目的建立可检测早期区域1A(early region 1A,E1A)蛋白和猿猴病毒40大T抗原(simian virus 40 large T anti-gen,SV40LTA)残留DNA的质粒参考品,并探索基于数字PCR法对质粒参考品拷贝数标定的分析技术,从而准确定量质粒参考品,为生物制品...目的建立可检测早期区域1A(early region 1A,E1A)蛋白和猿猴病毒40大T抗原(simian virus 40 large T anti-gen,SV40LTA)残留DNA的质粒参考品,并探索基于数字PCR法对质粒参考品拷贝数标定的分析技术,从而准确定量质粒参考品,为生物制品中宿主DNA残留检测提供新的思路。方法构建质粒pUC19-E1A-SV40LTA,全基因合成后进行扩增,以得到足够的质粒参考品;采用数字PCR仪,分别用E1A和SV40LTA引物探针体系的双荧光通道对其进行拷贝数检测;将数字PCR标定拷贝数的参考品应用于qPCR中,建立检测E1A和SV40LTA特定序列的方法。对建立的qPCR体系进行质粒参考品线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性验证,并应用建立的qPCR体系对重组腺病毒(recombinant adenovirus,rAdV)、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)样本进行检测。结果用数字PCR双荧光通道检测质料参考品的E1A和SV40LTA靶点的拷贝数基本一致,其中用E1A引物探针体系检测值为3.55×10^(9)copies/μL,SV40LTA引物探针体系检测值为3.48×10^(9)copies/μL,这两种检测值的变异系数(CV)为1.42%,取平均值3.51×10^(9)copies/μL作为数字PCR的标定值。用数字PCR标定拷贝数建立的qPCR体系线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性良好,检测rAdV、rAAV样本的回收率均在70%130%之间。结论建立了可检测生物制品中E1A和SV40LTA残留的质粒参考品,并引入了更为灵敏和准确的数字PCR方法对其进行定量。该参考品可应用于以HEK293、HEK293T为宿主细胞生产的基因治疗产品中E1A和SV40LTA残留DNA检测。展开更多
文摘目的建立可检测早期区域1A(early region 1A,E1A)蛋白和猿猴病毒40大T抗原(simian virus 40 large T anti-gen,SV40LTA)残留DNA的质粒参考品,并探索基于数字PCR法对质粒参考品拷贝数标定的分析技术,从而准确定量质粒参考品,为生物制品中宿主DNA残留检测提供新的思路。方法构建质粒pUC19-E1A-SV40LTA,全基因合成后进行扩增,以得到足够的质粒参考品;采用数字PCR仪,分别用E1A和SV40LTA引物探针体系的双荧光通道对其进行拷贝数检测;将数字PCR标定拷贝数的参考品应用于qPCR中,建立检测E1A和SV40LTA特定序列的方法。对建立的qPCR体系进行质粒参考品线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性验证,并应用建立的qPCR体系对重组腺病毒(recombinant adenovirus,rAdV)、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)样本进行检测。结果用数字PCR双荧光通道检测质料参考品的E1A和SV40LTA靶点的拷贝数基本一致,其中用E1A引物探针体系检测值为3.55×10^(9)copies/μL,SV40LTA引物探针体系检测值为3.48×10^(9)copies/μL,这两种检测值的变异系数(CV)为1.42%,取平均值3.51×10^(9)copies/μL作为数字PCR的标定值。用数字PCR标定拷贝数建立的qPCR体系线性、准确性、定量限、精密性、特异性、适用性、稳定性良好,检测rAdV、rAAV样本的回收率均在70%130%之间。结论建立了可检测生物制品中E1A和SV40LTA残留的质粒参考品,并引入了更为灵敏和准确的数字PCR方法对其进行定量。该参考品可应用于以HEK293、HEK293T为宿主细胞生产的基因治疗产品中E1A和SV40LTA残留DNA检测。
