子转化体纯度。【结论】成功建立了耐除草剂大豆SHZD3201/Lectin、DBN9004/Lectin和中黄6106/Lectin的二重实时荧光PCR方法,结合一步提取液的DNA快速提取方法,实现了大豆转基因种子转化体纯度精准快速检测。 展开更多
关键词 耐除草剂大豆 种子 二重实时荧光PCR 转化体纯度
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检测PRRSV及鉴别HP-PRRSV毒株的二重PCR与二重TaqMan荧光定量PCR方法 被引量：1
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作者 陈旭 汤德元 +6 位作者 曾智勇 王彬 袁盛林 廖正波 何松 周飘 毛茵茗 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期316-324,共9页
为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)早期检测及快速鉴别高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)变异株,利用HP-PRRSV Nsp2蛋白第481位和532~560位氨基酸缺失的特性设计2对引物,优化反应条件建立二重PCR检测方法,同时针对PRRSV M... 为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)早期检测及快速鉴别高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)变异株,利用HP-PRRSV Nsp2蛋白第481位和532~560位氨基酸缺失的特性设计2对引物,优化反应条件建立二重PCR检测方法,同时针对PRRSV M基因和HP-PRRSV Nsp2基因设计特异性引物和探针,优化反应条件建立二重TaqMan荧光定量PCR方法,并评估这2种方法的敏感性、特异性、重复性。敏感性试验结果显示:二重PCR方法的检测下限分别为0.058 ng/μL(PRRSV)和4.7 ng/μL(HP-PRRSV);二重TaqMan荧光PCR方法的检测下限分别为10 copies/μL(PRRSV)和100 copies/μL(HP-PRRSV)。这2种方法与其他猪病病原均不发生非特异性反应,重复性试验结果良好。经131份临床样品检测,可得到PRRSV的阳性率约12.2%(16/131)、HP-PRRSV的阳性率约17.6%(23/131)、二者的混合感染率约8.4%(11/131)。证实,本研究成功建立了二重PCR和二重TaqMan荧光定量PCR检测方法,可为临床上猪繁殖与呼吸综合征的防控提供技术支持。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重PCR 二重TaqMan荧光定量PCR 鉴别检测
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猫冠状病毒和猫细小病毒双重荧光定量PCR方法的建立 被引量：1
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作者 郭存杰 王蕾 +3 位作者 毕振威 钱晶 张传美 谭业平 《中国动物检疫》 CAS 2024年第4期91-95,共5页
为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏... 为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏感性和重复性试验,探讨所建方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FCoV和FPV,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫轮状病毒、支原体、衣原体、波氏杆菌、犬腺病毒和犬副流感病毒等病原核酸无交叉反应,对FCoV和FPV检测限均为1 copies/μL;FCoV和FPV阳性参考质粒组间和组内重复试验变异系数均小于3%;对35份临床样本进行检测,发现建立的双重荧光定量PCR方法阳性检出率比普通PCR方法高。结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有灵敏、特异和稳定等优点,可用于临床FCoV和FPV感染的早期鉴别诊断。 展开更多
关键词 猫冠状病毒 猫细小病毒 双重荧光定量PCR
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肺炎克雷伯菌与链球菌双重PCR检测方法的构建 被引量：1
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作者 王一霖 王燕 +4 位作者 梁纤纤 郭明强 樊晓慧 夏俊 苏战强 《草食家畜》 2024年第3期51-59,共9页
【目的】旨在建立一种可同时检测肺炎克雷伯菌和链球菌的双重PCR检测方法。【方法】选取肺炎克雷伯菌KP-Khe基因和链球菌EF-Tu基因保守片段,分别合成2对特异性引物,优化双重PCR反应体系,摸索其特异性、最佳退火温度、引物浓度和细菌核... 【目的】旨在建立一种可同时检测肺炎克雷伯菌和链球菌的双重PCR检测方法。【方法】选取肺炎克雷伯菌KP-Khe基因和链球菌EF-Tu基因保守片段,分别合成2对特异性引物,优化双重PCR反应体系,摸索其特异性、最佳退火温度、引物浓度和细菌核酸浓度,并通过该方法对临床样品进行检测验证。【结果】该双重PCR检测方法可有效扩增出肺炎克雷伯菌和链球菌的489bp和197bp的特异性片段,最适退火温度为58℃、最适引物浓度为12ng/µL、最适模板浓度为3ng/µL。将该方法应用于临床对15份样品进行检测,其中2份样品检测出肺炎克雷伯菌呈阳性,1份样品检测出链球菌呈阳性,与分离鉴定结果一致。【结论】该研究建立的双重PCR技术,可为临床诊断肺炎克雷伯菌、链球菌及混合感染提供了一种便捷高效的检测方法,具有一定的应用价值。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯菌 链球菌 双重PCR
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非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用
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作者 刘影 闫若潜 +10 位作者 王东方 杨海波 赵美雪 宋丹 赵雪丽 谢彩华 王淑娟 马震原 柴茂 王翠 刘梅芬 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期118-130,共13页
建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应... 建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重FQ-PCR
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双重PCR区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌
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作者 潘斐 敖莉丝 +1 位作者 潘汝谦 纪春艳 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期913-919,共7页
黑腐病和基腐病是威胁花生生产的重要病害。两种病害在田间发病症状十分相似,凭症状区分诊断困难。本研究利用calmodulin(cmdA)基因序列设计特异性引物,通过优化反应体系和反应条件,针对花生黑腐病菌和基腐病菌进行了双重PCR的区分检测... 黑腐病和基腐病是威胁花生生产的重要病害。两种病害在田间发病症状十分相似,凭症状区分诊断困难。本研究利用calmodulin(cmdA)基因序列设计特异性引物,通过优化反应体系和反应条件,针对花生黑腐病菌和基腐病菌进行了双重PCR的区分检测。结果表明,在反应体系浓度为1.8×、引物浓度为0.2μmol/L、退火温度为62℃、反应循环数为37的条件下,可特异性地分别扩增出两条目的条带(274 bp和409 bp),检测灵敏限度为100 pg/μL。成功建立了可准确、快速区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR,可为准确诊断和及时防控花生两种易混淆的病害提供科学的参考。 展开更多
关键词 花生 黑腐病菌 基腐病菌 双重PCR
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miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用 被引量：1
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作者 胡舒啸 陈惠香 +5 位作者 胡胜 赵一霞 季安全 李洋 廉洁 孙启凡 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2024年第3期706-715,共10页
目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于... 目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。 展开更多
关键词 法医遗传学 体液鉴别 双重实时荧光定量PCR MICRORNA
原文传递
安顺地区结核分枝杆菌基因分型及耐药性分析
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作者 刘洪飞 徐彬 +4 位作者 佟玉峰 孙广 李小多 张彪 蒋红梅 《贵州医科大学学报》 CAS 2024年第6期852-858,872,共8页
目的研究贵州省安顺地区结核分枝杆菌(MTB)主要基因分型及耐药性。方法采用RD105基因缺失法和双重PCR法对安顺地区152株MTB临床分离株进行基因分型、药物敏感试验分析耐药性,采用基因测序技术对北京型MTB利福平耐药基因RNA聚合酶β亚基(... 目的研究贵州省安顺地区结核分枝杆菌(MTB)主要基因分型及耐药性。方法采用RD105基因缺失法和双重PCR法对安顺地区152株MTB临床分离株进行基因分型、药物敏感试验分析耐药性,采用基因测序技术对北京型MTB利福平耐药基因RNA聚合酶β亚基(rpoB)进行测序。结果152株MTB中,122株(80.26%)为北京型、30株(19.74%)为非北京型;108株MTB对抗结核药物敏感,44株对16种抗结核药物耐药,总耐药率为28.95%;44株MTB耐药菌株中31例对利福平耐药,占70.45%,北京型MTB对利福平耐药率显著高于非北京型(χ^(2)=6.896,P=0.009),非利福平耐药结核菌株共13株、占耐药结核菌株的29.55%;北京型MTB利福平耐药rpoB基因测序结果表明,相关位点突变共15株,其中最显著的突变位点是rpoB450、为Ser450Leu,共7株(7/15,46.67%)。结论贵州省安顺地区MTB主要为北京型,主要对利福平耐药,耐药基因rpoB的突变位点为Ser450Leu。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 基因分型 耐药性 基因测序 RD105 双重PCR
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