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应用RT-nested PCR检测猪传染性胃肠炎病毒 被引量：8
1
作者 王玉洁 刘金龙 +2 位作者 彭树英 杨瑞锋 张涌 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2005年第2期23-26,共4页
　根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序软件,设计并合成了M基因的2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR,RT-nestedPCR方法,成功扩增出长度为1328bp和1037bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒... 　根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序软件,设计并合成了M基因的2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR,RT-nestedPCR方法,成功扩增出长度为1328bp和1037bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的诊断方法。结果表明,RT-nestedPCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此方法简单省时、灵敏性高,可以作为检测RNA病毒的一种分子生物学方法。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 RT-pcr rt-nested pcr M基因
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犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用 被引量：3
2
作者 王凤雪 闫喜军 +5 位作者 柴秀丽 罗国良 张海玲 邵西群 吴威 程世鹏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期955-959,共5页
根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),... 根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 反转录巢式pcr 反转录pcr NP基因
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蓝莓休克病毒IC-RT-nested PCR检测技术 被引量：5
3
作者 谢丽雪 郑姗 +2 位作者 张立杰 张小艳 李韬 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第22期4366-4374,共9页
【目的】蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是蓝莓上主要病毒之一,侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR技术,为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据GenBank... 【目的】蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是蓝莓上主要病毒之一,侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR技术,为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据GenBank已报道的BlShV基因序列,设计一对外侧引物(BlShV-F/BlShV-R)和一对内侧引物(BlShV-1/BlShV-2),以感染BlShV的蓝莓病叶为材料,利用免疫IC-RT-PCR(免疫捕获RT-PCR)和nested PCR(巢式PCR)建立BlShV的IC-RT-nested PCR检测技术;分别以BlShV、蓝莓焦枯病毒(Blueberry scorch virus,BlScV)、蓝莓带化病毒(Blueberry shoestring virus,BSSV)、蓝莓叶斑驳病毒(Blueberry leaf mottle virus,BLMoV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)和健康蓝莓叶片为对象,测定该检测技术的特异性;将BlShV第1轮、第2轮PCR产物分别回收纯化后连接到pMD18-T载体,连接产物转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,进行测序和序列比对验证该检测技术的准确性;将感染BlShV的蓝莓病叶提取液用健康蓝莓叶片提取液进行10倍梯度稀释,测定该检测技术的灵敏度,并与DAS-ELISA方法相比较;利用建立的IC-RT-nested PCR对收集的中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品(53份)和进境美国蓝莓叶片(15份)进行实际检测,并对上述样品采用普通RT-PCR方法进行验证。【结果】建立的IC-RT-nested PCR方法成功从感染BlShV病叶提取液第1轮PCR扩增出约746 bp大小的目的片段,第2轮PCR扩增出约486 bp大小的目的片段,未从健康蓝莓叶片提取液和空白对照扩增出目的片段;特异性测定结果表明,IC-RT-nested PCR具有良好的特异性,仅从感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR分别扩增到目的片段,而从BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康蓝莓叶片提取液第1轮、第2轮均未扩增到相应的目的片段;序列分析结果显示,感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR产物的序列同预期大小完全一致,分别为746、486 bp,将获得的两轮PCR产物序列与GenBank数据库中的BlShV基因序列进行比对,结果显示第1轮、第2轮PCR产物的序列与已报道的BlShV核苷酸序列一致性均达99%,证实两轮PCR产物均为BlShV特异性产物,进一步验证了扩增结果的准确性;灵敏度测定结果表明,IC-RT-nested PCR的第1轮PCR能够检测到稀释102倍的BlShV病叶提取液,灵敏度与DAS-ELISA相当,经过第2轮PCR,灵敏度提高100倍,能够检测到稀释104倍的BlShV病叶提取液;蓝莓样品IC-RT-nested PCR测定结果显示,2份来自于美国的蓝莓叶片样品扩增出大小约486 bp的目的片段,BlShV检出率为13.3%,而中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品上均未扩增出相应的目的片段,未检测到BlShV,该检测结果与普通RT-PCR验证结果完全相符,表明建立的IC-RT-nested PCR能够用于蓝莓样品的实际检测。【结论】建立的IC-RT-nested PCR具有快速、特异、准确和灵敏的优点,适合于田间和进出境口岸蓝莓样品上BlShV的检测鉴定。 展开更多
关键词 蓝莓休克病毒 IC-rt-nested pcr 检测
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猪瘟病毒RT-nested PCR检测方法的优化和应用 被引量：14
4
作者 朱小甫 张志 +2 位作者 李晓成 陈德坤 吴旭锦 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2007年第6期11-14,共4页
为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化... 为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳性毒和健康猪脾、肝组织及阴性PK-15细胞均未扩增出特异性条带,说明该方法特异性强。应用此方法对福建省133份病料进行检测,结果有60份病料为阳性,阳性率为45.1%。结果提示优化的检测方法灵敏度高,特异性强;福建省猪群CSFV感染率高,需要加强CSF预防控制工作。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 rt-nestedpcr 检测方法
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RT-Nested PCR检测贝类中甲肝病毒的研究
5
作者 饶红 陈广全 +2 位作者 付溥博 冯骞 汪琦 《检验检疫学刊》 2007年第S1期53-55,共3页
[目的]建立灵敏的贝类中甲肝病毒检测方法[方法]由于贝类中HAV污染水平低并存在PCR抑制剂,普通RT-PCR方法检测贝类中甲肝病毒的灵敏度低。本文建立了使用RT-NestedPCR进行贝类中甲肝病毒检测的方法。[结果]此法的检测灵敏度达0.5个TCID5... [目的]建立灵敏的贝类中甲肝病毒检测方法[方法]由于贝类中HAV污染水平低并存在PCR抑制剂,普通RT-PCR方法检测贝类中甲肝病毒的灵敏度低。本文建立了使用RT-NestedPCR进行贝类中甲肝病毒检测的方法。[结果]此法的检测灵敏度达0.5个TCID50/1.5g样品,与普通RT-PCR相比,灵敏度提高了100倍。 展开更多
关键词 检测 甲肝病毒 贝 rt-nested pcr
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应用RT-nested PCR检测猪流行性腹泻病毒的研究 被引量：10
6
作者 吴凌 李一经 +1 位作者 田志军 刘贵元 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2003年第3期27-29,共3页
将猪流行性腹泻病毒分离株HLJ0 2 ,经过胰酶处理后 ,在Vero细胞上增殖。利用Gen Bank中的基因序列设计合成了 2对M基因引物 ,应用RT PCR和RT nestedPCR分别扩增出HLJ0 2的 85 4bp的M全基因片段和 41 2bp的M基因部分片段 ,而在猪传染性... 将猪流行性腹泻病毒分离株HLJ0 2 ,经过胰酶处理后 ,在Vero细胞上增殖。利用Gen Bank中的基因序列设计合成了 2对M基因引物 ,应用RT PCR和RT nestedPCR分别扩增出HLJ0 2的 85 4bp的M全基因片段和 41 2bp的M基因部分片段 ,而在猪传染性胃肠炎病毒中和Vero培养液中未扩增出上述产物。结果表明 ,RT nestedPCR可用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)。 展开更多
关键词 应用 猪 流行性腹泻 病毒 rt-nested pcr检测
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应用RT-nested-PCR检测犬唾液中狂犬病毒的初步研究 被引量：5
7
作者 张建明 王灵岚 +2 位作者 林代华 张志珊 严延生 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期641-643,共3页
目的建立RT-nested-PCR方法,用于检测可疑狂犬唾液中的狂犬病毒,为狂犬病的快速诊断提供一种新思路。方法根据N基因的保守区序列设计2对引物,通过反应条件的优化,建立RT-nested-PCR的方法,以扩增狂犬病毒的N基因,并用该方法检测可疑狂... 目的建立RT-nested-PCR方法,用于检测可疑狂犬唾液中的狂犬病毒,为狂犬病的快速诊断提供一种新思路。方法根据N基因的保守区序列设计2对引物,通过反应条件的优化,建立RT-nested-PCR的方法,以扩增狂犬病毒的N基因,并用该方法检测可疑狂犬唾液中的狂犬病毒。结果该方法的最小RNA检出量可达11.2fg,并具有较好的特异性和重复性。结论建立的RT-nested-PCR检测法,特异性强,敏感度高,结果可靠,操作便捷,值得推广应用。 展开更多
关键词 狂犬病毒 rt-nested—pcr 唾液
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猪肠道病毒和猪捷申病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立
8
作者 莫玲 于新友 +5 位作者 吕素芳 毕艳丽 张颖 李天芝 Ashenafi Kiros Wubshet 王文秀 《动物医学进展》 北大核心 2026年第2期49-53,共5页
为建立同时检测猪肠道病毒(PEV)和猪捷申病毒(PTV)的荧光RT-PCR方法,根据NCBI中PEV VP1(NCBI AF363453)和PTV VP1(NCBI GQ293092)基因序列,分别设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和扩增程序,建立了一种无需提取核酸即可同时检测PEV... 为建立同时检测猪肠道病毒(PEV)和猪捷申病毒(PTV)的荧光RT-PCR方法,根据NCBI中PEV VP1(NCBI AF363453)和PTV VP1(NCBI GQ293092)基因序列,分别设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和扩增程序,建立了一种无需提取核酸即可同时检测PEV和PTV的双重荧光RT-PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评估,并对临床样品进行检测。结果表明,20μL体系中各引物和探针最适加入量为:PEV-F 0.8μL、PEV-R 1.3μL、PEV-P 0.6μL、PTV-F 1.2μL、PTV-R 1.4μL和PTV-P 0.7μL,优化后的扩增程序为:90℃3 min;60℃反转录5 min;95℃5 s,52℃退火延伸20 s(此处收集荧光),共计40个循环。该对猪常见病原均无扩增,对PEV和PTV检测敏感性分别为5.13 TCID 50/100μL和3.47 TCID 50/100μL,对135份临床样品检测结果与传统核酸提取法结果一致。成功建立了PEV和PTV的免提取核酸双重荧光RT-PCR方法,特异性好,敏感性高,可用于临床两种疑似病例的快速检测。 展开更多
关键词 猪肠道病毒 猪捷申病毒 免提取核酸 荧光pcr
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dPCR方法动态监测T790M突变在EGFR阳性非小细胞肺癌耐药治疗中的指导作用
9
作者 姚铠涛 曾小芸 +3 位作者 连逸恺 林建雄 王双玲 魏丹娜 《分子诊断与治疗杂志》 2026年第1期131-134,共4页
目的本研究旨在探讨使用数字PCR(dPCR)方法动态监测血浆EGFR T790M突变的可行性,并评估基于血浆T790M突变检测的早期干预是否可作为EGFR突变非小细胞肺癌患者EGFR-TKI转换治疗的最佳时机。方法初筛2021年7月至2023年12月在汕头大学医学... 目的本研究旨在探讨使用数字PCR(dPCR)方法动态监测血浆EGFR T790M突变的可行性,并评估基于血浆T790M突变检测的早期干预是否可作为EGFR突变非小细胞肺癌患者EGFR-TKI转换治疗的最佳时机。方法初筛2021年7月至2023年12月在汕头大学医学院第二附属医院75例接受埃克替尼治疗的EGFR阳性Ⅳ期NSCLC患者,T790M突变率为53.3%,最终纳入40例患者。试验组(n=18)在血浆检测到T790M突变后更换第三代EGFR-TKI治疗,对照组(n=22)在影像学进展及T790M突变后更换EGFR-TKI治疗。比较两组的临床疗效、无进展生存期(PFS)及不良反应。结果试验组的客观缓解率(ORR)为72.2%,对照组为68.2%,两组差异无统计学意义(P>0.05)。试验组的疾病控制率(DCR)为94.4%,对照组为81.9%,差异无统计学意义(P>0.05)。试验组的中位PFS显著长于对照组,差异有统计学意义(14.8个月vs 10.3个月,P=0.024)。两组的不良反应均为1~2级,皮疹、腹泻及肝功能异常的发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论使用dPCR动态监测血浆EGFR T790M突变,可较影像学更早识别一代EGFR-TKI耐药,从而及时转换三代EGFR-TKI治疗,延缓疾病进展,是一种经济且临床可行的策略。 展开更多
关键词 非小细胞肺癌 EGFR T790M 数字pcr 三代酪氨酸激酶抑制剂
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猴痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立
10
作者 孙健 赵柏林 《山东畜牧兽医》 2026年第1期8-12,共5页
猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)作为一种重要的人畜共患病毒,其在全球范围内传播和蔓延引起了广泛关注,尤其是在近年来的疫情中,及时有效的检测方法显得尤为重要。为建立一种快速诊断MPXV的检测方法,根据2022年公布的MPXV的靶基因片段F... 猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)作为一种重要的人畜共患病毒,其在全球范围内传播和蔓延引起了广泛关注,尤其是在近年来的疫情中,及时有效的检测方法显得尤为重要。为建立一种快速诊断MPXV的检测方法,根据2022年公布的MPXV的靶基因片段F3L(462 bp,GenBank登录号AF380138.1)保守区域,设计了1对特异性的引物和1条探针,建立了猴痘病毒荧光定量PCR检测方法。结果显示,本方法仅能有效检测MPXV,与牛结节皮肤病病毒、非洲猪瘟病毒VP72片段质粒、圆环病毒Ⅱ型标准品均无交叉反应;对重组质粒标准品的最低检测限为5.1 copies/μL;批内与批间的重复试验变异系数均小于6%。结果表明,本试验方法具有较强的敏感性、特异性和稳定性,可以用于猴痘病毒的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 猴痘病毒 荧光定量 pcr 检测方法
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猴泡沫病毒(SFV)RT-nestedPCR检测方法的建立及初步应用
11
作者 栗景蕊 付瑞 +1 位作者 李晓波 贺争鸣 《中国比较医学杂志》 CAS 2010年第1期46-51,I0003,共7页
目的建立实验猴群及相关生物制品猴泡沫病毒(SFV)的PCR检测方法。方法选择SFV-1、SFV-3、SFVCPZ前病毒序列的pol基因同源性较高的区域设计嵌套引物对SFV-1毒种进行RT-nestedPCR扩增并克隆测序,以确定其准确性,通过验证方法的特异性和敏... 目的建立实验猴群及相关生物制品猴泡沫病毒(SFV)的PCR检测方法。方法选择SFV-1、SFV-3、SFVCPZ前病毒序列的pol基因同源性较高的区域设计嵌套引物对SFV-1毒种进行RT-nestedPCR扩增并克隆测序,以确定其准确性,通过验证方法的特异性和敏感性,初步应用该方法对恒河猴外周血淋巴细胞(PBLs),常用猴肾传代细胞及猴源性生物制品进行检测。结果经RT-nestedPCR扩增出的片断与SFV-1 cDNA序列同源性达到99%,对10只恒河猴的检测结果为5只阳性,5只阴性,对常用猴肾传代细胞及脊髓灰质炎疫苗的检测结果均为阴性。结论所建立的SFV RT-nestedPCR检测方法能准确的检测出恒河猴SFV的感染情况,对控制实验猴群的质量具有重要意义。该方法可用于检测猴源性生物制品中SFV的污染情况,为保证生物制品应用的安全性提供一定依据。 展开更多
关键词 猴泡沫病毒 逆转录-巢式pcr 外周血淋巴细胞
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机场道面承载能力ACR-PCR评价方法及其改进方向
12
作者 袁捷 李杰 +2 位作者 马鲁宽 凌建明 姜昌山 《同济大学学报(自然科学版)》 北大核心 2026年第2期255-263,共9页
道面承载能力评价是保障飞机安全运行的重要工作之一。在回顾飞机分类号-道面分类号(aircraft classification number-pavement classification number,ACN-PCN)评价方法基本原理并总结其局限性的基础上,阐述了飞机分类等级-道面分类等... 道面承载能力评价是保障飞机安全运行的重要工作之一。在回顾飞机分类号-道面分类号(aircraft classification number-pavement classification number,ACN-PCN)评价方法基本原理并总结其局限性的基础上,阐述了飞机分类等级-道面分类等级(aircraft classification rating-pavement classification rating,ACR-PCR)评价方法的优化内容;明确了ACR和PCR的计算方法,并通过算例对比分析了2种方法,同时提出了改进方向。结果表明,ACR-PCR评价方法优化了标准道面结构、当量单轮胎压等参数,更新了道面结构破坏模式的控制准则及力学响应计算方法,实现了与现行设计方法的统一;ACR值不能简单地用10倍的ACN值表示,并且ACR-PCR评价方法对刚性道面承载能力提出了更高要求;建议在优化标准结构的基础上,提出针对无机结合料稳定类基层道面的ACR计算方法以及刚性道面上加铺层复合道面承载能力ACR-PCR评价方法。 展开更多
关键词 机场工程 机场道面 承载能力 ACR-pcr评价方法
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RT-nestedPCR和限制性酶切分析用于HV的检测和基因分型
13
作者 韦三华 白雪帆 +2 位作者 陈红梅 潘蕾 李光玉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期448-450,共3页
为建立检测肾综合征出血热 (HFRS)患者血清中汉坦病毒 (HV)基因的RT nestedPCR方法 ,并进一步进行限制性酶切分型 ,设计并合成互补于HVS基因片段的引物 ,对 78例HFRS患者血清进行RT nestedPCR检测 ,并对PCR产物进行酶切分析。结果显示 ... 为建立检测肾综合征出血热 (HFRS)患者血清中汉坦病毒 (HV)基因的RT nestedPCR方法 ,并进一步进行限制性酶切分型 ,设计并合成互补于HVS基因片段的引物 ,对 78例HFRS患者血清进行RT nestedPCR检测 ,并对PCR产物进行酶切分析。结果显示 ,阳性率分别为 76 % (≤ 7天 )、6 7% (8～ 14天 )、43% (15～2 1天 )和 2 9% (>2 1天 )。 48例检测阳性患者PCR产物酶切分型 ,47例为Ⅰ型 ,1例为Ⅱ型。提示RT nestedPCR用于早期HFRS患者的HV基因检测 ,具有直接、敏感、特异等优点 。 展开更多
关键词 肾综合征性出血热 聚合酶链反应 限制性酶切分析 基因分型
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基于直接PCR的转基因种子纯度快速检测方法
14
作者 翟杉杉 李俊 +4 位作者 肖芳 李允静 武玉花 高鸿飞 吴刚 《中国油料作物学报》 北大核心 2026年第1期168-181,共14页
种子纯度检测对于保证种子质量,提高作物产量具有重要意义。建立快速、准确、低成本的转基因种子纯度检测技术将为推进生物育种产业化发展提供有力支撑。本研究基于直接PCR技术提出了一种转基因种子纯度快速检测方案,包括:(1)利用自主... 种子纯度检测对于保证种子质量,提高作物产量具有重要意义。建立快速、准确、低成本的转基因种子纯度检测技术将为推进生物育种产业化发展提供有力支撑。本研究基于直接PCR技术提出了一种转基因种子纯度快速检测方案,包括:(1)利用自主研发的快速提取试剂,在常温下实现单粒种子研磨、提取同步进行,2分钟内一步式实现核酸提取,提取液无需纯化、直接作为模板进行实时荧光PCR扩增;(2)配制PCR反应体系;(3)样品分板;(4)高通量检测;(5)种子纯度计算。利用本方法对3种转基因大豆中黄6106、DBN9004、SHZD3201种子样品进行纯度检测,15份样品从制样到结果鉴定一个工作日内全部完成。该方法简化了现有纯度检测技术的操作步骤,显著缩短了分析时间,为转基因种子纯度检测提供了一种可靠的单粒快速检测新方法。 展开更多
关键词 转基因种子 纯度检测 DNA快速提取 直接pcr
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槲树不同器官及盐胁迫下qRT-PCR的内参基因筛选及验证
15
作者 蒋萌 白晓宁 +4 位作者 王文波 赵亚洲 胡增辉 苏淑钗 冷平生 《中南林业科技大学学报》 北大核心 2026年第1期211-220,234,共11页
[目的]筛选在不同器官及盐胁迫下表达稳定的槲树内参基因,验证所选内参基因在qRT-PCR中的适用性和稳定性,为精准评价槲树目标基因表达量提供理论依据。[方法]从槲树盐胁迫转录组中筛选出10个高表达传统管家基因作为候选内参基因(TUBA、T... [目的]筛选在不同器官及盐胁迫下表达稳定的槲树内参基因,验证所选内参基因在qRT-PCR中的适用性和稳定性,为精准评价槲树目标基因表达量提供理论依据。[方法]从槲树盐胁迫转录组中筛选出10个高表达传统管家基因作为候选内参基因(TUBA、TUBA、GAPDH、Actin、EIF2B5、UBE2W、ADCK、EEF1B、UBE2J1和EIF5A),采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件和ΔCt程序对候选基因在槲树中的表达稳定性进行分析。以槲树6个器官(根、茎、叶、叶芽、花序、种子)及盐胁迫下4个不同处理时期(CK、3 h、24 h、96 h)的叶片为样品,通过qRT-PCR技术,结合候选内参基因,验证过氧化氢酶基因QdCAT2在槲树不同器官及盐胁迫下的表达模式以及候选内参基因的表达稳定性。[结果]10个候选内参基因中,EIF5A和UBE2W的表达稳定性最高,综合排名位居前列,EIF2B5为最不稳定内参基因。QdCAT2基因在槲树叶片中表达量最高,且随着盐胁迫时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势,在处理3 h后达到高峰,使用EIF5A、UBE2W及EIF5A+UBE2W组合作为内参基因得到的相对表达结果基本一致,表明EIF5A和UBE2W为槲树各器官及盐胁迫最适合的内参基因。[结论]成功筛选出了2个稳定内参基因,并验证了EIF5A、UBE2W及EIF5A+UBE2W组合均适合作为槲树不同器官及盐胁迫下qRT-PCR的内参基因,为槲树不同器官及盐胁迫下基因表达分析提供了参考,并为后续槲树分子生物学研究奠定理论基础。 展开更多
关键词 槲树 实时荧光定量pcr 内参基因筛选 盐胁迫 表达分析
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基于边缘无浆体msp4基因的PCR检测方法的建立及应用
16
作者 廖培淇 朱子奇 +4 位作者 苏中华 甘富斌 李俊强 陈远才 张龙现 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期77-82,共6页
为建立特异、敏感、快速的边缘无浆体PCR检测方法,以其msp4基因的保守区为靶标设计一对特异性引物。优化PCR反应条件后,进行了敏感性、特异性、重复性试验及临床样品检测。结果显示,所建立的方法能够特异性检测边缘无浆体核酸,而与其他... 为建立特异、敏感、快速的边缘无浆体PCR检测方法,以其msp4基因的保守区为靶标设计一对特异性引物。优化PCR反应条件后,进行了敏感性、特异性、重复性试验及临床样品检测。结果显示,所建立的方法能够特异性检测边缘无浆体核酸,而与其他动物常见血液原虫无交叉反应;该方法的检测下限为380 fg/μL,拷贝数为126拷贝/反应;批内、批间试验结果表明,该方法具有良好的重复性和稳定性;对120份牦牛血液临床样本检测结果表明,该方法检测边缘无浆体阳性率为54.1%(65/120),高于文献报道方法检测结果37.5%(45/120),表明该方法具有良好的敏感性和准确性。成功建立了一种敏感、特异、快速的边缘无浆体PCR检测方法,为我国牛无浆体病的流行病学调查和诊断防控提供了技术支撑。 展开更多
关键词 边缘无浆体 msp4基因 pcr 牛无浆体病
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暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交F_(1)代的荧光PCR鉴定技术的建立
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作者 赵昕 车帅 +4 位作者 王焕 孙侦龙 尤颖哲 柳淑芳 庄志猛 《渔业科学进展》 北大核心 2026年第1期37-47,共11页
暗纹东方鲀(Takifugu obscurus♀)×红鳍东方鲀(T.rubripes♂)的杂交F_(1)代具备双亲诸多优良性状,市场前景较好。但杂交F_(1)代的形态特征与其亲本难以区分,为河鲀种质资源保护和开发利用带来了困扰,迫切需要开发有效的分子鉴定方... 暗纹东方鲀(Takifugu obscurus♀)×红鳍东方鲀(T.rubripes♂)的杂交F_(1)代具备双亲诸多优良性状,市场前景较好。但杂交F_(1)代的形态特征与其亲本难以区分,为河鲀种质资源保护和开发利用带来了困扰,迫切需要开发有效的分子鉴定方法对杂交F_(1)代及其亲本进行精准判别。为实现杂交F_(1)代及其亲本的快速准确鉴定,本研究根据核基因SH3PX3多态性SNP位点,设计荧光PCR扩增引物及探针,优化了荧光PCR参数,建立了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交F_(1)代的荧光PCR鉴定方法,并对该方法进行了验证。结果显示:杂交F_(1)代的COI序列与母本暗纹东方鲀的序列相似度为100%,在NJ进化树中聚为一支,无法实现杂交F_(1)代和母本的区分;SH3PX3基因荧光PCR体系最佳退火温度为48℃;荧光PCR扩增后,暗纹东方鲀仅FAM通道有Ct值,ΔCt值大于20,红鳍东方鲀FAM信号通道比HEX通道的Ct值高2~5,杂交F_(1)代的FAM通道与HEX通道的Ct值接近,二者之差小于2;基于上述方法对17份暗纹东方鲀、21份红鳍东方鲀和53份杂交F_(1)代样品进行验证,鉴定准确率为100%。本研究建立的荧光PCR鉴定方法不仅具有结果准确、易判读等优点,还避免了测序等繁琐流程,可实现高通量检测,显著提高了检测效率,为河鲀种质资源鉴定与保护、杂交育种和遗传多样性研究提供了技术支持。 展开更多
关键词 暗纹东方鲀 红鳍东方鲀 杂交F_(1)代 SH3PX3基因 荧光pcr 物种鉴定
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猪圆环病毒2型微滴数字PCR检测方法的建立及临床应用
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作者 刘武函 唐小明 +8 位作者 彭志 张坤 谢怡灵 范仲鑫 王卫国 尚玲 张梦凡 杨青 胡巧云 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2026年第1期120-125,共6页
为建立一种特异性强、敏感性高、重复性好的猪圆环病毒2型(PCV-2)微滴数字PCR检测方法,试验基于PCV-2 ORF1保守区域设计引物和探针,通过优化引物浓度、探针浓度和退火温度及特异性、敏感性和重复性试验建立微滴数字PCR方法,并采用该方法... 为建立一种特异性强、敏感性高、重复性好的猪圆环病毒2型(PCV-2)微滴数字PCR检测方法,试验基于PCV-2 ORF1保守区域设计引物和探针,通过优化引物浓度、探针浓度和退火温度及特异性、敏感性和重复性试验建立微滴数字PCR方法,并采用该方法对90份临床样本进行检测。结果表明:建立的PCV-2微滴数字PCR检测方法的最佳引物和探针浓度分别为18μmol/L和9μmol/L,退火温度为61℃;能特异性检出PCV-2,与多种常见猪病原[猪圆环病毒3型(PCV-3)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)]无交叉反应;最低检测限为3.48 copies/μL;重复性试验中扩增后的拷贝数组内与组间变异系数范围分别在0.91%~6.13%和1.44%~8.53%之间,均小于10%。90份临床样本中,建立的微滴数字PCR方法检出PCV-2阳性样本43份,检出率为47.78%,经统计微滴数字PCR方法检出的阳性样本包含了实时荧光定量PCR方法检出的所有阳性样本,与实时荧光定量PCR方法的符合率为88.89%。说明本研究建立的PCV-2微滴数字PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,适用于临床样本(特别是低病毒载量样本)的检测。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 微滴数字pcr 病毒检测 检测方法 特异性试验 敏感性试验 重复性试验
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奶牛乳腺炎致病菌三重qPCR检测方法的建立
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作者 康新华 赵雯 牛琼 《中国牛业科学》 2026年第1期29-37,共9页
为建立奶牛乳腺炎主要致病菌的快速检测方法,选择大肠埃希氏菌(Escherichia coli)phoA基因、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)mdh基因、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)femA基因以及内标基因ACtB的保守区序列设计合成特异性... 为建立奶牛乳腺炎主要致病菌的快速检测方法,选择大肠埃希氏菌(Escherichia coli)phoA基因、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)mdh基因、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)femA基因以及内标基因ACtB的保守区序列设计合成特异性引物探针,建立了奶牛乳腺炎大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的三重荧光PCR检测方法。该方法可特异性检出3种常见的奶牛乳腺炎致病菌,与无乳链球菌、停乳链球菌、牛支原体、沙门氏菌等常见病原无交叉反应,特异性强;对phoA、mdh和femA的最低检出限分别为16.9、16.7和20.4拷贝/μL,且组内和组间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。用该方法对90份奶牛乳腺炎生乳样本进行检测,检测结果与单一荧光PCR方法一致。表明所建立的奶牛乳腺炎大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌三重荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的特点,适用于奶牛乳腺炎的临床诊断检测。 展开更多
关键词 奶牛乳腺炎 大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯菌 金黄色葡萄球菌 三重荧光qpcr
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弓形虫和钩端螺旋体双重荧光定量PCR方法的建立
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作者 栾扬 张亚 +5 位作者 李志敏 王蕾 毕振威 钱晶 熊富强 谭业平 《中国动物检疫》 2026年第1期118-123,130,共7页
为建立快速准确的弓形虫和钩端螺旋体检测方法,以弓形虫529 bp重复序列和钩端螺旋体LigB基因保守区域为靶标分别设计特异性引物和TaqMan MGB探针,进行双重荧光定量PCR反应体系和条件优化以及敏感性、特异性、重复性试验和临床样品检测... 为建立快速准确的弓形虫和钩端螺旋体检测方法,以弓形虫529 bp重复序列和钩端螺旋体LigB基因保守区域为靶标分别设计特异性引物和TaqMan MGB探针,进行双重荧光定量PCR反应体系和条件优化以及敏感性、特异性、重复性试验和临床样品检测。结果显示,该方法对弓形虫核酸检测限为1 copy/μL,钩端螺旋体核酸检测限为10 copies/μL;可特异性检测弓形虫和钩端螺旋体,与犬细小病毒、犬腺病毒II型、猫疱疹病毒、隐孢子虫、猫细小病毒等病原核酸无交叉反应;组内变异系数小于3.16%,组间的变异系数小于2.23%;临床样品检测验证该方法阳性检出率高于普通PCR方法,两种方法具有良好一致性。结果表明,所建立的双重荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特性,可用于弓形虫和钩端螺旋体临床检测。 展开更多
关键词 弓形虫 钩端螺旋体 荧光定量pcr
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