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α-酮戊二酸钠对CHO-hGPCRc细胞内游离钙离子浓度的影响
1
作者 黄琳仪 朱欣凯 +3 位作者 韩春光 吴芳明 王琼 刘永学 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2007年第1期39-41,共3页
目的:研究α-酮戊二酸钠对CHO-hGPCRc细胞内钙离子浓度的影响,并分析其变化的原因,从功能上进一步鉴定人源G蛋白偶联受体hGPCR c表达细胞的可靠性。方法:将重组表达质粒pcDNA3.1(+)-hGPCRc转染入CHO-K1细胞,经G418(800μg/m l)作用7~10... 目的:研究α-酮戊二酸钠对CHO-hGPCRc细胞内钙离子浓度的影响,并分析其变化的原因,从功能上进一步鉴定人源G蛋白偶联受体hGPCR c表达细胞的可靠性。方法:将重组表达质粒pcDNA3.1(+)-hGPCRc转染入CHO-K1细胞,经G418(800μg/m l)作用7~10 d,挑选、扩增阳性克隆,得到CHO-hGPCR c细胞,再以RT-PCR检测所得细胞内hGPCRc mRNA的表达;然后用不同浓度的α-酮戊二酸钠诱导该细胞,通过激光扫描共聚焦显微镜观察F luo-3标记细胞内钙离子变化,以及细胞外钙离子对其影响。结果:(1)RT-PCR结果表明,所得CHO-hGPCR c细胞能够稳定表达hGPCR c的mRNA;(2)α-酮戊二酸钠可引起细胞内钙离子浓度的变化,表现为钙波动幅度明显增加,并呈浓度依赖性;(3)α-酮戊二酸钠引起的细胞内钙波动,不是细胞外钙离子内流所致,而是细胞内钙库动员的结果。结论:α-酮戊二酸钠为hGPCRc的特异性配基,CHO-hGPCRc细胞能够稳定表达具有功能活性的hGPCRc受体,为进一步开展hGPCRc研究奠定了基础。 展开更多
关键词 hGPCRc α-酮戊二酸钠 钙离子 CHO—hGPCRc 转染 质粒
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孤儿G蛋白偶联受体hGPCRc的亚细胞定位及组织分布 被引量：4
2
作者 袁广胜 潘光堂 +6 位作者 吴芳明 韩春光 黄火高 胡明 盛莉 陈静 刘永学 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期365-369,共5页
利用相关生物信息学软件,对从人结肠组织克隆所得某一孤儿G蛋白偶联受体(orphanGprotein_coupledreceptors ,oGPCRs)成员hGPCRc的氨基酸序列进行分析显示,hGPCRc对应的氨基酸序列组成了七个跨膜区段的结构域,具备GPCR的结构特征;然后,将... 利用相关生物信息学软件,对从人结肠组织克隆所得某一孤儿G蛋白偶联受体(orphanGprotein_coupledreceptors ,oGPCRs)成员hGPCRc的氨基酸序列进行分析显示,hGPCRc对应的氨基酸序列组成了七个跨膜区段的结构域,具备GPCR的结构特征;然后,将hGPCRc之cDNA与绿色荧光载体pEGFP_N1 构建GFP_hGPCRc表达载体,以空白质粒pEGFP_N1 作对照,转染CHO_K1 细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察到空白质粒pEGFP_N1 转染的细胞表达了GFP并均匀分布于整个细胞,而GFP_hGPCRc转染的细胞观察到荧光清晰聚集于细胞膜和各细胞器质膜上,因而hGPCRc蛋白定位于膜上并稳定表达,与软件分析结果相一致;最后,以RT_PCR检测hGPCRc在2 0周龄胎儿重要组织器官及部分成人组织中的表达情况,结果显示hGPCRc在人心、肾、小脑及结肠等组织均有表达,但在肝、大脑、小肠及肌肉等组织里未检测到表达。该表达谱对于进一步认识hGPCRc在胚胎发育中的作用及生理功能提供了线索。 展开更多
关键词 孤儿G蛋白偶联受体 hGPCRc 组织分布 CHO-K1 细胞系 亚细胞定位
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人源受体hGPCRc工程细胞株的建立及其应用 被引量：1
3
作者 袁广胜 刘永学 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期818-822,共5页
目的建立孤儿G蛋白偶联受体(OrphanGproteincoupledreceptors,oGPCRs)配基筛选体系并应用于化合物的筛选。方法利用RTPCR从人结肠组织获得oGPCR成员hGPCRc的氨基酸编码序列,在利用相关软件对hGPCRc的结构特点进行分析的基础上,构建hGPCR... 目的建立孤儿G蛋白偶联受体(OrphanGproteincoupledreceptors,oGPCRs)配基筛选体系并应用于化合物的筛选。方法利用RTPCR从人结肠组织获得oGPCR成员hGPCRc的氨基酸编码序列,在利用相关软件对hGPCRc的结构特点进行分析的基础上,构建hGPCRc之表达载体pcDNA3.1(+)hGPCRc,转染CHOK1细胞获得CHOhGPCR工程细胞株,将不同化合物作用于细胞株,用Fluo3为分子探针检测细胞内钙离子浓度变化,以分析化合物中是否为该受体的特异性配基。结果生物信息学分析得到:hGPCR定位于人染色体13q32.2,对应的氨基酸序列组成了7个跨膜区段的结构域,在进化树上与人源P2Y1受体最亲近,应属于人类GPCR成员;成功得到CHOhGPCRc工程细胞株;所检测化合物作用于细胞株并没有引起胞内钙离子的波动,很可能没有活化hGPCRc。结论hGPCRc是一个与已知人P2Y1最近的成员,但基于CHOhGPCRc工程细胞株的第二信使筛选结果表明,hGPCRc并不被P2Y1的已知配基活化因此很可能属于不同于P2Y1的嘌呤类受体新亚型。 展开更多
关键词 孤儿G蛋白偶联受体 hGPCRc 钙 CHO—K1细胞系 工程细胞株
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