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OPTN基因shRNA真核表达载体的构建及干扰效应的检测
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作者 顾彧 范礼斌 刘晓颖 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2014年第1期1-4,共4页
目的通过构建针对视神经病变诱导基因(OPTN)的shRNA的真核表达载体,并转染HEK293FT细胞,实现对OPTN基因表达的抑制,为进一步研究OPTN蛋白的分子机制奠定基础。方法根据Origene中OPTN基因序列设计并合成能转录shRNA的双链DNA序列,插入真... 目的通过构建针对视神经病变诱导基因(OPTN)的shRNA的真核表达载体,并转染HEK293FT细胞,实现对OPTN基因表达的抑制,为进一步研究OPTN蛋白的分子机制奠定基础。方法根据Origene中OPTN基因序列设计并合成能转录shRNA的双链DNA序列,插入真核表达载体pRFP-C-RS中,构建重组载体pRFP-C-RS-shOPTN。经鉴定正确后转染HEK293FT细胞,荧光显微镜下观察shRNA转染情况,Western blot法检测OPTN蛋白表达,检测其干扰效率;沙门菌感染实验检测沙门菌在细胞内的增殖,进一步检测OPTN蛋白干扰后对OPTN蛋白作为自噬受体功能的影响。结果成功构建了针对OPTN基因的shRNA表达载体,转入HEK293FT细胞72 h之后,pRFP-C-RS-shOPTN表达增强,OPTN蛋白表达受到明显抑制;细胞内的沙门菌感染实验证明OPTN蛋白可以显著抑制沙门菌的增殖。结论靶向OPTN基因的特异性shRNA转染HEK293FT细胞后可抑制OPTN蛋白表达效率达80%以上,可用于OPTN调控自噬的进一步研究,同时自噬调节蛋白OPTN可以显著抑制沙门菌在细胞内的增殖。 展开更多
关键词 RNA干扰 OPTN 沙门菌
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