TaqMan探针法在耐碳青霉烯类鲍曼不杆菌基因检测中的应用及评价

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作者 汪秀秀 李楠 汪庆飞 《齐齐哈尔医学院学报》 2026年第4期364-367,共4页

目的探讨实时荧光定量PCR技术TaqMan探针法在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药基因检测的应用价值。方法收集2024年7月—2025年6月蚌埠医科大学第二附属医院100份微生物检测标本进行细菌培养和药敏检测以及应用TaqMan探针法检测耐... 目的探讨实时荧光定量PCR技术TaqMan探针法在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药基因检测的应用价值。方法收集2024年7月—2025年6月蚌埠医科大学第二附属医院100份微生物检测标本进行细菌培养和药敏检测以及应用TaqMan探针法检测耐药基因,比较两种检测方法的检出率、阳性符合率以及结果一致性分析。结果细菌培养检出AB 58株,CRAB 52株,检出率分别为58.00%和52.00%;blaOXA-51基因检测AB 64株,blaOXA-23基因检测CRAB 53株,检出率分别为64.00%和53.00%。细菌培养和基因检测(blaOXA-51、blaOXA-23)的阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与细菌培养相比,blaOXA-51、blaOXA-23基因检测的符合率分别为86.00%和89.00%,一致性较好,Kappa值为0.707和0.779。结论使用TaqMan探针法检测鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗菌药物耐药基因的阳性检出率和符合率较高,可与传统细菌培养和药敏试验有效互补,为临床早期合理使用抗菌药物提供参考。 展开更多

关键词 taqman探针法 鲍曼不动杆菌 碳青霉烯类药物 碳青霉烯酶 耐药基因

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血清8b型禽腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

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作者 张锋宛 刘琳 +7 位作者 刘明洋 常晶晶 张瀚文 高亚茹 王泱 张宜娜 李新生 宋亚鹏 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第10期98-103,共6页

为了建立一种高效的血清8b型禽腺病毒(FAdV-8b)检测方法,试验针对FAdV-8b Hexon基因高度保守区的核苷酸序列设计TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的特异性引物和探针,通过对扩增体系进行优化建立了FAdV-8b的TaqMan荧光定量PCR检测方法,对... 为了建立一种高效的血清8b型禽腺病毒(FAdV-8b)检测方法,试验针对FAdV-8b Hexon基因高度保守区的核苷酸序列设计TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的特异性引物和探针,通过对扩增体系进行优化建立了FAdV-8b的TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法进行特异性、敏感性和重复性检测,并采用该方法对FAdV-8b感染SPF鸡进行排毒监测与临床样品检测。结果表明:优化后的扩增体系为模板2μL、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)10μL、上下游引物(TaqMan-F/R,10μmol/L)各0.4μL、探针(P,10μmol/L)0.8μL。该方法能特异性检出FAdV-8b,与血清8a型禽腺病毒(FAdV-8a)、血清2型禽腺病毒(FAdV-2)、血清11型禽腺病毒(FAdV-11)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)和H9N2亚型禽流感病毒无交叉反应;能检测到的最低质粒拷贝浓度为50拷贝/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍;以拷贝浓度0.5×10^(7),0.5×10^(6),0.5×10^(5),0.5×10^(4)拷贝/μL的阳性标准质粒为模板的3次重复Ct值的变异系数分别为1.17%、3.73%、6.25%、2.56%。采用该方法进行排毒监测,于攻毒后第1~14天均可在SPF鸡泄殖腔拭子中检测到病毒且于攻毒后第1天和第2天对病毒的检出率达到100%(10/10),而常规PCR方法仅可于攻毒后第1~12天检测到病毒且于攻毒后第1天和第2天对病毒的检出率较低;该方法对91份疑似禽腺病毒感染的临床样本的检出率为13.1%(8/61),与常规PCR方法的符合率为96.7%。说明本研究建立的FAdV-8b TaqMan实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床上FAdV-8b的快速检测。 展开更多

关键词 禽类 血清8b型禽腺病毒 Hexon基因 taqman探针 实时荧光定量PCR 检测方法

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定量PCR-Taqman探针法检测NS0宿主细胞残留DNA的方法学验证 被引量：1

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作者 武刚 付志浩 +4 位作者 杨志行 崔永霏 张荣建 宗伟英 王兰 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第24期2001-2009,共9页

目的NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行... 目的NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行富集纯化;根据《国际人用药品注册技术协调会(ICH)》及《中国药典》通则9101的要求,应用所建立的NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限的方法学验证。应用NS0细胞生产的单克隆抗体工艺中间品及原液,验证所建立试剂盒对实际生产样品的检测性能,并组织5个独立实验室进行协作标定。结果 NS0细胞DNA检测(Taqman法)正向引物序列:CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA、反向引物序列:GCCTGGCAAATACAGAAGTGG、荧光探针序列:FAM-AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT-TAMRA;NS0细胞DNA标准曲线在3 fg·μL^-1~300 pg·μL^-1内,线性良好(r2> 0. 99);对6个浓度梯度检测的准确度偏差均<15%;定量限为3 fg·μL^-1;内部参考品DNA标定结果为30μg·m L^-1;精密度良好(RSD≤30%);能特异性地检测NS0细胞DNA,对大肠杆菌DNA、人类基因组DNA(人肾上皮293T细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DNA无扩增反应。另外,对于生产工艺中间品及原液的检测回收率均在70%~130%,RSD均<15%。5个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论自主研发NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒(定量PCR-Taqman探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足NS0宿主DNA残留检测要求。 展开更多

关键词 NS0 DNA标准品 NS0宿主细胞DNA残留检测 PCR-taqman探针法 方法验证

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鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：2

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作者 万春和 刘荣昌 +5 位作者 程龙飞 施少华 傅光华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第5期1341-1348,共8页

试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,... 试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 展开更多

关键词 鸭腺病毒A型 Hexon基因 taqman探针 实时荧光定量PCR方法

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鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立 被引量：7

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作者 万春和 刘荣昌 +6 位作者 陈翠腾 程龙飞 施少华 傅光华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2018年第6期722-728,共7页

根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线... 根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线性扩增,其标准曲线方程为:y=-3.480x+37.955,扩增相关系数为0.999;敏感性强,最低检测限为10拷贝·μL^(-1);特异性好,仅对DEV强毒株和弱毒活疫苗株检测到阳性扩增信号,对鸭源其他传染病病原(番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%～1.14%和0.69%～2.40%.对临床送检疑似DEV感染的14份样品进行检测,并与常规PCR方法、病毒分离鉴定进行比较,阳性率分别为85.71%(12/14)、71.43%(10/14)和57.14%(8/14);且与常规PCR方法、病毒分离鉴定的阳性符合率均为100%.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法,可用于开发DEV快速诊断试剂盒,用于开展DEV流行病学调查. 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 GE基因 taqman探针 实时荧光定量PCR方法

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一种基于CP530R序列非洲猪瘟病毒TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法的建立 被引量：13

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作者 王建华 董志珍 +7 位作者 赵丹 王玉玲 肖妍 张俊哲 陈小金 王乃福 陈本龙 赵祥平 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第2期22-26,共5页

为了建立一种快速、敏感和特异地检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的方法，试验根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针，通过优化反应条件，建立了一种检测ASFV的TaqMan—MGB探针实时荧光PCR方法，并对... 为了建立一种快速、敏感和特异地检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的方法，试验根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针，通过优化反应条件，建立了一种检测ASFV的TaqMan—MGB探针实时荧光PCR方法，并对该方法进行了特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验评价。结果表明：该方法仅对ASFV发生特异性扩增反应，不与伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）、经典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪流感病毒（SIV）发生交叉反应，具有良好的特异性。用该方法检测质粒标准对照（PCR2．1-ASFV—CP530R）的线性范围为6．1×10^2-6．1×10^9copies／μL，标准曲线方程为Y=-3．449x＋38．10，相关系数（R^2）为0．999，最低可检测到61个拷贝的质粒标准对照分子；对5个不同浓度（6．1×10^3-6．1×10^7copies／μL）的质粒标准对照进行双份样品的4次重复检测，每个浓度质粒标准对照的D值变异系数均小于2．0％，具有良好的重现性；用该方法对126份进口猪的血液样品和38份猪肉样品进行ASFV检测，结果均为阴性。说明本方法可用于活猪临床样品和生猪样品中ASFV的检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 CP530R序列 taqman-MGB探针 实时荧光PCR 方法 建立

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超级细菌bla_(NDM-1)基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：5

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作者 施开创 李凤梅 +3 位作者 张步娴 黎宗强 莫胜兰 许心婷 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期952-956,共5页

为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件... 为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化,建立了检测bla_(NDM-1)基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示该方法可以特异性扩增bla_(NDM-1)基因重组质粒标准品,而对鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株扩增均为阴性;检出下限为2.59拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1.5%。利用所建立的方法对34株鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果均未检测到目的片段,表明所有分离株均未携带bla_(NDM-1)基因。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于监测携带bla_(NDM-1)基因及其变异体的超级细菌。 展开更多

关键词 taqman—MGB探针 荧光定量PCR blaNDM-1基因 超级细菌 检测方法

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Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

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作者 贾广乐 王晓楠 +1 位作者 廖娟红 林祥梅 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第6期69-72,共4页

根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性... 根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。 展开更多

关键词 Q热 贝纳柯克斯体 荧光定量PCR taqman探针法

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应用TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR结合分离培养监测分析灰仓鼠细菌多样性 被引量：6

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作者 高正琴 邢进 +3 位作者 冯育芳 关伟鸿 贺争鸣 岳秉飞 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期221-227,共7页

目的:监测分析中国灰仓鼠细菌的多样性,收集更多的质量信息,获得更全面的微生物背景知识,为灰仓鼠的种群建立、生物净化和动物模型的建立提供科学的数据依据。方法:60只成年灰仓鼠来自新疆地区,安乐死后剖解采集标本。应用TaqMan MGB探... 目的:监测分析中国灰仓鼠细菌的多样性,收集更多的质量信息,获得更全面的微生物背景知识,为灰仓鼠的种群建立、生物净化和动物模型的建立提供科学的数据依据。方法:60只成年灰仓鼠来自新疆地区,安乐死后剖解采集标本。应用TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR和常规微生物学方法进行细菌多样性研究。结果:本研究采用常规微生物学方法从灰仓鼠中鉴定出179株细菌,包括大肠埃希菌、鲍氏志贺菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、栖冷克吕沃尔菌、嗜肺巴斯德菌、溶血性巴斯德菌、产气巴斯德菌、铜绿假单胞菌、栖稻假单胞菌、门多萨假单胞菌、粪产碱杆菌、阴道加特纳菌、卡它莫拉菌、莫拉克斯氏菌、CDC group EF-4a、特氏纤维单胞菌、戊糖片球菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、腐生葡萄球菌、模仿葡萄球菌、头状葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、鸡葡萄球菌、里昂葡萄球菌、山羊葡萄球菌、粘滑罗斯菌、麻疹孪生球菌、肺炎链球菌、咽峡炎链球菌、血链球菌、牛链球菌Ⅰ型、乳房链球菌、少酸链球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、黄肠球菌、浅绿气球菌、解酪蛋白巨大球菌、拥挤棒杆菌、人皮肤棒状杆菌、蜂房芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽胞杆菌。分离培养鉴定出12个科21个属48个种179株细菌,肠杆菌科是主要优势菌群,葡萄球菌科、肠球菌科、假单胞菌科、巴斯德菌科、链球菌科是次优势菌群。应用TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法从灰仓鼠中检出167份核酸阳性标本,包括支原体、泰泽氏菌、空肠弯曲菌、CAR菌、幽门螺杆菌、肝螺杆菌、嗜肺巴斯德菌。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测结果显示支原体是最主要的优势菌群,泰泽氏菌、空肠弯曲菌、CAR菌、幽门螺杆菌、肝螺杆菌是次优势菌群。结论:TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR结合分离培养能够更有效地监测分析灰仓鼠细菌多样性,获得更多更全面的微生物多样性信息,该信息对灰仓鼠质量控制标准的制定具有重要意义。研究结果为我国灰仓鼠微生物学监测以及质量标准的制定提供了科学依据。 展开更多

关键词 灰仓鼠 细菌多样性 taqman MGB探针 实时荧光定量PCR 常规微生学方法 分离培养 生化鉴定 监测分析

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鸭呼肠孤病毒TaqMan与SYBR Green荧光定量检测方法的建立及比较 被引量：9

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作者 陆婧 李敏 +7 位作者 王艳 朱盈名 赵自亮 邓欣竹 刘霞 张立武 程方俊 赵光伟 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期237-243,共7页

本研究旨在针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)建立两种快速、敏感、特异的荧光定量PCR诊断方法并对其临床实用性进行比较。试验根据呼肠孤病毒S1基因序列设计合成1对特异性引物和1条MGB探针,分别建立TaqMan和SYBR GreenⅠ两种荧光定量PCR检测... 本研究旨在针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)建立两种快速、敏感、特异的荧光定量PCR诊断方法并对其临床实用性进行比较。试验根据呼肠孤病毒S1基因序列设计合成1对特异性引物和1条MGB探针,分别建立TaqMan和SYBR GreenⅠ两种荧光定量PCR检测方法,并对两种方法的特异性、灵敏性、重复性进行比较。结果显示,两种检测方法标准曲线的相关系数均为0.999,对鸭细小病毒(DPV)、A型鸭甲肝病毒(DHV-1)、C型鸭甲肝病毒(DHV-3)、鸭传染性支气管炎(IBV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鹅星状病毒(JSHV)的检测结果均为阴性,特异性良好。SYBR GreenⅠ法的最低检测限度为10;拷贝/μL,TaqMan法的最低检测限度为10;拷贝/μL,前者的灵敏度比后者高10倍。SYBR GreenⅠ法和TaqMan法重复性试验的组内和组间变异系数均分别小于2.1%和1.8%。利用这两种方法对临床30份疑似病料进行检测,其中TaqMan法检出29份,SYBR GreenⅠ法检出30份,符合率为97%。综上,两种荧光定量方法均可用于临床NDRV的检测,尤以SYBR GreenⅠ法灵敏度更高。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 荧光定量PCR taqman探针法 SYBR Green法

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产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR特异性引物设计和方法验证 被引量：1

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作者 马嘉琦 孙波 +4 位作者 马红梅 王东 赵志军 李勇 曾瑾 《中国食品卫生杂志》 CSCD 北大核心 2024年第2期147-155,共9页

目的建立针对水样中产气荚膜梭菌检测的TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,并测试该方法在自来水样中的检测效果。方法选择位于该菌拟核中高度保守的plc基因,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化后建立了针对该菌的TaqMan实时... 目的建立针对水样中产气荚膜梭菌检测的TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,并测试该方法在自来水样中的检测效果。方法选择位于该菌拟核中高度保守的plc基因,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化后建立了针对该菌的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,结合滤膜法处理含有plc基因的标准菌株的模拟污染水样,并对所建立的方法进行测试。结果所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有高度的特异性,13株食源性致病菌、3株艰难梭菌及1株腐败梭菌的Ct值大于40;该方法的最低检出限为1×10 copies/μL,具有较高的灵敏性;对模拟污染水样的最低检测限为1.0×10^(2)CFU/mL。应用该方法对4份人工模拟污染阳性水样与90份自来水样进行检测发现,2份1.0×10^(2)CFU/mL的模拟污染水样可检出产气荚膜梭菌,2份1.0×10 CFU/mL的模拟污染水样与90份自来水样均未检出产气荚膜梭菌。结论所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏性高的优点,对水体中产气荚膜梭菌的检测具有较高的应用价值。 展开更多

关键词 产气荚膜梭菌 实时荧光定量PCR taqman探针法 水样检测 食源性致病菌

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BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：6

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作者 麻宝艺 盛陈艳 +6 位作者 刘宏莹 马青霞 汪婷婷 李健明 时坤 杜锐 冷雪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2326-2335,共10页

【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件... 【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件,构建标准曲线,进行双重实时荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性检测,并利用建立的实时荧光定量PCR检测方法对采自吉林省的临床样品进行检测。【结果】建立的双重实时荧光定量PCR方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.3μmol/L,BVDV1和BVDV2型的标准曲线分别为:Y=-3.54X+37.36(R^(2)=0.990)和Y=-3.18X+35.95(R^(2)=0.997)。对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)均无特异性扩增,批内和批间变异系数均<3%,检测下限为10拷贝/μL。临床样品检测结果显示,总体阳性率为23.1%(36/156),其中BVDV1阳性率为17.9%(28/156),BVDV2阳性率为5.1%(8/156)。【结论】本研究建立了可同时快速、准确鉴别BVDV1和BVDV2的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,为BVDV的防控与净化提供技术支撑。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) taqman实时荧光定量PCR方法 探针

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猪轮状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立及初步应用 被引量：1

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作者 林正丹 涂军 +11 位作者 詹存林 孙秀秀 冯贺龙 刘茜 胡薛英 谷长勤 张万坡 陶攀 陈品 余腾 钱平 程国富 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期244-248,共5页

为了对早期猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)感染情况进行监测,根据GenBank中已有的A型PoRV VP6序列,设计2对引物和荧光定量探针,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR方法,并对该方法特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示所建立的TaqMa... 为了对早期猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)感染情况进行监测,根据GenBank中已有的A型PoRV VP6序列,设计2对引物和荧光定量探针,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR方法,并对该方法特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、重复性好、灵敏度高,可检测到101拷贝/μL。经对2366份腹泻仔猪的粪便样品进行检测,所建立的方法检出率(5.92%,140/2366)高于常规RT-PCR(4.95%,117/2366),两者的符合率为98.58%。结果表明,本研究建立的PoRV TaqMan荧光定量RT-PCR方法可用于猪轮状病毒病的临床检测。 展开更多

关键词 猪轮状病毒 taqman探针 荧光定量RT-PCR方法

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柯萨奇病毒B组5型TaqMan一步法RT-qPCR检测方法的建立

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作者 刘煜菡 张名 +4 位作者 郭伟 许丹菡 冯昌增 徐丽兰 马绍辉 《医学研究杂志》 2024年第7期84-88,共5页

目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的... 目的建立柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirusB5,CV-B5)特异的TaqMan一步法实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测方法。方法根据CV-B5的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD18^(TM)载体,在DH5α感受态细胞中扩增,大肠杆菌体外转录后获得RNA标准品并建立标准曲线,最后对检测方法的重复性、敏感度和特异性进行评价。结果该方法在10^(3)~10^(11)拷贝/微升的模板范围内具有良好的线性关系(r^(2)>0.99),扩增效率E=100.9%,敏感度达1×10^(3)拷贝/微升,只对CV-B5有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论本实验建立的TaqMan一步法RT-qPCR检测方法有较高的敏感度、特异性和重复性,有良好的抗干扰性,可用于CV-B5的临床样本检测和绝对定量分析。 展开更多

关键词 柯萨奇病毒B组5型 实时荧光定量聚合酶链反应 taqman探针法

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CT联合TaqMan探针法对不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的诊断价值 被引量：3

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作者 白瑞珍 杜杰静 +2 位作者 于姗 李洁 史军然 《中国医学装备》 2024年第5期47-53,共7页

目的:探讨计算机断层成像(CT)联合Taq Man探针法对不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的诊断价值。方法:收集2020年3月至2023年3月石家庄市妇幼保健院收治的80例支原体肺炎患儿的病历资料,依据患儿年龄分为<1岁组(29例)、1~3岁组(23... 目的:探讨计算机断层成像(CT)联合Taq Man探针法对不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的诊断价值。方法:收集2020年3月至2023年3月石家庄市妇幼保健院收治的80例支原体肺炎患儿的病历资料,依据患儿年龄分为<1岁组(29例)、1~3岁组(23例)和>3岁组(28例);根据入院病程不同分为长病程组(43例,病程>7 d)和短病程组(37例,病程≤7 d)。对所有支原体肺炎患儿均进行CT联合TaqMan探针法检测心肺损伤情况,分析不同年龄组和病程组患儿的心肺损害发生率。采用CT和Taq Man探针检测胸腔积液、心肌厚度、心胸比、支原体核酸表达水平相关指标,采用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分析CT和探针检测支原体肺炎患者心肺损害的诊断价值。结果:CT成像显示,80例患儿中诊断准确率为93.75%(75/80),其中62.5%(50/80)的患儿存在典型的肺部异常。主要为肺部磨玻璃结节(GGO)、合并细菌性肺炎和网状。在小部分患儿中发现了支气管扩张。肺部异常患儿发现双侧肺部受累,其中下叶受累最明显。在临床上怀疑偶发性肺栓塞(PE)的38名患儿,进行了额外的造影剂CT,检测到24例患儿偶发性PE,诊断准确率为63.15%(24/38);采用TaqMan探针法检测支原体感染,建立了高灵敏度和宽动态范围的检测系统,在0.2~0.2×10^(-5)之间进行6次10倍稀释。在1 ng/μl微生物群落(MMC)-DNA标准品中制备,6次log10稀释度的高线性动态范围,回归系数为R^(2)=1。发现DNA检测下限为2×10-15g/μl;不同年龄支原体肺炎患儿随着年龄的增加,心肺损害发生率逐渐降低;<1岁组、1~3岁组和>3岁组支原体肺炎患儿心肺损害发生率分别为93.10%、73.91%和21.43%,3组比较差异有统计学意义(x^(2)=7.660、33.019,P<0.05)。长病程组心肺损害发生率(93.02%)明显高于短病程组(27.03%),差异有统计学意义(x^(2)=12.070、36.960,P<0.05)。心肺损害组患儿的胸腔积液量明显高于非心肺损害组,同时心肺损害组的心肌厚度显著增加,心胸比也显著高于非心肺损害组,以及支原体核酸表达水平比较差异具有统计学意义(t=9.52、3.33、4.22、10.00,P<0.05)。ROC曲线分析显示,CT联合TaqMan探针法诊断不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的AUC均>0.5,且联合诊断的AUC最大。结论:CT联合TaqMan探针法对支原体肺炎患儿的心肺损害具有较高的诊断价值。对于支原体肺炎临床症状持续存在的患儿,应考虑进行心肺损害诊断。改编现有的TaqMan探针法,进一步扩展dPCR检测组合,将改进微生物诊断工具箱,并为支原体肺炎患儿心肺损伤的治疗决策提供可靠的定量数据。 展开更多

关键词 计算机断层成像(CT) taqman探针法 支原体肺炎 心肺损害

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猪流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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作者 黄书 梁海英 +7 位作者 曾智勇 汤德元 王彬 叶泥 边孟婷 柳佳佳 潘向英 田红利 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期651-656,共6页

参照GenBank登录的猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)基质蛋白(matrix protein,M)基因保守序列设计1对特异性引物和1个TaqMan探针,构建重组质粒作为绝对定量模板,通过优化反应体系及条件建立了检测SIV的荧光定量RT-PCR方法,测试了... 参照GenBank登录的猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)基质蛋白(matrix protein,M)基因保守序列设计1对特异性引物和1个TaqMan探针,构建重组质粒作为绝对定量模板,通过优化反应体系及条件建立了检测SIV的荧光定量RT-PCR方法,测试了该方法的特异性、灵敏度及重复性。结果显示,建立的方法与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒等不存在交叉反应,特异性强;最低检测限度为1.0拷贝/μL,比普通RT-PCR方法灵敏10倍;组内和组间重复性试验的变异系数分别在2.2%和1.9%以下,重复性较好;应用该方法对220份临床疑似猪流感样品进行检测,荧光定量RTPCR方法和普通RT-PCR检测率分别为2.7%和1.8%,阳性符合率为100%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可快速检测样品中的各种SIV,从而更好地诊断和监测猪流感。 展开更多

关键词 猪流感病毒 taqman探针 荧光定量RT-PCR方法

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多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162 被引量：1

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作者 王凤军 许海锋 +2 位作者 陈强 杨伊平 金浩然 《保鲜与加工》 CAS 2023年第3期56-61,共6页

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PC... 为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。 展开更多

关键词 转基因玉米MIR162 多重实时荧光PCR taqman-MGB杂交探针标记法 快速鉴定

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绵羊多羔主效基因FecB高通量检测方法的建立及应用 被引量：28

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作者 刘秋月 胡文萍 +10 位作者 贺小云 潘章源 郭晓飞 冯涛 曹贵玲 黄冬维 贺建宁 狄冉 曹晓涵 王翔宇 储明星 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期39-51,共13页

基于前期分型基础,为了更进一步提高分型的效率和准确性,本试验建立了Taqman探针和SNaPshot两种高通量FecB突变分型方法。结果显示,与传统的PCR-RFLP和PCR-SSCP分型方法相比,这两种高通量分型方法在节省检测成本的同时,大大缩短了检测周... 基于前期分型基础,为了更进一步提高分型的效率和准确性,本试验建立了Taqman探针和SNaPshot两种高通量FecB突变分型方法。结果显示,与传统的PCR-RFLP和PCR-SSCP分型方法相比,这两种高通量分型方法在节省检测成本的同时,大大缩短了检测周期,并在检测效率上也有了大幅度的提高,对利用FecB进行分子育种具有潜在的应用价值。自2003年至今,本实验室应用这两种方法对10个中国本地绵羊品种、3个培育品种以及一些杂交群体的23264只绵羊的FecB频率进行了检测,结果显示,湖羊和小尾寒羊携带FecB基因的频率最高,小尾寒羊FecB基因的B等位基因频率为0.432~0.833。跟踪以小尾寒羊作为母本和杜泊羊级进杂交后代群体发现,随着杂交的进行FecB基因在培育的鲁西黑头肉羊中的B等位基因频率提升到了0.432,但在横交固定阶段有所下降。本研究所得结果可为今后在肉用绵羊品种多羔改良和多羔肉用新品种培育过程中通过引入FecB基因提高繁殖性能提供参考数据。 展开更多

关键词 FECB基因 产羔数 taqman探针法 SNaPshot分型 等位基因频率 绵羊

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实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用 被引量：32

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作者 敖金霞 高学军 +1 位作者 仇有文 郭士成 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期141-144,共4页

实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。随着转基因产品大规模商业化,转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反... 实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。随着转基因产品大规模商业化,转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点,使RQ-PCR逐步成为转基因检测的重要工具。 展开更多

关键词 实时荧光定量PCR taqman探针法 SYBR Green I染料法 转基因检测

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埃博拉病毒检测与分型Real-time PCR方法的建立 被引量：16

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作者 盖微微 郑学星 +8 位作者 薛向红 高玉伟 赵永坤 王铁成 王化磊 黄耕 冯娜 杨松涛 夏咸柱 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2013年第3期208-211,216,共5页

目的建立一种致死性埃博拉病毒(EBOV)的快速检测与分型方法。方法根据苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因的保守区序列,设计一对通用引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释质粒pblue-SG,pblue-ZG为标准品,进行Real-ti... 目的建立一种致死性埃博拉病毒(EBOV)的快速检测与分型方法。方法根据苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因的保守区序列,设计一对通用引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释质粒pblue-SG,pblue-ZG为标准品,进行Real-time PCR扩增,制作标准曲线,并进行重复性、准确性检验及特异性检测。结果 Real-time PCR检测苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒标准曲线相关系数均大于0.99,灵敏度可达1.0×101拷贝,高于常规PCR方法的106～107;7种其他对照烈性病病原体检测均呈阴性。结论用建立的Real-time PCR方法检测埃博拉病毒快速、灵敏、特异,重复性好,为埃博拉出血热的快速确诊奠定了基础。 展开更多

关键词 埃博拉病毒 REAL-TIME PCR taqman探针 检测方法

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