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非洲猪瘟病毒B646L/I177L基因双重荧光PCR鉴别检测方法的建立和初步应用
1
作者 赵凯 胡永新 +6 位作者 郑东霞 邹艳丽 刘珊 蔡其刚 李金明 吴晓东 王志亮 《中国动物检疫》 2026年第1期101-109,共9页
为监测越南上市使用的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)I177L基因缺失疫苗株传入我国的情况,聚焦国内流行的ASFV毒株类型,基于I177L基因设计特异性引物和探针,同时结合国家标准推荐的B646L基因荧光PCR检测方法,优化并建立... 为监测越南上市使用的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)I177L基因缺失疫苗株传入我国的情况,聚焦国内流行的ASFV毒株类型,基于I177L基因设计特异性引物和探针,同时结合国家标准推荐的B646L基因荧光PCR检测方法,优化并建立了一种能够区分我国流行的野毒株与I177L基因人工缺失毒株的双重荧光PCR检测方法。进一步,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。结果显示:此方法对两种基因的最低检测限均为5 copies/μL,具有较高敏感性;与其他猪病病原无交叉反应,显示出强特异性;组内与组间重复性试验的变异系数均小于5%,重复性良好;可有效检出我国不同类型的ASFV流行株,具有良好的通用性;对100份临床样品核酸进行检测,本方法检测结果与国标方法一致。结果表明,本研究建立的ASFV(B646L/I177L)双重荧光PCR检测方法可用于I177L基因缺失株的精准检测,为临床上ASFV野毒株与I177L基因缺失株的鉴别检测提供了技术支撑。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 双重荧光PCR B646L基因 I177L基因
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布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
2
作者 彭海涛 高阳 +6 位作者 刘雨欣 顾德媛 张东 张如 许会会 陈思 杨艳玲 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第1期369-377,共9页
旨在建立一种经济高效的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法,用于布鲁菌感染的动物及动物产品的快速检测并区分牛种布鲁菌和其他种布鲁菌感染的动物,为临床常的疫苗和研发的新型疫苗提供科学有效的鉴别诊断方法。本研究根据GenBan... 旨在建立一种经济高效的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法,用于布鲁菌感染的动物及动物产品的快速检测并区分牛种布鲁菌和其他种布鲁菌感染的动物,为临床常的疫苗和研发的新型疫苗提供科学有效的鉴别诊断方法。本研究根据GenBank公布的galU和Omp31的序列设计检测引物和探针,构建重组质粒,对方法特异性、灵敏性及重复性评价,检测实验室制备和临床动物布病血清及组织样品。结果表明,成功建立了布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,该方法最低检测限为1.93×10^(0) copies·μL^(-1),与其他革兰阴性菌无交叉反应,批内及批间变异系数均小于2%。利用本研究建立的方法检测实验室制备样品和临床采集样品共156份,与BCSP31-PCR相比,两者阳性符合率为69.75%;与PCR和虎红凝集试验相比,灵敏性更高,双重TaqMan荧光定量PCR的敏感性为100%,PCR的敏感性为69.75%,虎红凝集试验的敏感性为58.65%。本研究建立的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,为布鲁菌临床鉴别检测、流行病学调查及净化提供技术支持。 展开更多
关键词 布鲁菌 双重Taq Man荧光定量PCR 检测方法 鉴别诊断
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转基因大豆DBN8205转化体特异性定量PCR方法的研发和验证
3
作者 吴琼 谢香庭 +2 位作者 王磊 牟勇 李进伟 《中国农业科学》 北大核心 2026年第1期29-40,共12页
【目的】转基因大豆DBN8205转化体已获批转基因生物安全证书(生产应用),转育品种即将产业化应用,建立DBN8205转化体特异性定性定量检测方法,为转基因生物安全监管和定量标识制度的实施提供依据。【方法】根据DBN8205转化体的分子特征序... 【目的】转基因大豆DBN8205转化体已获批转基因生物安全证书(生产应用),转育品种即将产业化应用,建立DBN8205转化体特异性定性定量检测方法,为转基因生物安全监管和定量标识制度的实施提供依据。【方法】根据DBN8205转化体的分子特征序列,设计转化体特异性引物和探针。通过比较多个引物探针组合的扩增曲线及Ct值,筛选出最佳引物探针组合。分别在实时荧光定量PCR和微滴数字PCR平台上考察DBN8205转化体特异性PCR方法的特异性、检测限、定量限、动力学范围和定量准确性等技术参数。制定标准方法联合验证方案,邀请多家实验室对实时荧光定量PCR方法进行联合验证,对联合验证数据进行统计分析,考察方法的重复性和重现性。【结果】筛选出最佳引物探针组合DBN8205-QF/QR/QP,扩增产物长120 bp,仅特异性识别DBN8205转化体成分,具有良好的扩增特异性。在实时荧光定量PCR平台上,检测限为10 copies,定量限为40 copies,标准曲线的各项技术参数符合标准要求,在40—8.2×10^(4)copies动力学范围内,模板拷贝数和Ct值间具有良好的线性关系,能够对含量低至0.1%的样品进行准确定量。8家实验室联合验证结果表明,DBN8205转化体特异性实时荧光定量PCR方法具有良好的重复性和重现性。在微滴数字PCR平台上,检测限和定量限与实时荧光定量PCR方法相同,分别为10和40 copies,动力学范围为40—8.0×10^(4)copies,能够对低至0.1%的样品进行准确定量,定量结果比qPCR具有更高的精密度。t检验表明,实时荧光定量PCR和二重微滴数字PCR的定量结果具有良好的一致性。【结论】建立的DBN8205转化体特异性定量PCR方法能够对DBN8205转化体进行身份鉴定,可在实时荧光定量PCR和微滴数字PCR平台上对产品中的DBN8205转化体成分进行精准定量分析。 展开更多
关键词 转基因大豆 DBN8205转化体 实时荧光定量PCR 二重微滴数字PCR 定量
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犬冠状病毒与犬细小病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1
4
作者 傅宇飞 李传峰 +8 位作者 田传龙 李泽贤 麦嘉迅 程松 刘禹含 孟春春 朱杰 程国锋 刘光清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期75-83,共9页
根据GenBank中犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)已有基因序列设计其对应引物,通过对反应体系和扩增程序的优化,建立了CCoV和CPV双重荧光定量PCR检测方法,评估了其敏感性、特异性和重复性。结果显示,该方法最佳退火温度为60℃,引物浓... 根据GenBank中犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)已有基因序列设计其对应引物,通过对反应体系和扩增程序的优化,建立了CCoV和CPV双重荧光定量PCR检测方法,评估了其敏感性、特异性和重复性。结果显示,该方法最佳退火温度为60℃,引物浓度分别为CCoV 1.0μmol/L和CPV 0.1μmol/L,检测下限均为10~2 copies/μL。批内与批间的变异系数均小于2%。该方法用于检测犬腺病毒(CAV)、犬圆环病毒(CaCV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬流感病毒(CIV)、犬副流感病毒(CPIV)均无特异性扩增。对68份临床样品的检测,结果表明CCoV阳性率为22.0%,CPV阳性率为61.8%,与普通PCR检测结果相比,本研究建立的方法更加灵敏。本研究建立的CCoV和CPV检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,可用于对CCoV和CPV的鉴别诊断。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 犬细小病毒 双重荧光定量PCR 鉴别诊断
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鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的双重PCR检测方法建立及其在海南文昌鸡主养区感染情况调查
5
作者 薛琛璐 张艳 +5 位作者 刘海隆 陈素贞 董亚童 晁哲 魏立民 刘圈炜 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第8期100-107,共8页
皆在建立快速精准检测鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的双重PCR方法,并利用该方法检测分析海南文昌鸡主要养殖地区MG和MS感染现状及流行特点。针对MG mgC2基因和MS vlhA基因的保守序列,分别设计引物并合成,通过对反应条件及程序的... 皆在建立快速精准检测鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的双重PCR方法,并利用该方法检测分析海南文昌鸡主要养殖地区MG和MS感染现状及流行特点。针对MG mgC2基因和MS vlhA基因的保守序列,分别设计引物并合成,通过对反应条件及程序的优化,建立MG、MS双重PCR检测方法;对所建方法进行灵敏性、特异性及重复性验证,同时与国家农业行业标准进行比较,验证其准确性。应用所建方法对海南文昌鸡主要养殖地区采集的1510份未免疫MG、MS疫苗的文昌鸡咽喉拭子进行病原学检测。结果显示:建立的双重PCR检测方法对MG、MS的最低检测限度均达到2.1×10^(2)拷贝/μL;与新城疫、马立克氏病、传染性法氏囊病和传染性喉气管炎等4种鸡常见病的病原不发生交叉反应;与国家农业行业标准发布的MG、MS单一PCR方法检测结果的符合率分别达到100%与98.83%;病原学检测结果显示,海南文昌鸡主要养殖地区MG的感染率为11.79%(95%CI:10.16%~13.42%),MS的感染率为25.96%(95%CI:23.75%~28.17%),MG和MS的混合感染率为7.42%(95%CI:6.10%~8.74%);MG和MS在春季高发,以中型规模养殖场和成年鸡感染情况最为严重,商品代肉鸡的阳性率最高。结果表明,本研究建立的MG、MS双重PCR检测方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性和准确性,可应用于临床样本的检测;当前海南省文昌鸡主要养殖地区存在MG、MS感染,应加强防控。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 双重PCR 病原学 文昌鸡
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犬巴贝斯虫和犬埃立克体双重纳米PCR方法的建立及初步应用
6
作者 梁谦学 朱正 +4 位作者 王博永 李连燕 吴文德 李恭贺 郑喜邦 《动物医学进展》 北大核心 2025年第4期90-95,共6页
旨在建立一种同时检测犬巴贝斯虫(Babesia canis)和犬埃立克体(Ehrlichia canis)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法。以疑似犬巴贝斯虫病和埃立克体病血样DNA为模板,用常规双重PCR和双重纳米PCR检测犬巴贝斯虫18S rRNA和犬埃立克体16S rRNA... 旨在建立一种同时检测犬巴贝斯虫(Babesia canis)和犬埃立克体(Ehrlichia canis)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法。以疑似犬巴贝斯虫病和埃立克体病血样DNA为模板,用常规双重PCR和双重纳米PCR检测犬巴贝斯虫18S rRNA和犬埃立克体16S rRNA,并对PCR的退火温度和引物浓度等参数进行了优化。结果显示,双重纳米PCR方法具有良好特异性和灵敏性,与其他4种犬常见病原体无交叉反应,对犬巴贝斯虫和犬埃立克体的最低核酸检测量分别为2.07×10^(3)和1.92×10^(3)copies/μL,其灵敏性比常规PCR高100倍。为了解南宁地区犬巴贝斯虫和犬埃立克体的流行情况,采用该方法对来自南宁市5家宠物医院的152份血清样品进行了检测。结果显示,犬巴贝斯虫和犬埃立克体感染率分别为2.63%和9.87%,混合感染率为1.32%。该双重纳米PCR方法为犬巴贝斯虫和埃立克体病早期快速诊断提供了新方法。 展开更多
关键词 双重纳米PCR 犬巴贝斯虫 犬埃立克体 病原检测
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基于布鲁氏菌S2疫苗株缺失基因双重PCR检测方法的建立
7
作者 张昊 刘浩 +4 位作者 崔海霞 高娃 张丽丽 吕志远 王文龙 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第11期77-83,共7页
为了解决布鲁氏菌疫苗株与野毒株鉴别困难的技术难题,试验采用全基因组序列比对分析的方法,对布鲁氏菌S2疫苗株与布鲁氏菌1330野毒株进行比对,筛选一段S2疫苗株缺失基因,通过结合布鲁氏菌通用抗原BP26基因设计2对特异性引物,建立了一种... 为了解决布鲁氏菌疫苗株与野毒株鉴别困难的技术难题,试验采用全基因组序列比对分析的方法,对布鲁氏菌S2疫苗株与布鲁氏菌1330野毒株进行比对,筛选一段S2疫苗株缺失基因,通过结合布鲁氏菌通用抗原BP26基因设计2对特异性引物,建立了一种能够区分S2疫苗株与其他菌株的双重PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性试验,同时应用该方法对84份临床样品进行检测,计算符合率。结果表明:在试验建立的双重PCR检测方法中,S2疫苗株因缺失靶序列仅显示单一BP26条带,而野毒株及其他疫苗株(Rev.1、A19等)呈现双条带(BP26基因条带与S2疫苗株缺失片段条带)。该检测方法最佳引物浓度为6μmol/L,退火温度为54℃,退火时间为30 s,延伸时间为45 s,共35次循环,最低检测限为7.536×10^(-5)ng/μL,与大肠杆菌、链球菌无交叉反应,具有良好的重复性。用本试验建立的双重PCR检测方法检测临床样品84份,布鲁氏菌阳性率为61.9%(52/84),其中S2疫苗株阳性率为40.5%(34/84),与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合率为96.4%(81/84)。说明本试验建立的鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与其他菌株的双重PCR检测方法兼具高特异性和敏感性,可用于临床样品布鲁氏菌的检测。 展开更多
关键词 布鲁氏菌病 S2疫苗株 野毒株 双重PCR 基因缺失
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转基因玉米MON87411双重微滴式数字PCR定量检测方法的建立 被引量：2
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作者 闫邦奇 水克娟 +4 位作者 黎财慧 徐淼锋 林伟 廖力 张卫东 《现代食品科技》 北大核心 2025年第3期378-386,共9页
基于微滴式数字PCR技术,建立了转基因玉米MON87411双重微滴式数字PCR定量检测方法。试验结果显示,该方法仅有玉米MON87411能特异性检出,其他样品均无扩增反应。扩增稳定性试验,3次平行扩增内外源基因拷贝数RSD分别为0.56%和3.93%,均符合... 基于微滴式数字PCR技术,建立了转基因玉米MON87411双重微滴式数字PCR定量检测方法。试验结果显示,该方法仅有玉米MON87411能特异性检出,其他样品均无扩增反应。扩增稳定性试验,3次平行扩增内外源基因拷贝数RSD分别为0.56%和3.93%,均符合RSD小于25%的要求。线性相关性曲线显示,当模板DNA质量浓度在50~0.08 ng/μL之间时,目标序列拷贝数与模板DNA浓度具有良好的线性关系,相关系数R~2均大于0.99,品系特异性序列定量线性范围在26.6~17 086.6拷贝之间,定量限(LOQ)为1.34拷贝/μL。准确度试验,五个不同质量浓度模板DNA平均拷贝数含量分别为52.14%、63.09%、66.08%、60.50%、52.16%,均在理论拷贝数含量范围内。综上所述,该研究建立的双重微滴式数字PCR定量检测方法特异性强,稳定性好,定量范围广,灵敏度和准确度高,可以用于转基因玉米MON87411的定量检测。 展开更多
关键词 双重微滴式数字PCR 转基因玉米 MON87411 定量检测
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人星状病毒和人札幌病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
9
作者 林鹏 吴毓薇 +6 位作者 赵昕宇 蒋富凤 万强 薛亮 徐环 蔡芷荷 吴清平 《微生物学通报》 北大核心 2025年第4期1810-1829,共20页
【背景】人星状病毒(human Astrovirus,HAstV)和人札幌病毒(human Sapovirus,HuSaV)是引起人类急性胃肠炎的重要病原体,尤其对婴幼儿、老年人和免疫力低下等人群造成严重的威胁。目前尚无疫苗和特异性手段防控病毒的感染与传播,因此加... 【背景】人星状病毒(human Astrovirus,HAstV)和人札幌病毒(human Sapovirus,HuSaV)是引起人类急性胃肠炎的重要病原体,尤其对婴幼儿、老年人和免疫力低下等人群造成严重的威胁。目前尚无疫苗和特异性手段防控病毒的感染与传播,因此加强检测对防控病毒的传播具有重要的意义。【目的】建立能同时检测HAstV和HuSaV的双重荧光定量RT-PCR方法,为HAstV和HuSaV的快速检测和流行病学调查提供技术支持。【方法】针对HAstV和HuSaV保守区域基因序列,设计特异性检测引物和探针并优化反应体系,建立HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法,并分析其特异性、敏感性和重复性。【结果】HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法针对HAstV和HuSaV最低检测线分别为15 copies/μL和2.1 copies/μL;与其他常见的食源性病毒、致病菌和乳酸菌无交叉反应;批内和批间重复性试验变异系数均小于3.5%。采用人工模拟不同浓度的病毒污染牡蛎样品,结果显示HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法能检测出所有受污染的牡蛎样品,与阳性对照组检测结果差异不显著(P>0.05);利用所建立的HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法检测不同食品样品的HAstV和HuSaV,其阳性率分别为10.83%和0%。【结论】本研究建立的HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,适用于食品样品中HAstV和HuSaV的快速检测及大规模流行病学调查。 展开更多
关键词 人星状病毒 人札幌病毒 双重荧光定量RT-PCR检测方法
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牛病毒性腹泻病毒和牛肠道病毒二重PCR检测方法的建立及病原学分析
10
作者 闫志浩 杨柳菲 +4 位作者 曹馨月 杨钦 李世玲 杨梦晗 陈红英 《养殖与饲料》 2025年第10期52-56,共5页
[目的]为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛肠道病毒(BEV)的早期诊断及防控提供技术支持。[方法]在靶向BVDV和BEV 5’-UTR保守区,各设计1对特异性引物,建立1种能同时检测BVDV和BEV的二重PCR方法,运用该方法对2024-2025年采自河南、四川以及河... [目的]为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛肠道病毒(BEV)的早期诊断及防控提供技术支持。[方法]在靶向BVDV和BEV 5’-UTR保守区,各设计1对特异性引物,建立1种能同时检测BVDV和BEV的二重PCR方法,运用该方法对2024-2025年采自河南、四川以及河北等地牛场患腹泻牛的50份粪便样品进行检测并进行遗传进化分析,评估该方法的特异性和灵敏度。[结果]该方法能同时扩增BVDV的223 bp和BEV的96 bp,而对其他的常见牛病原核酸扩增均为阴性。BVDV和BEV的最低检测值分别为815 copies/μL和783 copies/μL。在50份粪便样品中,BVDV和BEV的检出率分别为68%、42%,二者混合感染率为24%。测序获得12株BVDV和12株BEV的5′-UTR序列。遗传分析显示,获得的12株BVDV均属于BVDV-1m亚型。12株BEV中,有10株属于BEV-F种,余下2株属于BEV-E种。[结论]成功建立1种BVDV和BEV二重PCR检测方法,且我国部分省份牛场中主要流行的是BVDV-1m亚型和BEF-F种。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 牛肠道病毒 二重PCR 遗传进化
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双重TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应快速鉴别肉质金腰和长梗金腰
11
作者 米雪 解盈盈 +6 位作者 达娃卓玛 孙仟 颜琪 崔伟亮 郑健 汪冰 林永强 《中国药学杂志》 北大核心 2025年第18期1908-1915,共8页
目的建立肉质金腰及其近缘物种长梗金腰的双重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴别方法。方法以ITS2序列为基础,根据肉质金腰及长梗金腰序列特点,寻找单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,... 目的建立肉质金腰及其近缘物种长梗金腰的双重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴别方法。方法以ITS2序列为基础,根据肉质金腰及长梗金腰序列特点,寻找单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,分别设计肉质金腰和长梗金腰的特异性引物及探针,通过对引物探针浓度、退火温度、循环次数等关键参数优化,建立双重实时荧光PCR反应条件;此外还对该方法的精密度、重复性、特异性、灵敏度等指标进行了评估。结果所建立的双重TaqMan探针实时荧光PCR方法的重复性良好。当掺入比例低至1%时,该方法均有典型荧光扩增曲线,进一步表明该方法灵敏度较高,特异性较强。结论本研究所建立的双重TaqMan探针实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高,可同时检测肉质金腰及近缘物种长梗金腰,为肉质金腰及长梗金腰的鉴别提供一种专属性更强的技术手段参考。 展开更多
关键词 肉质金腰 长梗金腰 双重实时荧光聚合酶链式反应 TAQMAN探针 藏药
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蛙病毒3型类和桑蒂库帕蛙病毒类双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用
12
作者 邓艳 柏建山 +5 位作者 徐浩 季新成 黄燕琼 何淑华 曾伟伟 蒋茗 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第1期48-53,79,共7页
为建立一种可快速鉴别检测蛙病毒3型(FV3)类和桑蒂库帕蛙病毒(SCRV)类的双重荧光定量PCR(qPCR)方法,本研究根据FV3类和SCRV类的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列,设计一对特异性引物和两种不同荧光标记的探针,采用特异性引物扩增虎纹蛙病毒(T... 为建立一种可快速鉴别检测蛙病毒3型(FV3)类和桑蒂库帕蛙病毒(SCRV)类的双重荧光定量PCR(qPCR)方法,本研究根据FV3类和SCRV类的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列,设计一对特异性引物和两种不同荧光标记的探针,采用特异性引物扩增虎纹蛙病毒(TFV)和大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)的目的基因,构建重组质粒标准品pMD19-T-TFV和pMD19-T-LMBV。采用矩阵法优化各反应条件后,初步建立了检测这两类蛙病毒的双重qPCR方法。标准曲线结果显示两个重组质粒标准品混合物与各自的Ct值均呈良好的线性关系。采用本研究建立的方法分别检测TFV、LMBV、伯勒虹彩病毒(BCV)、蛙病毒3型、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、锦鲤疱疹病毒、罗非鱼湖病毒、病毒性神经坏死病毒、斑点叉尾鮰病毒、鲤浮肿病毒、传染性造血器官坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、呼肠孤病毒Ⅱ型、疱疹病毒Ⅱ型,评估该方法的特异;以100~108稀释的重组质粒标准混合物为模板采用建立的双重qPCR方法检测,评估该方法的敏感性;以10^(2)~10^(8)稀释的重组质粒标准混合物为模板采用该双重qPCR方法分别进行组内和组间的重复性试验。结果显示,该方法仅能扩增出FV3类的TFV、BIV、FV3及EHNV和SCRV类的LMBV,其他病毒均无扩增曲线;对pMD19-T-TFV和pMD19-T-LMBV的检测限分别为1拷贝/µL和10拷贝/µL;组内变异系数和组间变异系数均小于2%。利用建立的双重qPCR方法和WOAH推荐的常规PCR方法分别对298份临床样品分别进行检测,结果显示,双重qPCR方法检出21份SCRV类,2份FV3类,普通PCR方法检出15份SCRV类,2份FV3类,双重PCR方法与常规PCR方法对FV3类和SCRV类的检测结果的阳性符合率均达100%。本研究建立的双重qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,对于多种蛙病毒属成员的鉴别检测和早期预警具有重要意义。 展开更多
关键词 蛙病毒 双重荧光定量PCR TAQMAN探针
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圆圈病毒禽源1型和圆圈病毒人源1型二重荧光定量PCR检测方法的建立
13
作者 余丹 谢芝勋 +5 位作者 赵俊柯 张艳芳 谢志勤 谢丽基 尹文巧 喻华英 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第1期59-65,73,共8页
圆圈病毒禽源1型(GyVg1)和圆圈病毒人源1型(GyH1)是两种新发现的可引起鸡腺胃炎相关症状的环形病毒,目前在全球多个地区均有检测报道。本研究旨在建立一种能快速同时鉴别GyVg1和GyH1的二重荧光定量PCR方法。使用GenBank中现有的GyVg1和G... 圆圈病毒禽源1型(GyVg1)和圆圈病毒人源1型(GyH1)是两种新发现的可引起鸡腺胃炎相关症状的环形病毒,目前在全球多个地区均有检测报道。本研究旨在建立一种能快速同时鉴别GyVg1和GyH1的二重荧光定量PCR方法。使用GenBank中现有的GyVg1和GyH1基因组序列,基于其保守区分别设计相应的特异性引物和探针,经过优化反应条件,建立了GyVg1和GyH1的二重荧光定量PCR检测方法。应用该检测方法对2023年在广西南宁8个地区采集的256份临床样本进行检测,与常规PCR检测和测序结果进行分析比较,进一步验证该方法的有效性。结果显示,所建立的二重荧光定量PCR方法可在1 h内鉴定出GyVg1和GyH1,两套引物探针均可有效扩增,且与其他病原体无交叉反应;检测下限为7.5拷贝/μL,标准曲线相关系数>0.99,批内和批间变异系数<0.45%。临床样品检测结果显示,当模板量≥100.0拷贝/μL时,二重荧光定量PCR测定与常规PCR测定之间的一致性分别为94.3%(GyVg1)和100%(GyH1)。综上,所建立的二重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于GyVg1和GyH1的快速鉴别检测。 展开更多
关键词 圆圈病毒禽源1型 圆圈病毒人源1型 二重荧光定量PCR
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赤羽病病毒和施马伦贝格病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立和应用
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作者 邓俊花 陈冬杰 +3 位作者 魏方 王晶晶 吕继洲 吴绍强 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第4期124-130,共7页
为建立一种能够同时检测赤羽病病毒(AKAV)和施马伦贝格病毒(SBV)的方法,本研究以AKAV和SBV的S基因为靶基因,设计其通用引物和特异性探针,通过优化反应条件,建立了AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行检... 为建立一种能够同时检测赤羽病病毒(AKAV)和施马伦贝格病毒(SBV)的方法,本研究以AKAV和SBV的S基因为靶基因,设计其通用引物和特异性探针,通过优化反应条件,建立了AKAV和SBV双重荧光RT-PCR检测方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行检验。同时,评估其临床应用效果。结果显示:该方法AKAV以及SBV最低检测线均可达1.5 copies/μL;与牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒均无交叉反应,具有良好的特异性;50份临床样品检测结果与AKAV、SBV行业标准推荐方法符合率为100%。本研究建立的双重荧光RT-PCR方法,适用于AKAV和SBV的临床检测,为疫情防控提供了新的筛查手段。 展开更多
关键词 赤羽病病毒 施马伦贝格病毒 双重荧光RT-PCR 应用
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双重PCR快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌 被引量：24
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作者 黎炯 叶星 +4 位作者 卢迈新 邓国成 田园园 江小燕 黎坚平 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期449-452,共4页
根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16SrRNA基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法.用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌,可分别获得474、296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌... 根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16SrRNA基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法.用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌,可分别获得474、296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等其他常见鱼病原菌无特异性片段.该方法可实现对无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,具较高的灵敏度,可检测到基因组含量分别为3.2×10-3ng/μL的无乳链球菌和3.0×10-2ng/μL的海豚链球菌.对采集自广东与海南两省养殖罗非鱼病鱼的11份病原样品进行检测,均可获得474bp片段,测序与BLAST分析结果表明,扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列,可从分子水平上确定这些样品为无乳链球菌,与生化鉴定结果一致. 展开更多
关键词 双重PCR 无乳链球菌 海豚链球菌 cfb基因 16SrRNA
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双重PCR快速鉴别羊痘病毒和羊口疮病毒 被引量：20
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作者 颜新敏 张强 +3 位作者 吴国华 李健 朱海霞 朱彩珠 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期945-948,共4页
根据羊痘病毒的P32基因和羊口疮病毒H2L基因序列设计合成两对引物,建立了一种快速鉴别诊断羊痘病毒和羊口疮病毒的双重PCR方法。该方法可对羊痘病毒和羊口疮病毒分别扩增出969bp和507bp的特异性片段,对痘苗病毒等其它病原和健康羊皮肤... 根据羊痘病毒的P32基因和羊口疮病毒H2L基因序列设计合成两对引物,建立了一种快速鉴别诊断羊痘病毒和羊口疮病毒的双重PCR方法。该方法可对羊痘病毒和羊口疮病毒分别扩增出969bp和507bp的特异性片段,对痘苗病毒等其它病原和健康羊皮肤组织不能扩增出任何片段。敏感性试验表明该方法可分别扩增出101.66TCID50山羊痘病毒和102.33TCID50羊口疮病毒。对从甘肃境内采集的11份临床病料进行检测,其中8份可扩增出969bp的羊痘病毒特异性片段,3份可扩增出507bp的羊口疮病毒特异性片段,与病毒分离鉴定结果一致。 展开更多
关键词 双重PCR 鉴别诊断 羊痘病毒 羊口疮病毒
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二重PCR检测猪、鸡源致病性大肠杆菌、沙门氏菌磺胺类耐药基因(Sul1、Sul2、Sul3)的研究 被引量：21
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作者 羊云飞 王红宁 +4 位作者 谭雪梅 张安云 杨鑫 夏青青 曾博 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1088-1092,共5页
利用二重PCR对临床分离的猪、鸡源致病性大肠杆菌103株和沙门氏菌33株的3个磺胺类药主要耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了检测。结果表明,在19株耐SD的沙门氏菌中有17株检测出Sul1或Sul2基因,检出率为89.47%,与药敏试验的结果相比,符合率... 利用二重PCR对临床分离的猪、鸡源致病性大肠杆菌103株和沙门氏菌33株的3个磺胺类药主要耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了检测。结果表明,在19株耐SD的沙门氏菌中有17株检测出Sul1或Sul2基因,检出率为89.47%,与药敏试验的结果相比,符合率为89.47%;在56株耐SD的大肠杆菌中有53株检出耐药基因,与药敏试验的符合率为94.64%。二重PCR方法与常规PCR的结果符合率为98.5%,具有很高的一致性;与药敏试验也有很好的符合率,具有较高的特异性。整个试验过程只需7 h,比常规PCR节约7 h,检测速度有了较大的提高。 展开更多
关键词 二重PCR 大肠杆菌 沙门氏菌 磺胺类耐药基因
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双重PCR检测马铃薯晚疫病菌和青枯病菌方法的建立及应用 被引量：25
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作者 陈庆河 李本金 +3 位作者 兰成忠 赵健 邱荣洲 翁启勇 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期578-583,共6页
利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增马铃薯晚疫病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列比较,设计了1对马铃薯晚疫病菌的特异引物INF1/INF2,并对15种不同真菌、细菌和7种疫霉属和腐霉属卵菌基因组DNA进行PCR扩增,结果只有不同来源的马铃薯... 利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增马铃薯晚疫病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列比较,设计了1对马铃薯晚疫病菌的特异引物INF1/INF2,并对15种不同真菌、细菌和7种疫霉属和腐霉属卵菌基因组DNA进行PCR扩增,结果只有不同来源的马铃薯晚疫病菌株可获得324 bp的特异带。将引物INF1/INF2与卵菌通用引物进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达30 fg。运用设计的引物与马铃薯青枯病菌特异引物结合建立了双重PCR体系,能从马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌总基因组DNA以及人工接种和自然发病的马铃薯植株中分别或同时扩增到324 bp和281 bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌的快速可靠检测。 展开更多
关键词 晚疫病菌 青枯病菌 双重PCR 分子检测
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溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用 被引量：25
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作者 冯旭飞 刀筱芳 +3 位作者 李定菲 汤承 王远微 杨发龙 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期624-629,共6页
本研究旨在建立溶血性曼氏杆菌与多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,从而为临床上同时检测这两种病原的感染提供一种更加方便、快捷、准确的工具。根据溶血性曼氏杆菌lkt基因和多杀性巴氏杆菌sp6基因分别设计引物,优化条件后进行特异性... 本研究旨在建立溶血性曼氏杆菌与多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,从而为临床上同时检测这两种病原的感染提供一种更加方便、快捷、准确的工具。根据溶血性曼氏杆菌lkt基因和多杀性巴氏杆菌sp6基因分别设计引物,优化条件后进行特异性和敏感性的评价,并对180份临床样本进行了检测。结果显示,溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌引物的最佳终浓度分别为10和20pmol/L。该方法的特异性较好,对其他无关病原不检出。对溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的检测限分别为56和22pg,与独立PCR相同。该方法对临床样本的检测结果表明,溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的检出率分别为51.67%和47.78%。研究结果表明,本研究建立的双重PCR诊断技术具有特异性好、敏感度高等特点,为临床上溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的快速检测、鉴定以及混合感染的流行病学调查提供了有用的工具。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌 多杀性巴氏杆菌 双重PCR
原文传递
猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立与应用 被引量：16
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作者 季程远 王蔚怡 +5 位作者 黄欣 方庆励 欧阳康 陈樱 韦祖樟 黄伟坚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期913-916,共4页
为建立一种快速且同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)的方法,本研究根据GenBank中PCV2和PCV3的全基因组序列,设计了两对特异性引物,通过对扩增条件的优化,建立了能够同时检测PCV2和PCV3的双重PCR方法。该方法可以同时扩增PCV2的266... 为建立一种快速且同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)的方法,本研究根据GenBank中PCV2和PCV3的全基因组序列,设计了两对特异性引物,通过对扩增条件的优化,建立了能够同时检测PCV2和PCV3的双重PCR方法。该方法可以同时扩增PCV2的266 bp和PCV3的594 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的基因组扩增结果均为阴性。对PCV2和PCV3的最低检出量均为100拷贝/μL。对广西境内100份健康屠宰猪淋巴结样品检测结果显示,单一PCR与双重PCR检测符合率为100%。结果表明,本研究建立了一种简便快捷、反应灵敏、稳定可靠且特异性强的双重PCR技术,为临床样品中PCV2和PCV3的快速检测提供了有效的技术支持。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 猪圆环病毒3型 双重PCR 检测
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