为建立禽源鹦鹉热衣原体临床快速、准确的诊断方法,本研究针对禽源鹦鹉热衣原体外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)基因的保守区域设计特异性引物,建立了普通PCR、套式PCR和qPCR三种检测方法。通过对比三种检测方法的特异性、灵...为建立禽源鹦鹉热衣原体临床快速、准确的诊断方法,本研究针对禽源鹦鹉热衣原体外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)基因的保守区域设计特异性引物,建立了普通PCR、套式PCR和qPCR三种检测方法。通过对比三种检测方法的特异性、灵敏性、重复性以及临床样品的阳性检出率,发现三种PCR检测方法的重复性均良好,组内与组间变异系数低;与其它常见家禽病原体无交叉反应,特异性较强;建立的qPCR检测方法灵敏性较高,最低检测限度为1.20×101拷贝/μL,分别比套式PCR和普通PCR的灵敏性高10倍和100倍;对72份临床样品进行平行检测,普通PCR、套式PCR和qPCR的阳性样品检出率分别为4.16%(3/72)、48.61%(35/72)和61.11%(44/72)。因此,通过对比三种PCR检测方法,发现qPCR检测方法更适用于禽源鹦鹉热衣原体的临床快速准确诊断和流行病学调查。展开更多
为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和p...为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和pMD19-T-gE为模板,采用方阵法优化各反应条件,初步建立了检测IBRV的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法,并建立荧光定量PCR标准曲线。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛肠道病毒(BEV)和牛流行热病毒(BEFV)等RNA反转录所得cDNA及IBRV基因组DNA为模板,采用本研究建立的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法检测,评估所建方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(108~101)的pMD19-T-gB和pMD19-T-gE质粒标准品作为模板,利用本研究建立的两种方法与普通PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以3个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-gB作为模板,利用TB Green I qPCR方法分别于同一时间和不同时间进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。标准曲线结果显示,质粒标准品pMD19-T-gB在5.54×10^(8)拷贝/μL~5.54×10^(1)拷贝/μL范围内与其Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2=0.999,溶解曲线为单一峰。特异性试验结果显示,所建立的两种方法仅能检出IBRV,其他病毒均为阴性结果,特异性强。敏感性试验结果显示,所建立的TB Green I qPCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gB的检测限为55.4拷贝/μL;Nano PCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gE的检测限为4.28×10^(3)拷贝/μL,所建立两种方法的敏感性均较高。重复性试验结果显示,该qPCR方法批内、批间重复性试验的变异系数在0.16%~0.67%,重复性较好。采用本实验建立的两种方法和普通PCR方法对延边地区采集的50份疑似IBRV感染的样品进行检测,结果显示,普通PCR对样品的阳性检测率为84%(42/50),Nano PCR对样品的阳性检测率为90%(45/50),qPCR对样品的阳性检测率为92%(46/50),3种检测方法的总符合率均高于85%。本研究建立的qPCR方法对样品的阳性检出率最高、特异性更强,为临床样品的快速检测及相应疾病早期诊断的首选;Nano PCR次之。本实验首次同时建立并比较了用于IBRV检测的TB Green I qPCR方法与Nano PCR方法,且首次对延边地区的IBRV流行病学作了初步调查,为牛养殖业和疫病防控工作提供技术支撑和参考依据。展开更多
仙人掌X病毒(cactuSviruSX,CVX)严重威胁世界火龙果产业的发展。为实现对该病毒的定量检测,本研究根据CVX外壳蛋白(CP)的保守序列设计特异性引物CVX-F/-R,建立了引物浓度150 nmol/L,退火温度62℃的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法...仙人掌X病毒(cactuSviruSX,CVX)严重威胁世界火龙果产业的发展。为实现对该病毒的定量检测,本研究根据CVX外壳蛋白(CP)的保守序列设计特异性引物CVX-F/-R,建立了引物浓度150 nmol/L,退火温度62℃的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该引物扩增效率为97.38%,R^(2)为0.9965,对标准品的检测极限浓度为8×10^(2)拷贝/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍。对火龙果不同组织中CVX的相对表达量进行检测发现,病毒在花丝中的含量最高,之后依次为花萼、花瓣、嫩枝、老枝和根。对采自贵州黔南州的40份火龙果样品进行检测,共检测出32份阳性样品。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR特异性强、灵敏度高,为今后CVX的检测提供了重要的技术补充。展开更多
目的建立炭疽芽孢杆菌的微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet digital PCR,ddPCR)方法对炭疽芽孢杆菌实验室活动污染的定量评估提供技术支持。方法以炭疽芽孢杆菌pXO1质粒编码保护性抗原pagA基因为靶序列,优化微滴数字PCR方法的反应条件,...目的建立炭疽芽孢杆菌的微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet digital PCR,ddPCR)方法对炭疽芽孢杆菌实验室活动污染的定量评估提供技术支持。方法以炭疽芽孢杆菌pXO1质粒编码保护性抗原pagA基因为靶序列,优化微滴数字PCR方法的反应条件,建立实验室微环境中炭疽芽孢杆菌核酸定量方法;对比微滴式数字PCR方法和平板计数法的定量评估效果,分析ddPCR的灵敏性、特异性和重复性。结果建立的ddPCR方法最佳引物和探针终浓度分别为900nmol·L^(-1)和250nmol·L^(-1),最佳退火温度为60℃,最佳升降温速度为1℃/s,本方法的最低检测下限为1.12copies·μL^(-1),未发现与常见疫病存在交叉反应,重复性试验的变异系数小于5%。结论本研究中建立的炭疽芽孢杆菌的微滴数字PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,为疫情监测、流行病学调查和实验室污染微环境检测提供重要技术。展开更多
文摘为建立禽源鹦鹉热衣原体临床快速、准确的诊断方法,本研究针对禽源鹦鹉热衣原体外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)基因的保守区域设计特异性引物,建立了普通PCR、套式PCR和qPCR三种检测方法。通过对比三种检测方法的特异性、灵敏性、重复性以及临床样品的阳性检出率,发现三种PCR检测方法的重复性均良好,组内与组间变异系数低;与其它常见家禽病原体无交叉反应,特异性较强;建立的qPCR检测方法灵敏性较高,最低检测限度为1.20×101拷贝/μL,分别比套式PCR和普通PCR的灵敏性高10倍和100倍;对72份临床样品进行平行检测,普通PCR、套式PCR和qPCR的阳性样品检出率分别为4.16%(3/72)、48.61%(35/72)和61.11%(44/72)。因此,通过对比三种PCR检测方法,发现qPCR检测方法更适用于禽源鹦鹉热衣原体的临床快速准确诊断和流行病学调查。
文摘为建立并比较牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的检测方法,本研究基于IBRV gB基因和gE基因的保守序列,分别设计用于检测IBRV的TB Green I荧光定量PCR(qPCR)方法和纳米(Nano)PCR方法的特异性引物,利用本实验构建的重组质粒标准品pMD19-T-gB和pMD19-T-gE为模板,采用方阵法优化各反应条件,初步建立了检测IBRV的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法,并建立荧光定量PCR标准曲线。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛肠道病毒(BEV)和牛流行热病毒(BEFV)等RNA反转录所得cDNA及IBRV基因组DNA为模板,采用本研究建立的TB Green I qPCR方法和Nano PCR方法检测,评估所建方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(108~101)的pMD19-T-gB和pMD19-T-gE质粒标准品作为模板,利用本研究建立的两种方法与普通PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以3个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-gB作为模板,利用TB Green I qPCR方法分别于同一时间和不同时间进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。标准曲线结果显示,质粒标准品pMD19-T-gB在5.54×10^(8)拷贝/μL~5.54×10^(1)拷贝/μL范围内与其Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2=0.999,溶解曲线为单一峰。特异性试验结果显示,所建立的两种方法仅能检出IBRV,其他病毒均为阴性结果,特异性强。敏感性试验结果显示,所建立的TB Green I qPCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gB的检测限为55.4拷贝/μL;Nano PCR方法对重组质粒标准品pMD19-T-gE的检测限为4.28×10^(3)拷贝/μL,所建立两种方法的敏感性均较高。重复性试验结果显示,该qPCR方法批内、批间重复性试验的变异系数在0.16%~0.67%,重复性较好。采用本实验建立的两种方法和普通PCR方法对延边地区采集的50份疑似IBRV感染的样品进行检测,结果显示,普通PCR对样品的阳性检测率为84%(42/50),Nano PCR对样品的阳性检测率为90%(45/50),qPCR对样品的阳性检测率为92%(46/50),3种检测方法的总符合率均高于85%。本研究建立的qPCR方法对样品的阳性检出率最高、特异性更强,为临床样品的快速检测及相应疾病早期诊断的首选;Nano PCR次之。本实验首次同时建立并比较了用于IBRV检测的TB Green I qPCR方法与Nano PCR方法,且首次对延边地区的IBRV流行病学作了初步调查,为牛养殖业和疫病防控工作提供技术支撑和参考依据。
文摘仙人掌X病毒(cactuSviruSX,CVX)严重威胁世界火龙果产业的发展。为实现对该病毒的定量检测,本研究根据CVX外壳蛋白(CP)的保守序列设计特异性引物CVX-F/-R,建立了引物浓度150 nmol/L,退火温度62℃的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该引物扩增效率为97.38%,R^(2)为0.9965,对标准品的检测极限浓度为8×10^(2)拷贝/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍。对火龙果不同组织中CVX的相对表达量进行检测发现,病毒在花丝中的含量最高,之后依次为花萼、花瓣、嫩枝、老枝和根。对采自贵州黔南州的40份火龙果样品进行检测,共检测出32份阳性样品。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR特异性强、灵敏度高,为今后CVX的检测提供了重要的技术补充。
文摘目的建立炭疽芽孢杆菌的微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet digital PCR,ddPCR)方法对炭疽芽孢杆菌实验室活动污染的定量评估提供技术支持。方法以炭疽芽孢杆菌pXO1质粒编码保护性抗原pagA基因为靶序列,优化微滴数字PCR方法的反应条件,建立实验室微环境中炭疽芽孢杆菌核酸定量方法;对比微滴式数字PCR方法和平板计数法的定量评估效果,分析ddPCR的灵敏性、特异性和重复性。结果建立的ddPCR方法最佳引物和探针终浓度分别为900nmol·L^(-1)和250nmol·L^(-1),最佳退火温度为60℃,最佳升降温速度为1℃/s,本方法的最低检测下限为1.12copies·μL^(-1),未发现与常见疫病存在交叉反应,重复性试验的变异系数小于5%。结论本研究中建立的炭疽芽孢杆菌的微滴数字PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,为疫情监测、流行病学调查和实验室污染微环境检测提供重要技术。
