[目的]本研究旨在探究树莓果肉多糖RPP-1的体外免疫活性,并结合转录组学初步分析RPP-1免疫调节的作用机制。[方法]以来源于树莓果肉的多糖组分RPP-1为试验材料,分别采用CCK-8法和荧光探针法测定RPP-1对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活力和...[目的]本研究旨在探究树莓果肉多糖RPP-1的体外免疫活性,并结合转录组学初步分析RPP-1免疫调节的作用机制。[方法]以来源于树莓果肉的多糖组分RPP-1为试验材料,分别采用CCK-8法和荧光探针法测定RPP-1对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活力和吞噬能力的影响,利用RT-qPCR和ELISA分别从转录和蛋白质水平检测RPP-1对RAW264.7细胞上清液中NO和细胞因子的作用。同时,采用转录组学对差异表达基因(differentially expressed genes,DEG)进行基因本体(gene ontology,GO)功能注释、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析。[结果]RPP-1能显著促进小鼠巨噬细胞RAW264.7的活力和吞噬能力,并明显增强细胞培养上清液中的NO、IL-6、IL-1β和TNF-α水平,提高iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的相对表达水平,显示出较强的体外免疫增强作用。转录组学分析发现,与空白组相比,经RPP-1处理的RAW264.7细胞中共有286个与免疫调节相关的DEG,其中111个DEG下调,175个DEG上调;GO功能注释结果表明这些DEG主要参与细胞过程、生物调节、代谢过程、发育过程和免疫系统过程;KEGG富集分析结果显示差异基因显著富集于系统性红斑狼疮、细胞因子-细胞因子受体相互作用和TNF信号通路;PPI网络分析发现枢纽基因为IL-6、IL-1β、Rad51ap1、H2afx、Birc5、Ccl5和Pbk。[结论]树莓果肉多糖RPP-1对小鼠巨噬细胞RAW264.7具有免疫增强作用,结合体外活性试验与转录组学分析结果,RPP-1的免疫增强作用可能通过细胞因子-细胞因子受体相互作用及TNF信号传导途径调节实现,且其关键基因为IL-6、IL-1β。展开更多
背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供...背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。展开更多
文摘[目的]本研究旨在探究树莓果肉多糖RPP-1的体外免疫活性,并结合转录组学初步分析RPP-1免疫调节的作用机制。[方法]以来源于树莓果肉的多糖组分RPP-1为试验材料,分别采用CCK-8法和荧光探针法测定RPP-1对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活力和吞噬能力的影响,利用RT-qPCR和ELISA分别从转录和蛋白质水平检测RPP-1对RAW264.7细胞上清液中NO和细胞因子的作用。同时,采用转录组学对差异表达基因(differentially expressed genes,DEG)进行基因本体(gene ontology,GO)功能注释、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析。[结果]RPP-1能显著促进小鼠巨噬细胞RAW264.7的活力和吞噬能力,并明显增强细胞培养上清液中的NO、IL-6、IL-1β和TNF-α水平,提高iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的相对表达水平,显示出较强的体外免疫增强作用。转录组学分析发现,与空白组相比,经RPP-1处理的RAW264.7细胞中共有286个与免疫调节相关的DEG,其中111个DEG下调,175个DEG上调;GO功能注释结果表明这些DEG主要参与细胞过程、生物调节、代谢过程、发育过程和免疫系统过程;KEGG富集分析结果显示差异基因显著富集于系统性红斑狼疮、细胞因子-细胞因子受体相互作用和TNF信号通路;PPI网络分析发现枢纽基因为IL-6、IL-1β、Rad51ap1、H2afx、Birc5、Ccl5和Pbk。[结论]树莓果肉多糖RPP-1对小鼠巨噬细胞RAW264.7具有免疫增强作用,结合体外活性试验与转录组学分析结果,RPP-1的免疫增强作用可能通过细胞因子-细胞因子受体相互作用及TNF信号传导途径调节实现,且其关键基因为IL-6、IL-1β。
