小麦矮缩病毒(wheat dwarf virus,WDV)引起的小麦矮缩病是一种危害严重的小麦病害。为研究小麦与WDV的互作机制,本研究首先以小麦为供试材料,提取小麦幼苗叶片和根组织的总RNA,采用SMART(switching mechanism at 5′end of RNA transcri...小麦矮缩病毒(wheat dwarf virus,WDV)引起的小麦矮缩病是一种危害严重的小麦病害。为研究小麦与WDV的互作机制,本研究首先以小麦为供试材料,提取小麦幼苗叶片和根组织的总RNA,采用SMART(switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术构建了小麦全长cDNA文库。该文库滴度大于4×10^(9)cfu/mL、初级文库库容量超过3.6×10^(6)cfu,插入片段长度在500~2000 bp之间,平均长度大于1000 bp,重组率约100%,成功获得了高质量的小麦cDNA文库。为筛选与WDV复制蛋白(replication protein,Rep)互作的寄主因子,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Rep,验证其无毒性和自激活现象后,利用构建的文库初步筛选出32个与WDV-Rep蛋白发生相互作用的候选靶标蛋白。在此基础上,采用酵母双杂交系统对筛选获得的10个候选蛋白进行一对一互作验证,最终确定其中8个蛋白与WDV-Rep存在相互作用。生物信息学分析表明,这些阳性互作蛋白包括锌指转录因子TFⅢA、去SUMO化酶DeSI、E3泛素连接酶BRE1等,其功能涉及基因转录调控、蛋白质泛素化修饰、植物抗逆防御应答、光合作用能量转换和RNA加工等多个关键生物学过程。该研究为深入解析WDV致病机理和寄主抗病机制提供了材料和理论基础。展开更多
An accurate assessment of host and pathogen gene expression during infection is critical for understanding the molecular aspects of host-pathogen interactions.Often,pathogen-derived transcripts are difficult to ascert...An accurate assessment of host and pathogen gene expression during infection is critical for understanding the molecular aspects of host-pathogen interactions.Often,pathogen-derived transcripts are difficult to ascertain at early infection stages owing to the unfavourable transcript representation compared to the host genes.In this study,we compare two sequencing techniques,RNAseq and enrichment sequencing(RenSeq and PenSeq)of cDNA,to investigate gene expression patterns in the doubled monoploid potato(DM)infected with the late blight pathogen Phytophthora infestans.Our results reveal distinct advantages of cDNA RenSeq and PenSeq over traditional RNAseq in terms of target gene representation and transcriptional quantification at early infection stages.Throughout the infection time course,cDNA enrichment sequencing enables transcriptomic analyses for more targeted host and pathogen genes.For highly expressed genes that were sampled in parallel by both cDNA enrichment and RNAseq,a high level of concordance in expression profiles is observed,indicative of at least semi-quantitative gene expression representation following enrichment.展开更多
目的:构建分化潜能更高的神经母细胞瘤肾上腺素能(ADRN)型细胞cDNA表达文库。方法:提取人神经母细胞瘤细胞N型细胞株SK-N-BE(2)、SK-N-SH、SH-sy5y和IMR-32在对数生长期阶段的mRNA,随后应用SMART(Switching Mechanism At5′end of the R...目的:构建分化潜能更高的神经母细胞瘤肾上腺素能(ADRN)型细胞cDNA表达文库。方法:提取人神经母细胞瘤细胞N型细胞株SK-N-BE(2)、SK-N-SH、SH-sy5y和IMR-32在对数生长期阶段的mRNA,随后应用SMART(Switching Mechanism At5′end of the RNA Transcript)技术制备双链cDNA,同时在其两端连接5′Adapter。进一步采用同源重组方法构建cDNA文库,并对电转化后的文库进行扩增,测定文库的滴度和库容量,同时利用PCR方法鉴定插入片段大小,最后再对cDNA文库进行NGS测序(Next Generation Sequencing),检测文库中基因含量。结果:建立的pcDNA3.1(+)cDNA表达文库总库容量为1×10~9 CFU,文库滴度为2.52×10~8 CFU/mL,平均插入片段为1.2 kb,阳性率为100%,NGS测序分析结果显示文库包含9 247个基因。结论:本研究成功构建pcDNA3.1(+)表达文库,具有较好的质量和良好的多态性,为后续特异性基因的筛选研究提供了有力工具。展开更多
酵母双杂交技术是研究蛋白质之间相互作用的常用手段之一。构建高温处理条件下多年生黑麦草叶片酵母双杂交cDNA文库,能为后续利用酵母双杂交技术探究多年生黑麦草耐高温功能基因之间的互作机制提供技术支撑。以高温处理不同时段的多年...酵母双杂交技术是研究蛋白质之间相互作用的常用手段之一。构建高温处理条件下多年生黑麦草叶片酵母双杂交cDNA文库,能为后续利用酵母双杂交技术探究多年生黑麦草耐高温功能基因之间的互作机制提供技术支撑。以高温处理不同时段的多年生黑麦草叶片为材料,分别提取总RNA后进行等量混合,使用SMART(Switching Mechanism At 5'end of RNA Transcript)技术合成cDNA,再通过胞内同源重组在酵母菌株Y187中构建了高温处理条件下多年生黑麦草叶片全长cDNA文库。所构文库转化效率为1.15×10^(5) CFU/μg,文库滴度为1.43×10^(7) CFU/mL,重组率为100%,说明本文库质量合格,可以用于后续酵母文库筛选。展开更多
建立A组轮状病毒(Group A rotavirus,RVA)全基因组单管多重RT⁃PCR扩增方法,并比较其与双链cDNA合成方法在RVA临床标本全基因组二代测序中的应用。对2022年某哨点医院的18份腹泻住院患儿RVA阳性粪便标本进行核酸提取,分别用单管多重RT⁃PC...建立A组轮状病毒(Group A rotavirus,RVA)全基因组单管多重RT⁃PCR扩增方法,并比较其与双链cDNA合成方法在RVA临床标本全基因组二代测序中的应用。对2022年某哨点医院的18份腹泻住院患儿RVA阳性粪便标本进行核酸提取,分别用单管多重RT⁃PCR扩增方法对RVA全基因组进行扩增,用随机引物对病毒核酸进行反转录及双链cDNA合成,最后采用Illumina平台对这2种不同类型的产物进行二代测序。用CLC软件对测序数据进行拼接,分析有效数据量、测序深度及全基因组覆盖度等参数,并用IGV软件查看全基因组测序深度覆盖轨迹。多重RT⁃PCR扩增产物测序和双链cDNA测序获得的RVA有效数据量分别为69.39%~99.83%和0.38%~92.99%,平均测序深度分别为10172×~68156×和35×~61783×,全基因组测序深度10×以上的位点覆盖度分别为98.93%~100.00%和86.28%~100.00%。从全基因组测序深度情况来看,多重RT⁃PCR扩增产物测序在同一个基因节段内部测序深度较为均匀,在11个节段之间测序深度差别较大;而双链cDNA测序在不同基因节段之间的测序深度较为均匀,但同一个基因节段内部靠近5'和3'末端测序深度较低。2种方法所获得的病毒核苷酸序列基本一致,部分基因节段在5'或3'末端100 bp区域内存在2个以内的核苷酸位点差异。在多重RT⁃PCR扩增方法中鉴于引物在不同基因型别间的特异性,对本研究中未涉及到的基因型别的扩增效率还有待进一步验证。单管多重RT⁃PCR扩增方法和双链cDNA合成方法虽然各有优缺点,但均适用于轮状病毒全基因组二代测序在基层的推广。展开更多
【目的】深入探究麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)生长发育及致病力的分子作用机制,并鉴定BsTup1的互作蛋白。【方法】利用麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)孢子和不同时期的菌丝体为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以BsTup1基因为...【目的】深入探究麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)生长发育及致病力的分子作用机制,并鉴定BsTup1的互作蛋白。【方法】利用麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)孢子和不同时期的菌丝体为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以BsTup1基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与BsTup1相互作用的蛋白。【结果】1)利用SMART(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript)技术首次成功构建了麦根腐平脐蠕孢(B.sorokini-ana)分生孢子和菌丝体的混合cDNA文库。文库鉴定结果表明,构建的cDNA文库库容为4.8×10^(7) cfu·mL^(-1),文库插入片段重组率达100%且平均大小为1000 bp。2)构建了pGBKT7-BsTup1诱饵载体,无自激活活性。3)使用诱饵蛋白载体pGBKT7-BsTup1对麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)酵母双杂交cDNA文库进行筛选,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得38个与BsTup1相互作用的候选蛋白。【结论】成功构建了麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)的cDNA文库,并鉴定出38个与BsTup1相互作用的候选蛋白。展开更多
基金supported by the Rural & Environment Science & Analytical Services (RESAS) Division of the Scottish Government through project JHI-B1-1the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) through awards BB/ S015663/1+2 种基金BB/X009068/1Research Leaders 2025 fellowship funded by European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under Marie Sklodowska-Curie grant agreement no. 754380the Research/Scientific Computing teams at The James Hutton Institute and NIAB for providing computational resources and technical support for the “UK’s Crop Diversity Bioinformatics HPC” (BBSRC grant BB/ S019669/1)。
文摘An accurate assessment of host and pathogen gene expression during infection is critical for understanding the molecular aspects of host-pathogen interactions.Often,pathogen-derived transcripts are difficult to ascertain at early infection stages owing to the unfavourable transcript representation compared to the host genes.In this study,we compare two sequencing techniques,RNAseq and enrichment sequencing(RenSeq and PenSeq)of cDNA,to investigate gene expression patterns in the doubled monoploid potato(DM)infected with the late blight pathogen Phytophthora infestans.Our results reveal distinct advantages of cDNA RenSeq and PenSeq over traditional RNAseq in terms of target gene representation and transcriptional quantification at early infection stages.Throughout the infection time course,cDNA enrichment sequencing enables transcriptomic analyses for more targeted host and pathogen genes.For highly expressed genes that were sampled in parallel by both cDNA enrichment and RNAseq,a high level of concordance in expression profiles is observed,indicative of at least semi-quantitative gene expression representation following enrichment.
文摘酵母双杂交技术是研究蛋白质之间相互作用的常用手段之一。构建高温处理条件下多年生黑麦草叶片酵母双杂交cDNA文库,能为后续利用酵母双杂交技术探究多年生黑麦草耐高温功能基因之间的互作机制提供技术支撑。以高温处理不同时段的多年生黑麦草叶片为材料,分别提取总RNA后进行等量混合,使用SMART(Switching Mechanism At 5'end of RNA Transcript)技术合成cDNA,再通过胞内同源重组在酵母菌株Y187中构建了高温处理条件下多年生黑麦草叶片全长cDNA文库。所构文库转化效率为1.15×10^(5) CFU/μg,文库滴度为1.43×10^(7) CFU/mL,重组率为100%,说明本文库质量合格,可以用于后续酵母文库筛选。
文摘建立A组轮状病毒(Group A rotavirus,RVA)全基因组单管多重RT⁃PCR扩增方法,并比较其与双链cDNA合成方法在RVA临床标本全基因组二代测序中的应用。对2022年某哨点医院的18份腹泻住院患儿RVA阳性粪便标本进行核酸提取,分别用单管多重RT⁃PCR扩增方法对RVA全基因组进行扩增,用随机引物对病毒核酸进行反转录及双链cDNA合成,最后采用Illumina平台对这2种不同类型的产物进行二代测序。用CLC软件对测序数据进行拼接,分析有效数据量、测序深度及全基因组覆盖度等参数,并用IGV软件查看全基因组测序深度覆盖轨迹。多重RT⁃PCR扩增产物测序和双链cDNA测序获得的RVA有效数据量分别为69.39%~99.83%和0.38%~92.99%,平均测序深度分别为10172×~68156×和35×~61783×,全基因组测序深度10×以上的位点覆盖度分别为98.93%~100.00%和86.28%~100.00%。从全基因组测序深度情况来看,多重RT⁃PCR扩增产物测序在同一个基因节段内部测序深度较为均匀,在11个节段之间测序深度差别较大;而双链cDNA测序在不同基因节段之间的测序深度较为均匀,但同一个基因节段内部靠近5'和3'末端测序深度较低。2种方法所获得的病毒核苷酸序列基本一致,部分基因节段在5'或3'末端100 bp区域内存在2个以内的核苷酸位点差异。在多重RT⁃PCR扩增方法中鉴于引物在不同基因型别间的特异性,对本研究中未涉及到的基因型别的扩增效率还有待进一步验证。单管多重RT⁃PCR扩增方法和双链cDNA合成方法虽然各有优缺点,但均适用于轮状病毒全基因组二代测序在基层的推广。
文摘【目的】深入探究麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)生长发育及致病力的分子作用机制,并鉴定BsTup1的互作蛋白。【方法】利用麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)孢子和不同时期的菌丝体为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以BsTup1基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与BsTup1相互作用的蛋白。【结果】1)利用SMART(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript)技术首次成功构建了麦根腐平脐蠕孢(B.sorokini-ana)分生孢子和菌丝体的混合cDNA文库。文库鉴定结果表明,构建的cDNA文库库容为4.8×10^(7) cfu·mL^(-1),文库插入片段重组率达100%且平均大小为1000 bp。2)构建了pGBKT7-BsTup1诱饵载体,无自激活活性。3)使用诱饵蛋白载体pGBKT7-BsTup1对麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)酵母双杂交cDNA文库进行筛选,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得38个与BsTup1相互作用的候选蛋白。【结论】成功构建了麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)的cDNA文库,并鉴定出38个与BsTup1相互作用的候选蛋白。
