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布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
1
作者 彭海涛 高阳 +6 位作者 刘雨欣 顾德媛 张东 张如 许会会 陈思 杨艳玲 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第1期369-377,共9页
旨在建立一种经济高效的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法,用于布鲁菌感染的动物及动物产品的快速检测并区分牛种布鲁菌和其他种布鲁菌感染的动物,为临床常的疫苗和研发的新型疫苗提供科学有效的鉴别诊断方法。本研究根据GenBan... 旨在建立一种经济高效的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法,用于布鲁菌感染的动物及动物产品的快速检测并区分牛种布鲁菌和其他种布鲁菌感染的动物,为临床常的疫苗和研发的新型疫苗提供科学有效的鉴别诊断方法。本研究根据GenBank公布的galU和Omp31的序列设计检测引物和探针,构建重组质粒,对方法特异性、灵敏性及重复性评价,检测实验室制备和临床动物布病血清及组织样品。结果表明,成功建立了布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,该方法最低检测限为1.93×10^(0) copies·μL^(-1),与其他革兰阴性菌无交叉反应,批内及批间变异系数均小于2%。利用本研究建立的方法检测实验室制备样品和临床采集样品共156份,与BCSP31-PCR相比,两者阳性符合率为69.75%;与PCR和虎红凝集试验相比,灵敏性更高,双重TaqMan荧光定量PCR的敏感性为100%,PCR的敏感性为69.75%,虎红凝集试验的敏感性为58.65%。本研究建立的布鲁菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,为布鲁菌临床鉴别检测、流行病学调查及净化提供技术支持。 展开更多
关键词 布鲁菌 双重Taq Man荧光定量PCR 检测方法 鉴别诊断
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TaqMan探针法在耐碳青霉烯类鲍曼不杆菌基因检测中的应用及评价
2
作者 汪秀秀 李楠 汪庆飞 《齐齐哈尔医学院学报》 2026年第4期364-367,共4页
目的探讨实时荧光定量PCR技术TaqMan探针法在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药基因检测的应用价值。方法收集2024年7月—2025年6月蚌埠医科大学第二附属医院100份微生物检测标本进行细菌培养和药敏检测以及应用TaqMan探针法检测耐... 目的探讨实时荧光定量PCR技术TaqMan探针法在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药基因检测的应用价值。方法收集2024年7月—2025年6月蚌埠医科大学第二附属医院100份微生物检测标本进行细菌培养和药敏检测以及应用TaqMan探针法检测耐药基因,比较两种检测方法的检出率、阳性符合率以及结果一致性分析。结果细菌培养检出AB 58株,CRAB 52株,检出率分别为58.00%和52.00%;blaOXA-51基因检测AB 64株,blaOXA-23基因检测CRAB 53株,检出率分别为64.00%和53.00%。细菌培养和基因检测(blaOXA-51、blaOXA-23)的阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与细菌培养相比,blaOXA-51、blaOXA-23基因检测的符合率分别为86.00%和89.00%,一致性较好,Kappa值为0.707和0.779。结论使用TaqMan探针法检测鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗菌药物耐药基因的阳性检出率和符合率较高,可与传统细菌培养和药敏试验有效互补,为临床早期合理使用抗菌药物提供参考。 展开更多
关键词 taqman探针法 鲍曼不动杆菌 碳青霉烯类药物 碳青霉烯酶 耐药基因
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定量检测溶瘤病毒OH2的TaqMan qPCR方法建立
3
作者 李乐 杨婧如 +4 位作者 王欣雅 夏雯 汪洋 胡翰 刘滨磊 《湖北工业大学学报》 2026年第1期103-107,137,共6页
为定量检测溶瘤病毒OH2,建立了一种基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。对建立的TaqMan qPCR方法进行线性扩增能力、灵敏度、定量下限、特异性进行验证,并验证该方法的提取回收率。结果显示,该方法具有良好的扩增线性关系(R^(2... 为定量检测溶瘤病毒OH2,建立了一种基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。对建立的TaqMan qPCR方法进行线性扩增能力、灵敏度、定量下限、特异性进行验证,并验证该方法的提取回收率。结果显示,该方法具有良好的扩增线性关系(R^(2)>0.980),检出限(LOD)为4 copies/μL,定量下限(LLOQ)为50 copies/μL,并且TaqMan qPCR方法具有很好的特异性。该定量检测方法的建立为针对溶瘤病毒OH2临床试验样品的生物分布研究提供了可靠的工具。 展开更多
关键词 taqman qPCR 溶瘤病毒OH2 基因组拷贝数 方法学验证
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血清8b型禽腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用
4
作者 张锋宛 刘琳 +7 位作者 刘明洋 常晶晶 张瀚文 高亚茹 王泱 张宜娜 李新生 宋亚鹏 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第10期98-103,共6页
为了建立一种高效的血清8b型禽腺病毒(FAdV-8b)检测方法,试验针对FAdV-8b Hexon基因高度保守区的核苷酸序列设计TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的特异性引物和探针,通过对扩增体系进行优化建立了FAdV-8b的TaqMan荧光定量PCR检测方法,对... 为了建立一种高效的血清8b型禽腺病毒(FAdV-8b)检测方法,试验针对FAdV-8b Hexon基因高度保守区的核苷酸序列设计TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的特异性引物和探针,通过对扩增体系进行优化建立了FAdV-8b的TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法进行特异性、敏感性和重复性检测,并采用该方法对FAdV-8b感染SPF鸡进行排毒监测与临床样品检测。结果表明:优化后的扩增体系为模板2μL、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)10μL、上下游引物(TaqMan-F/R,10μmol/L)各0.4μL、探针(P,10μmol/L)0.8μL。该方法能特异性检出FAdV-8b,与血清8a型禽腺病毒(FAdV-8a)、血清2型禽腺病毒(FAdV-2)、血清11型禽腺病毒(FAdV-11)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)和H9N2亚型禽流感病毒无交叉反应;能检测到的最低质粒拷贝浓度为50拷贝/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍;以拷贝浓度0.5×10^(7),0.5×10^(6),0.5×10^(5),0.5×10^(4)拷贝/μL的阳性标准质粒为模板的3次重复Ct值的变异系数分别为1.17%、3.73%、6.25%、2.56%。采用该方法进行排毒监测,于攻毒后第1~14天均可在SPF鸡泄殖腔拭子中检测到病毒且于攻毒后第1天和第2天对病毒的检出率达到100%(10/10),而常规PCR方法仅可于攻毒后第1~12天检测到病毒且于攻毒后第1天和第2天对病毒的检出率较低;该方法对91份疑似禽腺病毒感染的临床样本的检出率为13.1%(8/61),与常规PCR方法的符合率为96.7%。说明本研究建立的FAdV-8b TaqMan实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床上FAdV-8b的快速检测。 展开更多
关键词 禽类 血清8b型禽腺病毒 Hexon基因 taqman探针 实时荧光定量PCR 检测方法
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布鲁氏菌基因缺失株TaqMan荧光定量PCR检测方法
5
作者 宋前进 陈亚飞 +5 位作者 张静 刘治凤 徐誉彰 姜彦飞 丛帅 王小龙 《养殖与饲料》 2025年第3期51-56,共6页
[目的]建立布鲁氏菌基因缺失株荧光定量PCR方法,为其他布鲁氏菌毒株和基因缺失株鉴别诊断提供技术支持。[方法]根据GenBank中布鲁氏菌赤藓糖醇基因(eryA基因)设计合成特异性引物和探针,对引物、探针浓度、退火温度等反应条件进行优化后... [目的]建立布鲁氏菌基因缺失株荧光定量PCR方法,为其他布鲁氏菌毒株和基因缺失株鉴别诊断提供技术支持。[方法]根据GenBank中布鲁氏菌赤藓糖醇基因(eryA基因)设计合成特异性引物和探针,对引物、探针浓度、退火温度等反应条件进行优化后,检测该方法的特异性、敏感性和重复性。[结果]重组质粒标准品在1.56×10^(8)~1.56×10 copies/μL呈良好线性关系;特异性试验结果显示,该方法对其他14种常见细菌病毒均无交叉反应;敏感性试验结果显示该方法对布鲁氏菌的检测敏感度为100 copies/μL。重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于2%。[结论]TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可用于布鲁氏菌基因缺失株和其他布鲁氏菌株的鉴别诊断。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 taqman荧光定量PCR 检测方法 鉴别诊断 基因缺失
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猪丹毒杆菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
6
作者 宋前进 刘溪源 +5 位作者 乌吉斯古楞 陈亚飞 路乾 刘维平 张静 曹晓真 《中国动物检疫》 2025年第11期77-82,共6页
为建立猪丹毒杆菌的快速检测方法,根据GenBank数据库中猪丹毒杆菌荚膜多糖基因(cps)序列设计并合成引物及探针,通过对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立检测猪丹毒杆菌的TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏度和重复性进行... 为建立猪丹毒杆菌的快速检测方法,根据GenBank数据库中猪丹毒杆菌荚膜多糖基因(cps)序列设计并合成引物及探针,通过对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立检测猪丹毒杆菌的TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏度和重复性进行验证。结果显示:当质粒标准品拷贝数浓度为2.28×10^(8)~2.28×10^(1) copies/μL时,质粒标准品拷贝数浓度对数和Ct值呈现良好的线性关系;仅对猪丹毒杆菌核酸样品扩增后出现特异性曲线,与其他23种常见猪病病原核酸均无交叉反应;对猪丹毒杆菌的检测灵敏度比普通PCR高100倍,重复性试验组内和组间变异系数均小于2%。结果表明,本研究建立的方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点,可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断。 展开更多
关键词 猪丹毒杆菌 taqman荧光定量PCR 检测方法
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定量PCR-Taqman探针法检测NS0宿主细胞残留DNA的方法学验证 被引量：1
7
作者 武刚 付志浩 +4 位作者 杨志行 崔永霏 张荣建 宗伟英 王兰 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第24期2001-2009,共9页
目的NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行... 目的NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行富集纯化;根据《国际人用药品注册技术协调会(ICH)》及《中国药典》通则9101的要求,应用所建立的NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限的方法学验证。应用NS0细胞生产的单克隆抗体工艺中间品及原液,验证所建立试剂盒对实际生产样品的检测性能,并组织5个独立实验室进行协作标定。结果 NS0细胞DNA检测(Taqman法)正向引物序列:CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA、反向引物序列:GCCTGGCAAATACAGAAGTGG、荧光探针序列:FAM-AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT-TAMRA;NS0细胞DNA标准曲线在3 fg·μL^-1~300 pg·μL^-1内,线性良好(r2> 0. 99);对6个浓度梯度检测的准确度偏差均<15%;定量限为3 fg·μL^-1;内部参考品DNA标定结果为30μg·m L^-1;精密度良好(RSD≤30%);能特异性地检测NS0细胞DNA,对大肠杆菌DNA、人类基因组DNA(人肾上皮293T细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DNA无扩增反应。另外,对于生产工艺中间品及原液的检测回收率均在70%~130%,RSD均<15%。5个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论自主研发NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒(定量PCR-Taqman探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足NS0宿主DNA残留检测要求。 展开更多
关键词 NS0 DNA标准品 NS0宿主细胞DNA残留检测 PCR-taqman探针法 方法验证
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猪圆环病毒3型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：3
8
作者 陈如敬 吴学敏 +4 位作者 陈秋勇 车勇良 王隆柏 严山 周伦江 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期739-745,共7页
【目的】建立检测猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】通过分析明确PCV3复制相关蛋白Rep基因特征,设计针对Rep基因的特异性引物和探针,经条件优化后建立检测PCV3感染的TaqMan实时荧光定... 【目的】建立检测猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】通过分析明确PCV3复制相关蛋白Rep基因特征,设计针对Rep基因的特异性引物和探针,经条件优化后建立检测PCV3感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【结果】建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法敏感性好,最低检测限为42.2拷贝·μL-1;特异性强,对常见猪群传染病均无交叉反应;重复性好,组内变异系数和组间变异系数均在1.48%以内。对福建省2014年至2018年保存的193份组织样品进行检测发现,PCV3在福建省猪群中存在较高的阳性感染率(65.80%),且和PCV2混合感染率较高(52.85%)。【结论】本方法的建立为开展Rep基因在PCV3复制和感染过程中的作用机制提供检测方法。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 Rep基因 taqman实时荧光定量PCR方法 检测
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禽坦布苏病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：5
9
作者 万春和 陈翠腾 +5 位作者 傅秋玲 程龙飞 傅光华 陈红梅 施少华 黄瑜 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2016年第8期49-54,共6页
【目的】建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征,设计特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、重复性进... 【目的】建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征,设计特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和之前建立的RT-PCR方法同时对临床15份疑似ATmV感染的病料进行检测,计算其符合率。【结果】成功建立了检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,当NS1基因含量为(2.67×102)^(2.67×107)拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.998,扩增效率为99.9%。建立的ATmV实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为2.67×102拷贝/μL;特异性强,对水禽常见病毒(如Ⅰ型鸭肝炎病毒、新型鸭呼肠孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒与番鸭细小病毒等)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.39%~1.17%和0.51%~1.82%。对临床送检的15份病料,TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为73.33%(11/15),RTPCR方法的阳性率为60.0%(9/15),2种方法的符合率为100.0%。【结论】建立了基于TaqMan探针的ATmV实时荧光定量PCR检测方法,该方法可应用于ATmV感染的早期检测。 展开更多
关键词 禽坦布苏病毒 NS1基因 taqman 实时荧光定量PCR方法
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杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：5
10
作者 刘春 曾伟伟 +5 位作者 王庆 李凯彬 王芳 常藕琴 梁慧丽 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期136-142,共7页
为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特... 为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 杂交鳢 弹状病毒 G蛋白 taqman real-time PCR 检测方法
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猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：4
11
作者 陈如敬 章秋月 +4 位作者 陈秋勇 修金生 吴学敏 严山 周伦江 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2018年第2期212-216,共5页
根据GenBank中登录的猪轮状病毒(PoRV)VP6基因序列特征,设计特异性的引物和探针,条件优化后,建立检测PoRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法.结果表明:建立的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,最低可检测192拷贝·μL^(-1);特异... 根据GenBank中登录的猪轮状病毒(PoRV)VP6基因序列特征,设计特异性的引物和探针,条件优化后,建立检测PoRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法.结果表明:建立的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,最低可检测192拷贝·μL^(-1);特异性强,对猪常见病原(如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒等)检测均为阴性;重复性好,扩增相关系数为0.999,其组内和组间变异系数分别为0.25%~1.26%和0.31%~1.49%.对临床收集的79份猪腹泻病料进行常规RT-PCR检测,检测出阳性样品4份,阳性率为5.06%(4/79);对这79份病料进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测,检测出阳性样品6份,阳性率为7.59%(6/79);同时,4份经RT-PCR检测为阳性的样品经TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测均为阳性,符合率达100%.本研究建立的方法为PoRV早期感染诊断提供检测手段. 展开更多
关键词 猪轮状病毒 taqman 实时荧光定量RT-PCR方法
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基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：5
12
作者 黄琦雯 王庆 +7 位作者 王英英 李莹莹 石存斌 任燕 高彩霞 吴杰兴 郑树城 曾伟伟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期804-809,共6页
基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)是当前引起草鱼出血病暴发与流行的主要病原,为建立快速检测GCRV-Ⅱ的方法,本研究根据GCRV-ⅡRd Rp基因的保守区域序列设计引物及TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测GCRV-Ⅱ的荧光定量PCR方法。结果... 基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)是当前引起草鱼出血病暴发与流行的主要病原,为建立快速检测GCRV-Ⅱ的方法,本研究根据GCRV-ⅡRd Rp基因的保守区域序列设计引物及TaqMan探针,经反应参数优化,建立了检测GCRV-Ⅱ的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法仅对GCRV-Ⅱ的靶基因序列进行扩增,与其它非靶目标核酸均无交叉反应;其最低检出量为3拷贝/μL病毒核酸,比普通PCR的敏感度高100倍;组内和组间重复试验变异系数均小于1%。采用该方法检测60份草鱼出血病疑似样品,GCRV-Ⅱ阳性检出率为75%(45/60),与细胞分离结果一致。应用该方法分析了GCRV-Ⅱ在不同细胞和不同培养方式下病毒的增殖含量,结果显示GSB和PSF细胞增殖量最大,达106拷贝/μL^107拷贝/μL病毒核酸,转瓶接种比常规的细胞培养瓶和培养板接种其病毒含量低2个数量级。本研究建立的GCRV-ⅡTaqMan荧光定量PCR方法具有高效、特异、敏感、可重复性强的优点,适用于GCRV-Ⅱ的临床快速检测和病毒定量分析。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 基因Ⅱ型 TAQ Man荧光定量PCR 检测方法
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鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用 被引量：19
13
作者 周勇 曾令兵 +2 位作者 张辉 范玉顶 徐进 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期607-613,共7页
针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组... 针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号。取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104copies/μL和3.02×102copies/μL。本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义。 展开更多
关键词 鲫 造血器官坏死症 鲤疱疹病毒Ⅱ型 taqman REAL-TIME PCR 检测方法
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TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用 被引量：2
14
作者 李涛 万译文 刘登望 《山东农业科学》 2016年第7期125-128,共4页
本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA,利用针对锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针,经反应体系优化,应用实时荧光定量PCR检测技术,通过对荧光信号的实时监测实现对... 本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA,利用针对锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针,经反应体系优化,应用实时荧光定量PCR检测技术,通过对荧光信号的实时监测实现对KHV的定量检测。整个过程快速、简捷,操作简单,可对KHV进行快速有效的诊断,具有一定的应用价值。 展开更多
关键词 锦鲤疱疹病毒 荧光定量PCR taqman 一步法
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鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：2
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作者 万春和 刘荣昌 +5 位作者 程龙飞 施少华 傅光华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第5期1341-1348,共8页
试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,... 试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 展开更多
关键词 鸭腺病毒A型 Hexon基因 taqman探针 实时荧光定量PCR方法
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鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立 被引量：7
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作者 万春和 刘荣昌 +6 位作者 陈翠腾 程龙飞 施少华 傅光华 陈红梅 傅秋玲 黄瑜 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2018年第6期722-728,共7页
根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线... 根据鸭瘟病毒(DEV) gE基因的特征,设计特异性引物和探针,经条件优化后,建立检测DEV的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果表明:当gE基因含量为1.0×10~1～1.0×10~6拷贝·μL^(-1)时,建立的实时荧光定量PCR检测方法有良好的线性扩增,其标准曲线方程为:y=-3.480x+37.955,扩增相关系数为0.999;敏感性强,最低检测限为10拷贝·μL^(-1);特异性好,仅对DEV强毒株和弱毒活疫苗株检测到阳性扩增信号,对鸭源其他传染病病原(番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%～1.14%和0.69%～2.40%.对临床送检疑似DEV感染的14份样品进行检测,并与常规PCR方法、病毒分离鉴定进行比较,阳性率分别为85.71%(12/14)、71.43%(10/14)和57.14%(8/14);且与常规PCR方法、病毒分离鉴定的阳性符合率均为100%.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法,可用于开发DEV快速诊断试剂盒,用于开展DEV流行病学调查. 展开更多
关键词 鸭瘟病毒 GE基因 taqman探针 实时荧光定量PCR方法
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Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 贾广乐 王晓楠 +1 位作者 廖娟红 林祥梅 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第6期69-72,共4页
根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性... 根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 Q热 贝纳柯克斯体 荧光定量PCR taqman探针法
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一种基于CP530R序列非洲猪瘟病毒TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法的建立 被引量：13
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作者 王建华 董志珍 +7 位作者 赵丹 王玉玲 肖妍 张俊哲 陈小金 王乃福 陈本龙 赵祥平 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第2期22-26,共5页
为了建立一种快速、敏感和特异地检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的方法，试验根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针，通过优化反应条件，建立了一种检测ASFV的TaqMan—MGB探针实时荧光PCR方法，并对... 为了建立一种快速、敏感和特异地检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的方法，试验根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针，通过优化反应条件，建立了一种检测ASFV的TaqMan—MGB探针实时荧光PCR方法，并对该方法进行了特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验评价。结果表明：该方法仅对ASFV发生特异性扩增反应，不与伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）、经典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪流感病毒（SIV）发生交叉反应，具有良好的特异性。用该方法检测质粒标准对照（PCR2．1-ASFV—CP530R）的线性范围为6．1×10^2-6．1×10^9copies／μL，标准曲线方程为Y=-3．449x＋38．10，相关系数（R^2）为0．999，最低可检测到61个拷贝的质粒标准对照分子；对5个不同浓度（6．1×10^3-6．1×10^7copies／μL）的质粒标准对照进行双份样品的4次重复检测，每个浓度质粒标准对照的D值变异系数均小于2．0％，具有良好的重现性；用该方法对126份进口猪的血液样品和38份猪肉样品进行ASFV检测，结果均为阴性。说明本方法可用于活猪临床样品和生猪样品中ASFV的检测。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 CP530R序列 taqman-MGB探针 实时荧光PCR 方法 建立
原文传递
同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用 被引量：3
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作者 施开创 官家明 +4 位作者 胡杰 李凤梅 莫胜兰 陈汉忠 李军 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期453-457,共5页
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、变异株及弱毒活疫苗TJM-F92株的基因序列差异,设计了2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PRRSV美洲型经... 为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、变异株及弱毒活疫苗TJM-F92株的基因序列差异,设计了2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,与猪其他常见病毒无交叉反应;经典株、变异株、TJM-F92疫苗株重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。此外,该方法对324份疑似PPRSV感染的临床样品进行检测,结果显示PRRSV阳性114份,其中美洲型变异株105份、经典株6份、TJM-F92疫苗株3份,变异株和经典株混合感染4份。本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可以为PRRSV美洲型野毒株、疫苗株的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 美洲型病毒株 TJM—F92疫苗株 多重taqman荧光定量RT—PCR 检测方法
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超级细菌bla_(NDM-1)基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：5
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作者 施开创 李凤梅 +3 位作者 张步娴 黎宗强 莫胜兰 许心婷 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期952-956,共5页
为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件... 为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化,建立了检测bla_(NDM-1)基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示该方法可以特异性扩增bla_(NDM-1)基因重组质粒标准品,而对鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株扩增均为阴性;检出下限为2.59拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1.5%。利用所建立的方法对34株鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果均未检测到目的片段,表明所有分离株均未携带bla_(NDM-1)基因。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于监测携带bla_(NDM-1)基因及其变异体的超级细菌。 展开更多
关键词 taqman—MGB探针 荧光定量PCR blaNDM-1基因 超级细菌 检测方法
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