根据高效培养鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)时对病毒滴度检测的需要,本文针对IBDV VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量实时RT-PCR(qRT-PCR)方法,结果表...根据高效培养鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)时对病毒滴度检测的需要,本文针对IBDV VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量实时RT-PCR(qRT-PCR)方法,结果表明,其Ct值与标准品模板在4.03×101～109拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,对IBDV核酸的最低检出量为40拷贝/μL,灵敏度是常规RT-PCR检测方法的1 000倍;该方法不与其它禽源病毒发生交叉反应,批内变异系数小于0.5%。应用本方法对DF-1细胞中IBDV的增殖滴度进行了测定,并与经典的TCID50测定方法进行了比较。结果显示两种方法测定的IBDV在微载体悬浮培养和方瓶静态培养条件下DF-1细胞上的增殖曲线都具有一定的平行关系,且qRT-PCR方法比TCID50方法更加快速和敏感,更适合于对IBDV增殖滴度的实时快速测定。展开更多
为探索核酸杂交技术在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)细胞半数感染量(TCID50)中的可行性,将ALV-J传染性克隆r NX0101株以10倍梯度稀释后按常规方法接种已长满单层鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,在维持7 d后收集细胞培养上清。上清液部分...为探索核酸杂交技术在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)细胞半数感染量(TCID50)中的可行性,将ALV-J传染性克隆r NX0101株以10倍梯度稀释后按常规方法接种已长满单层鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,在维持7 d后收集细胞培养上清。上清液部分按照试剂盒说明书进行p27抗原的ELISA检测,另一部分提取RNA后以鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒进行Dot-blot检测,每孔中细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体进行IFA检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算三种方法测定的TCID50。结果显示ELISA法、IFA法和Dot-blot法在确定病毒感染中能够相互验证和补充,该病毒在CEF的TCID50分别为10-4.7TCID50/0.1 m L、10-5.2TCID50/0.1 m L和10-5.3TCID50/0.1 m L。表明采用Dot-blot法测定ALV-J的TCID50是可行的,不仅能够排除内源性的干扰,并且比ELISA和IFA具有更高的灵敏度。展开更多
根据乙型脑炎病毒(JEV)NS3基因保守序列设计并合成一对引物,以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测JEV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。该方法在1.92×108～1.92×101拷贝/μL范围内具有良...根据乙型脑炎病毒(JEV)NS3基因保守序列设计并合成一对引物,以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测JEV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。该方法在1.92×108～1.92×101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中19拷贝/μL的病毒核酸,敏感性是常规RT-PCR方法的10倍;检测时间缩短了50%,该方法不与其它猪源病毒发生交叉反应;在重复性试验中,批间、批内变异系数均小于1.2%。应用本方法对JEV在BHK-21细胞上繁殖滴度进行定量检测,绘制JEV在BHK-21细胞上的一步生长曲线,并与TCID50方法绘制的复制动态曲线进行比较。结果显示,两种方法测定的JEV在BHK-21细胞上的复制动态具有一定的平行关系,对于制备灭活疫苗而言,荧光定量PCR方法更快速和敏感,所测得的抗原含量更精确,有利于企业机动灵活地安排生产。展开更多
文摘根据高效培养鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)时对病毒滴度检测的需要,本文针对IBDV VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量实时RT-PCR(qRT-PCR)方法,结果表明,其Ct值与标准品模板在4.03×101～109拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,对IBDV核酸的最低检出量为40拷贝/μL,灵敏度是常规RT-PCR检测方法的1 000倍;该方法不与其它禽源病毒发生交叉反应,批内变异系数小于0.5%。应用本方法对DF-1细胞中IBDV的增殖滴度进行了测定,并与经典的TCID50测定方法进行了比较。结果显示两种方法测定的IBDV在微载体悬浮培养和方瓶静态培养条件下DF-1细胞上的增殖曲线都具有一定的平行关系,且qRT-PCR方法比TCID50方法更加快速和敏感,更适合于对IBDV增殖滴度的实时快速测定。
文摘为探索核酸杂交技术在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)细胞半数感染量(TCID50)中的可行性,将ALV-J传染性克隆r NX0101株以10倍梯度稀释后按常规方法接种已长满单层鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,在维持7 d后收集细胞培养上清。上清液部分按照试剂盒说明书进行p27抗原的ELISA检测,另一部分提取RNA后以鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒进行Dot-blot检测,每孔中细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体进行IFA检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算三种方法测定的TCID50。结果显示ELISA法、IFA法和Dot-blot法在确定病毒感染中能够相互验证和补充,该病毒在CEF的TCID50分别为10-4.7TCID50/0.1 m L、10-5.2TCID50/0.1 m L和10-5.3TCID50/0.1 m L。表明采用Dot-blot法测定ALV-J的TCID50是可行的,不仅能够排除内源性的干扰,并且比ELISA和IFA具有更高的灵敏度。
文摘根据乙型脑炎病毒(JEV)NS3基因保守序列设计并合成一对引物,以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测JEV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。该方法在1.92×108～1.92×101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中19拷贝/μL的病毒核酸,敏感性是常规RT-PCR方法的10倍;检测时间缩短了50%,该方法不与其它猪源病毒发生交叉反应;在重复性试验中,批间、批内变异系数均小于1.2%。应用本方法对JEV在BHK-21细胞上繁殖滴度进行定量检测,绘制JEV在BHK-21细胞上的一步生长曲线,并与TCID50方法绘制的复制动态曲线进行比较。结果显示,两种方法测定的JEV在BHK-21细胞上的复制动态具有一定的平行关系,对于制备灭活疫苗而言,荧光定量PCR方法更快速和敏感,所测得的抗原含量更精确,有利于企业机动灵活地安排生产。
