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大规模人群接种重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)的安全性研究
1
作者 颜洁 高立冬 +9 位作者 张淑君 杨彦华 汪春梅 赖玲令 王玉芳 韩啸 陈行 聂勇 祁平平 方明礼 《实用预防医学》 2025年第9期1036-1039,1045,共5页
目的评价接种重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)后的安全性。方法于2022年3月起,在湖南省招募符合标准的≥18岁人群为研究对象。共纳入受试者51344名,接种1-3剂次及加强针重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)后,全程采取被动观察,并主... 目的评价接种重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)后的安全性。方法于2022年3月起,在湖南省招募符合标准的≥18岁人群为研究对象。共纳入受试者51344名,接种1-3剂次及加强针重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)后,全程采取被动观察,并主动观察收集每剂接种后前7 d、第30 d以及末剂接种后第3、6、9、12个月的不良事件,分析不良反应发生率。结果接种重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)后不良事件总发生率分别为9.39%(4823/51344),与研究相关不良反应发生率8.81%(4525/51344)。女性不良反应发生率高于男性(χ^(2)=233.649,P<0.05),51岁及以上人群不良反应发生率低于50岁及以下人群(χ^(2)=63.958,P<0.05)。征集性不良反应发生率8.54%,其中局部、全身不良反应发生率分别为7.43%、1.11%,非征集性不良反应发生率0.27%。不良反应主要为局部反应,包括疼痛、肿胀、瘙痒;全身不良反应以疲劳/乏力、头痛、肌肉痛为主;非征集不良反应以头晕为主。不良反应严重程度以1、2级为主,3级不良反应以疼痛(18例)、发热(12例)为主,无疫苗相关的严重不良事件,无特别关注不良事件。结论重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)接种后安全性良好。 展开更多
关键词 重组新型冠状病毒蛋白疫苗(cho细胞) 不良事件 安全性
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CHO细胞表达基因工程抗体的研究进展
2
作者 邓思棋 朱元源 +5 位作者 徐璐 李芳韬 赵俊杰 刘业兵 邬静 邹兴启 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第4期520-527,共8页
基因工程抗体为肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病等提供了新的治疗途径,具有重要的临床使用价值。该抗体属第三代抗体,通过抗体基因改造、DNA重组和蛋白表达技术,在合适的宿主细胞中转录和翻译而进行生产。它具有可塑性强、制备周期短... 基因工程抗体为肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病等提供了新的治疗途径,具有重要的临床使用价值。该抗体属第三代抗体,通过抗体基因改造、DNA重组和蛋白表达技术,在合适的宿主细胞中转录和翻译而进行生产。它具有可塑性强、制备周期短、操作简单、生产成本低廉等优点。目前,大多数批准上市的治疗性抗体是由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产的,它能提供复杂的翻译后修饰,使抗体药物具备活性和稳定性。在开发抗体药物的过程中,现有的生产平台仍然面临抗体产量低、质量和稳定性不一致、生产成本高等挑战。本文将综述基因工程抗体的类型、CHO细胞以及重组表达载体的设计策略等,旨在优化表达系统,为提高抗体表达量和降低生产成本提供参考,以满足未来日益增长的生物医药需求。 展开更多
关键词 基因工程抗体 cho细胞 重组表达载体 生产力
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CHO细胞培养过程中柠檬酸积累特性研究
3
作者 何永梅 张欣然 +2 位作者 赵亮 谭文松 叶倩 《中国生物工程杂志》 北大核心 2025年第4期15-24,共10页
目的:探究中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary cell,CHO cell)流加培养过程中柠檬酸积累现象及特征,为认识和调控柠檬酸积累奠定基础。方法:以CHO细胞为研究对象,采用实验室前期建立的流加培养工艺,考察流加培养过程中柠檬酸积累特... 目的:探究中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary cell,CHO cell)流加培养过程中柠檬酸积累现象及特征,为认识和调控柠檬酸积累奠定基础。方法:以CHO细胞为研究对象,采用实验室前期建立的流加培养工艺,考察流加培养过程中柠檬酸积累特征,探究培养工艺参数(温度和葡萄糖浓度)对柠檬酸积累的影响,建立关键代谢参数[平均葡萄糖比消耗速率(Q_(Gluc))、乳酸比生成速率(q_(Lac))、抗体比生成速率(q_(p))和三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)的总碳流量]与柠檬酸积累的相关性。结果:温度影响CHO细胞流加培养过程中柠檬酸积累,较低温度(31℃)条件下柠檬酸比生成速率显著增大;葡萄糖浓度对柠檬酸积累过程的影响有限,葡萄糖浓度控制在2~55 mmol/L的范围内不影响柠檬酸积累过程;通过考察多批不同培养工艺参数条件下的柠檬酸积累过程,发现柠檬酸比生成速率与葡萄糖比消耗速率、抗体比生成速率、TCA循环总碳流量呈正相关,与乳酸的比生成速率呈负相关。结论:柠檬酸在细胞外积累可能反映营养物质供给充足,细胞TCA循环代谢旺盛,细胞抗体生产能力增强。 展开更多
关键词 cho细胞 TCA循环 柠檬酸 温度 葡萄糖浓度 抗体生产
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CHO-Reg3a细胞株的构建及抑菌活性检测
4
作者 代爽 秦达 +6 位作者 吴书音 王延涛 李国军 汪登奎 戴秀秀 余丽芸 侯喜林 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第7期115-121,共7页
为了利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞稳定表达再生胰岛衍生蛋白3a(regenerating islet-derived protein 3a, Reg3a),并获得具有抑菌活性的抑菌蛋白,试验先通过PCR扩增Reg3a基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Reg3a-EGFP... 为了利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞稳定表达再生胰岛衍生蛋白3a(regenerating islet-derived protein 3a, Reg3a),并获得具有抑菌活性的抑菌蛋白,试验先通过PCR扩增Reg3a基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Reg3a-EGFP后转染至对数生长期CHO细胞内,通过遗传霉素(G418)筛选阳性细胞,并采用有限稀释法进行单克隆细胞株筛选;随后利用Western-blot对细胞表达产物进行鉴定;最后使用纯化后的蛋白进一步进行抑菌活性试验。结果表明:重核真核表达载体pcDNA3.1-Reg3a-EGFP构建成功,连续传代20次仍正常表达。Western-blot鉴定显示在17.64 ku处有Reg3a特异性条带。纯化的Reg3a蛋白(0.8 mg/mL)可明显抑制产肠毒素性大肠杆菌C83912(ETEC-K99)、产肠毒素性大肠杆菌C83902(ETEC-K88)、产肠毒素性大肠杆菌C83916(ETEC-987p)及金黄色葡萄球菌,且对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好。说明稳定表达Reg3a的CHO细胞株构建成功,且表达的Reg3a具有抑菌活性。 展开更多
关键词 Reg3a cho细胞 真核表达 抑菌活性 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
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UPLC法测定CHO细胞培养液中17种氨基酸的含量及其变化规律
5
作者 周杰 蔡俊 《化学与生物工程》 北大核心 2025年第4期64-68,共5页
采用超高效液相色谱(UPLC)法对CHO细胞培养液中17种氨基酸进行定量分析。结果表明,17种氨基酸色谱分离度均大于1.5,半胱氨酸在2~20μg·mL^(-1)浓度范围内相关系数R^(2)为0.9956,其他16种氨基酸在0.1~20μg·mL^(-1)浓度范围内... 采用超高效液相色谱(UPLC)法对CHO细胞培养液中17种氨基酸进行定量分析。结果表明,17种氨基酸色谱分离度均大于1.5,半胱氨酸在2~20μg·mL^(-1)浓度范围内相关系数R^(2)为0.9956,其他16种氨基酸在0.1~20μg·mL^(-1)浓度范围内相关系数R^(2)均不低于0.9987;方法检出限为0.02~1μg·mL^(-1),定量限为0.1~2μg·mL^(-1);精密度、重复性和稳定性相对标准偏差(RSD)均小于4%,适用于CHO细胞培养液中氨基酸的定量分析。根据CHO细胞培养液中氨基酸的含量变化,可推断酪氨酸、半胱氨酸可能为细胞生长的营养限制性成分,对CHO细胞基础培养基或补料培养基中氨基酸种类及含量的调控具有一定的指导意义。 展开更多
关键词 超高效液相色谱(UPLC) 氨基酸 cho细胞培养液
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CHO细胞基因组内稳定表达位点NW_003624203.1的鉴定
6
作者 谢润锋 朱梦娟 +2 位作者 石宇 陈东锋 徐庆刚 《四川动物》 北大核心 2025年第4期384-394,共11页
通过慢病毒感染CHO-K1细胞,以随机整合方法将ZsGreen1报告基因整合到CHO-K1基因组。经过连续多代的筛选,获得稳定表达ZsGreen1蛋白的重组CHO-K1细胞株。利用TAIL-PCR技术分离ZsGreen1报告基因在CHO-K1基因组内的整合位点,并利用CRISPR/C... 通过慢病毒感染CHO-K1细胞,以随机整合方法将ZsGreen1报告基因整合到CHO-K1基因组。经过连续多代的筛选,获得稳定表达ZsGreen1蛋白的重组CHO-K1细胞株。利用TAIL-PCR技术分离ZsGreen1报告基因在CHO-K1基因组内的整合位点,并利用CRISPR/Cas9技术和Bxb1整合酶系统在该位点定点整合了橙色荧光蛋白mOrange2基因和抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体基因,以验证该位点稳定表达外源蛋白的能力。结果表明,分离的稳定表达位点在CHO-K1细胞基因组NW_003624203.1上,位于616 bp处。定点整合构建的重组细胞在连续60代无血清悬浮培养过程中,能够稳定表达橙色荧光蛋白,并能稳定分泌表达单克隆抗体,培养上清中单克隆抗体含量可达14.9~21.6 mg·L-1。证实NW_003624203.1位点是CHO细胞基因组内的稳定表达位点,为使用位点特异性整合技术构建重组CHO细胞株提供了一种可行的方法。 展开更多
关键词 中国仓鼠卵巢(cho) 稳定表达位点 位点特异性整合 CRISPR/Cas9 Bxb1整合酶
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B-Lynch缝合术与Cho四边形缝合术治疗宫缩乏力性产后出血 疗效 比较 被引量：1
7
作者 吴珊珊 杨晓杰 田雪 《新乡医学院学报》 2025年第6期503-507,512,共6页
目的比较B-Lynch缝合术与Cho四边形缝合术治疗宫缩乏力性产后出血的疗效。方法选择2020年4月至2023年4月焦作市妇幼保健院收治的285例分娩伴宫缩乏力性产后出血患者为研究对象。根据手术方案将患者分为B-Lynch组(n=142)和Cho组(n=143),... 目的比较B-Lynch缝合术与Cho四边形缝合术治疗宫缩乏力性产后出血的疗效。方法选择2020年4月至2023年4月焦作市妇幼保健院收治的285例分娩伴宫缩乏力性产后出血患者为研究对象。根据手术方案将患者分为B-Lynch组(n=142)和Cho组(n=143),Cho组患者采用Cho四边形缝合术治疗,B-Lynch组患者采用B-Lynch缝合术治疗。记录2组患者术中、术后2 h内、术后2~24 h出血量以及手术时间。分别于分娩前、术后12 h,采用全自动凝血分析仪检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)以及纤维蛋白原(FIB)水平。分娩前、术后42 d,采用放射免疫分析法检测血清黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、雌二醇(E 2)水平。记录术后恶露排尽、月经恢复时间。术后6、12个月,采用彩色多普勒超声检测双侧子宫动脉收缩期峰值与舒张末期血流速度比值(S/D)、子宫动脉阻力指数(RI)。观察2组患者产褥感染、宫腔粘连、盆腔炎症等并发症发生情况。结果Cho组患者术中出血量、术后2 h内出血量以及术后2~24 h出血量均显著低于B-Lynch组(P<0.05)。2组患者手术时间、住院时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。分娩前2组患者PT、APTT、TT、FIB水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后12 h,2组患者PT、APTT、TT显著长于分娩前,2组患者FIB水平显著低于分娩前(P<0.05);术后12 h,Cho组患者PT、APTT、TT显著短于B-Lynch组,FIB水平显著高于B-Lynch组(P<0.05)。Cho组患者恶露排尽时间、月经恢复时间显著长于B-Lynch组(P<0.05)。术后6、12个月,2组患者双侧子宫动脉S/D、RI比较差异无统计学意义(P>0.05)。分娩前、术后42 d,2组患者LH、FSH以及E 2水平比较差异无统计学意义(P>0.05);术后42 d,2组患者LH、FSH及E 2水平显著高于分娩前(P<0.05)。Cho组患者并发症发生率为3.50%(5/143),B-Lynch组并发症发生率为1.41%(2/142),2组患者并发症发生率比较差异无统计学意义(χ^(2)=1.339,P=0.247)。结论相较于B-Lynch缝合术,Cho四边形缝合术治疗宫缩乏力性产后出血具有更好的止血效果,有助于纠正患者凝血功能,但会延长恶露排尽、月经恢复时间。 展开更多
关键词 宫缩乏力性产后出血 B-LYNCH缝合术 cho四边形缝合术 止血效果 凝血功能
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基于DOE的重组CHO细胞培养工艺优化
8
作者 张雅婷 王逸如 +2 位作者 焦静雨 高栋 王海彬 《工业微生物》 2025年第3期170-172,共3页
本研究以公司自主构建的CHO-K1重组细胞株为对象,在3 L生物反应器中进行基础及补料培养基的筛选工作。应用Mintab19对降温温度、降温时间、接种密度三个因子进行全析因实验设计,同时对补料策略(补料时间及补料量)进行补充试验,然后以蛋... 本研究以公司自主构建的CHO-K1重组细胞株为对象,在3 L生物反应器中进行基础及补料培养基的筛选工作。应用Mintab19对降温温度、降温时间、接种密度三个因子进行全析因实验设计,同时对补料策略(补料时间及补料量)进行补充试验,然后以蛋白表达量为响应值进行模型分析,结合细胞生长曲线得到最优工艺参数,并通过3 L反应器进行工艺放大与验证。筛选后最优基础及补料培养基为:CD1005、CD1105a、CD1105b;筛选后最优工艺:接种密度为1.5×10^(6)cells/mL,培养温度为37℃→35℃,降温时间为第4天,补料策略为第3、5、7、9、11、13天分别流加5%的补料培养基a和0.5%的补料培养基b。优化后蛋白表达量达5.16 g/L,较原工艺增长19%,细胞比生产速率较原工艺增长17%。本研究显著提高了细胞的蛋白表达量和比生产速率,为后续进一步扩大生产奠定了基础。 展开更多
关键词 cho细胞 实验设计(DOE) 优化 工艺放大
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重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)效力检测的不确定度分析
9
作者 刘炬 张文华 +1 位作者 李洋 倪明 《解放军药学学报》 2025年第1期62-68,共7页
目的分析重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)效力检测的不确定度,寻找主要的不确定度影响因素,为进一步提高相关检测工作的质量提供参考。方法分别采用待测疫苗和疫苗参比品免疫小鼠,14 d后取血清,采用间接酶联免疫分析测定各血清的抗... 目的分析重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)效力检测的不确定度,寻找主要的不确定度影响因素,为进一步提高相关检测工作的质量提供参考。方法分别采用待测疫苗和疫苗参比品免疫小鼠,14 d后取血清,采用间接酶联免疫分析测定各血清的抗体滴度。以待测疫苗和疫苗参比品滴度几何平均值的比值作为待测疫苗的效力检测结果。根据检测方法,进行不确定度来源分析,分别量化各不确定度分量,合成后得到重组新型冠状病毒蛋白疫苗(CHO细胞)效力检测的不确定度。结果通过对不确定度分量的分析和量化得出标准不确定度为0.5,不确定度最大的影响因素是实验动物的个体差异。结论通过实验动物体内试验进行效力检测,通常具有较大不确定度,需要谨慎评估方法和制定限值,以实现对相应药品质量的正确评价,开发体外效力检测替代方法也是提高检测质量的可靠途径。 展开更多
关键词 重组新型冠状病毒蛋白疫苗 cho细胞 疫苗效力检测 不确定度
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CHO跃迁:从普通到卓越
10
作者 吕守升 《企业管理》 2025年第2期42-45,共4页
领英统计数据显示,在中国人力资源从业者中,仅有0.39%的员工能够最终升任首席人力资源官(CHO)。成为CHO已经很难,在这个位置上做出卓越成就更为不易。为了给从业者职业发展提供路径参考,同时给企业提供人才竞争和选拔的科学依据,2022年... 领英统计数据显示,在中国人力资源从业者中,仅有0.39%的员工能够最终升任首席人力资源官(CHO)。成为CHO已经很难,在这个位置上做出卓越成就更为不易。为了给从业者职业发展提供路径参考,同时给企业提供人才竞争和选拔的科学依据,2022年笔者发起“中国CHO研究(CCS)”项目,以深入探索卓越CHO的核心职能和高价值场景。 展开更多
关键词 首席人力资源官 cho 5E模型 高管团队 战略落地 组织变革
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卡前列素氨丁三醇联合改良Cho缝合术对治疗剖宫产产后出血的临床疗效
11
作者 娄春燕 《中国冶金工业医学杂志》 2025年第4期456-457,共2页
目的 本文探讨卡前列素氨丁三醇联合改良Cho缝合术对治疗剖宫产产后出血的临床疗效。方法 选取2022年6月—2023年6月贵阳市修文县百信医院收治的62例剖宫产产后出血产妇,依据随机数字表法将其分为对照组和观察组,每组均为31例。对照组... 目的 本文探讨卡前列素氨丁三醇联合改良Cho缝合术对治疗剖宫产产后出血的临床疗效。方法 选取2022年6月—2023年6月贵阳市修文县百信医院收治的62例剖宫产产后出血产妇,依据随机数字表法将其分为对照组和观察组,每组均为31例。对照组采用卡前列素氨丁三醇注射液治疗,观察组在对照组基础上联合改良Cho缝合术治疗,比较两组临床疗效等指标差异。结果 观察组临床总有效率高于对照组,止血时间、术后2、12 h出血量均少于对照组(均P<0.05)。结论 对于剖宫产产后出血产妇而言,在卡前列素氨丁三醇注射液治疗基础上增加改良Cho缝合术治疗有利于提高临床疗效,减少产后不同时间段的出血量,缩短止血时间。 展开更多
关键词 卡前列素氨丁三醇注射液 剖宫产 产后出血 改良cho缝合术 止血时间
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CHO-K1细胞的fut8及bax基因敲除及其细胞生长特性研究
12
作者 郭彤 金紫洋 吴光昊 《上海医药》 2025年第7期86-90,共5页
目的与方法 :本研究采用CRISPR-Cas9基因编辑方法,对CHO-K1细胞进行岩藻糖基转移酶基因fut8和细胞凋亡相关基因bax改构。结果 :对敲除fut8及bax基因的CHO-K1细胞通过单细胞培养在基因组水平进行鉴定,筛选获得CHO-K1(fut8^(-/-))及CHO-K1... 目的与方法 :本研究采用CRISPR-Cas9基因编辑方法,对CHO-K1细胞进行岩藻糖基转移酶基因fut8和细胞凋亡相关基因bax改构。结果 :对敲除fut8及bax基因的CHO-K1细胞通过单细胞培养在基因组水平进行鉴定,筛选获得CHO-K1(fut8^(-/-))及CHO-K1(bax^(-/-))双等位基因位点敲除的单细胞株。结论 :与野生型CHO-K1细胞相比,改构后的单细胞株生长曲线表明,CHO-K1(bax^(-/-))单细胞株仍可维持较高的活细胞密度,CHO-K1(fut8^(-/-))及CHO-K1(bax^(-/-))的倍增时间低于野生型细胞,可进一步探索作为工程宿主细胞高效表达外源抗体基因。 展开更多
关键词 cho-K1细胞 宿主细胞改造 岩藻糖基转移酶基因fut8 促调亡基因bax CRISPR-Cas9 基因敲除
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阻断细胞凋亡及乳酸代谢途径对CHO细胞鲁棒性及外源蛋白表达的影响 被引量：1
13
作者 陆红 张彤阳 +4 位作者 吕若飞 侯卜琳 范婷文 杨怀义 那杰 《生物工程学报》 北大核心 2025年第8期3098-3109,共12页
中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)是最具代表性的哺乳动物细胞蛋白表达系统,被广泛应用于重组蛋白、疫苗等生物制药领域。然而,由于其易受环境因子、细胞凋亡、代谢抑制物等影响,鲁棒性差,细胞总活细胞密度和单... 中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)是最具代表性的哺乳动物细胞蛋白表达系统,被广泛应用于重组蛋白、疫苗等生物制药领域。然而,由于其易受环境因子、细胞凋亡、代谢抑制物等影响,鲁棒性差,细胞总活细胞密度和单位细胞生产率在很大程度上受到了限制。为提高其鲁棒性及外源蛋白表达效能,本研究利用CRISPR/Cas9技术,通过敲除细胞凋亡基因Bax和Bak及乳酸脱氢酶基因LDHa,阻断了细胞凋亡及乳酸代谢途径。细胞凋亡及单细胞活力检测结果表明,基因敲除的细胞系Bax^(–/–)、Bax-Bak^(–/–)、LDHa-Bax-Bak^(–/–)与野生型细胞CHO-K1相比,其凋亡细胞数量分别减少了22.51%、37.73%、64.12%,抗凋亡能力明显提升;利用星形孢菌素(staurosporine,STS)处理后,其单细胞活力分别提升了30.8%、22.0%、41.1%;利用嘌呤霉素(puromycin,Puro)处理后,其单细胞活力分别提升了26.7%、30.7%、38.8%。为进一步探讨阻断了细胞凋亡及乳酸代谢途径后所获细胞的生产性能,本研究在上述细胞中进行了人组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,tPA)的瞬时表达,结果表明,Bax^(–/–)、Bax-Bak^(–/–)、LDHa-Bax-Bak^(–/–)胞外分泌tPA较野生型细胞CHO-K1分别提高了11.12%、46.18%、63.13%;胞内tPA表达分别提高35.65%、130.00%、192.15%。综上所述,相比于阻断凋亡途径,同时阻断凋亡和乳酸代谢途径,能更好地提高细胞鲁棒性和其生产性能。本研究构建的细胞系有望成为药用多肽等蛋白质药物的递送载体,辅助多种疾病的治疗。 展开更多
关键词 BAX基因 BAK基因 LDHa基因 中国仓鼠卵巢细胞细胞活力 人组织纤溶酶原激活剂
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定点整合β1,4半乳糖基转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶1和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ的CHO工程细胞株构建
14
作者 李仙红 贾润清 +4 位作者 王友亮 漫未玲 朱天昊 阎新龙 林艳丽 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第4期576-585,共10页
对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建... 对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建3个糖基转移酶共同表达的打靶载体,分别是β1,4半乳糖基转移酶(B4GALT1)、α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6GAL1)和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ(GnTⅢ),并利用重组酶介导的盒式交换技术(recombinase-mediated cassette exchange,RMCE)将3个糖基转基因酶基因定点整合到CHO Rosa26位点中。PCR证实了3个糖基转移酶成功定点整合Rosa26位点,qRT-PCR证实3个糖基转移酶的mRNA表达水平均在50000倍以上,蛋白质免疫印迹法证实3个糖基转移酶的蛋白质表达水平均在4倍以上(P<0.001)。成功构建了Rosa26位点定点整合3个糖基转移酶的CHO工程细胞株。 展开更多
关键词 β-1 4半乳糖基转移酶 α-2 6-唾液酸转移酶1 N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ 规律成簇的间隔短回文重复技术 重组酶介导的盒式交换技术 中国仓鼠卵巢细胞
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稳定表达细胞色素P4502B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立及鉴定
15
作者 李靖 陆定艳 +4 位作者 陈帅帅 孙佳 郑林 李勇军 刘亭 《贵州医科大学学报》 CAS 2024年第10期1435-1439,1446,共6页
目的构建稳定表达细胞色素P4502B6(CYP2B6)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法将Flp-In^(TM)CHO细胞分为Flp-In^(TM)CHO组、Flp-In^(TM)CHO空载体组及Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组,通过Lipofectamine2000转染试剂,分别将pcDNA5/FRT空质粒和pcDNA5... 目的构建稳定表达细胞色素P4502B6(CYP2B6)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法将Flp-In^(TM)CHO细胞分为Flp-In^(TM)CHO组、Flp-In^(TM)CHO空载体组及Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组,通过Lipofectamine2000转染试剂,分别将pcDNA5/FRT空质粒和pcDNA5/FRT-CYP2B6重组质粒转染至Flp-In^(TM)CHO空载体组细胞和Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)及荧光素酶实验检测转染细胞中CYP2B6 mRNA水平、蛋白表达水平及活性,用四氮唑盐(MTS)测定转染CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞对环磷酰胺的毒性敏感性。结果与Flp-In^(TM)CHO组和Flp-In^(TM)CHO空载体组相比,Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中CYP2B6的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)、酶活性显著增加(P<0.001),对环磷酰胺的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建稳定表达CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系,为研究药物代谢和筛选毒性药物提供工具。 展开更多
关键词 细胞色素P4502B6 稳定表达 酶活性 环磷酰胺 Flp-In^(TM)cho细胞系
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CHO细胞外源抗体基因拷贝数实时定量PCR检测方法的建立及验证 被引量：2
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作者 张慧 高文丽 +2 位作者 李凤智 胡加亮 李剑 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第1期72-78,共7页
目的 采用SYBR GreenⅠ染料建立实时定量PCR法检测CHO细胞外源抗体轻链(light chain,LC)、重链(heavy chain,HC)基因拷贝数,并进行方法的验证及初步应用。方法 以CHO细胞中稳定表达的B2m(β2-microglobulin)基因作为内参基因,分别设计... 目的 采用SYBR GreenⅠ染料建立实时定量PCR法检测CHO细胞外源抗体轻链(light chain,LC)、重链(heavy chain,HC)基因拷贝数,并进行方法的验证及初步应用。方法 以CHO细胞中稳定表达的B2m(β2-microglobulin)基因作为内参基因,分别设计适宜的LC和HC基因引物及内参基因引物,确定实时定量PCR方法的反应体系和反应程序。对建立的方法进行特异性、线性、精密性及耐用性验证,并采用建立的方法检测重组细胞株工作细胞库(WCB)及不同传代次数细胞中LC和HC基因拷贝数。结果 外源基因与内参基因引物可特异性结合目标片段;B2m、LC、HC基因引物扩增效率分别为106.7%、106.3%和99.1%,线性方程相关系数均大于0.99,具有良好的线性关系;精密性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于1%;短时间内少次冻融对检测结果影响较小。利用建立的方法检测不同代次重组细胞株LC和HC基因拷贝数,未见明显变化。结论 成功建立了CHO细胞外源基因拷贝数实时定量PCR检测方法,该方法特异性、线性、精密性及耐用性良好,为其他CHO细胞株表达的外源基因拷贝数检测提供了参考。 展开更多
关键词 实时定量PCR cho细胞 抗体 轻链 重链 基因拷贝数
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基于多重荧光定量PCR的CHO宿主细胞DNA残留量及片段化程度检测方法的建立及验证
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作者 杨颢 时景景 +2 位作者 周宇荀 李凯 肖君华 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第12期1495-1504,共10页
目的 建立基于多重荧光定量PCR的CHO宿主细胞DNA残留量及片段化程度的检测方法,并进行验证,以期为相关疫苗安全性检测提供可靠的方法。方法 根据CHO细胞Alu序列家族成员clone250和clone49c设计长短2套引物(Alu-L及Alu)及共用探针,同时... 目的 建立基于多重荧光定量PCR的CHO宿主细胞DNA残留量及片段化程度的检测方法,并进行验证,以期为相关疫苗安全性检测提供可靠的方法。方法 根据CHO细胞Alu序列家族成员clone250和clone49c设计长短2套引物(Alu-L及Alu)及共用探针,同时引入辣椒叶UBI3基因作为外标基因,设计相应引物及探针,建立Alu序列与外标基因的多重反应体系,通过多重荧光定量PCR法对样本中CHO细胞DNA残留量进行定量检测,并验证方法的线性范围、定量限、专属性、耐用性、精密性、准确性。另通过比较Alu长短序列扩增曲线的△Ct[Ct(Alu-L)-Ct(Alu)],判断CHO细胞DNA片段化程度。结果 多重反应标准曲线在0.001~0.1 ng/μL浓度范围内,与Ct值呈良好的线性关系,R~2≥0.99,外标基因的加入不影响对CHO靶标的检测能力;方法的定量限为0.5 fg/μL;人类、E.coli、大鼠、小鼠DNA对检测无影响,针对CHO细胞残留DNA的引物探针在7种动物细胞系基因组中无特异性扩增;碎片化DNA样本不影响检测结果;精密性验证变异系数(CV)均<15%;在含1%BSA的生理盐水和PBS 2种溶剂中模拟样本回收率均在70%~130%范围内。Alu长短片段扩增曲线△Ct随样本碎片化程度的升高而增加,拟合曲线R~2≥0.99。结论本研究建立的多重荧光定量PCR检测方法能够快速准确地对CHO细胞残留DNA进行定量,还可根据△Ct判断样本片段化程度,可用于相关疫苗安全性的检测。 展开更多
关键词 宿主细胞残留DNA cho细胞 TAQMAN探针 多重荧光定量PCR法
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市政污泥及其热处理渣对CHO-K1细胞的毒性研究
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作者 顾迪 张晨 +3 位作者 顾卫华 赵静 白建峰 张承龙 《有色金属（冶炼部分）》 CAS 北大核心 2024年第8期166-174,共9页
评估市政污泥资源化产物的健康风险对其安全规范利用具有指导意义。分别对某污水处理厂的污泥进行了热解和好氧发酵处理,运用中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)对市政污泥及其热处理渣开展细胞毒性试验和遗传毒性试验,评估其对典型哺乳动物细胞... 评估市政污泥资源化产物的健康风险对其安全规范利用具有指导意义。分别对某污水处理厂的污泥进行了热解和好氧发酵处理,运用中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)对市政污泥及其热处理渣开展细胞毒性试验和遗传毒性试验,评估其对典型哺乳动物细胞的危害和潜在风险。结果显示,与原污泥样品相比,污泥热解渣和好氧发酵渣的细胞毒性和遗传毒性均降低。与原污泥样品相比,RTCA细胞增殖试验结果显示,污泥热解渣和好氧发酵渣对CHO-K1细胞的生长抑制性明显减弱;CCK-8细胞毒性试验结果显示,污泥热解渣和好氧发酵渣的细胞相对存活率分别增加了161%和137%;Caspase 3细胞凋亡蛋白酶活力试验结果显示,暴露于污泥热解渣和好氧发酵渣中的CHO-K1细胞的Caspase 3凋亡蛋白酶的活性分别降低了29.3%和20.1%;彗星试验结果显示,污泥热解渣和好氧发酵渣的尾长分别缩短了64.5%和25.9%,尾矩分别减少了78.4%和28.1%。研究结果表明,热处理技术(热解处理和好氧发酵处理)可减少市政污泥的细胞毒性和遗传毒性,降低市政污泥对生态环境和人体健康的潜在风险。 展开更多
关键词 污泥热处理 cho-K1细胞 细胞毒性 彗星试验 重金属
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恒稳磁场辅助CHO细胞培养和表达特性研究
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作者 李晓红 李红文 +3 位作者 高丽 张雪艳 杨哪 李荣明 《工业微生物》 CAS 2024年第5期39-43,共5页
以中国仓鼠卵巢细胞为宿主细胞构建重组表达细胞用以表达单克隆抗体,已经被广泛应用于生物制药领域。物理调控是影响细胞增殖和表达的重要方式,但针对恒稳磁场暴露下的CHO细胞培养及其抗体表达还鲜有报道。基于此,文章利用3.0 mT恒稳磁... 以中国仓鼠卵巢细胞为宿主细胞构建重组表达细胞用以表达单克隆抗体,已经被广泛应用于生物制药领域。物理调控是影响细胞增殖和表达的重要方式,但针对恒稳磁场暴露下的CHO细胞培养及其抗体表达还鲜有报道。基于此,文章利用3.0 mT恒稳磁场,在37℃、8%CO_(2)环境下对CHO细胞进行克隆培养,通过克隆扩增筛选、蛋白表达及分析、拷贝数监测等手段来评估其对抗体表达的影响。结果表明,与对照组相比,在3.0 mT磁场环境下,单克隆形成数量增加了13.24%,细胞数量显著增多,单克隆抗体表达水平提升53.2%,克隆筛选周期缩短4~5 d。此外,在亚克隆筛选中,亚克隆的细胞数量和抗体表达在磁场暴露下略有增加,而抗体表达、蛋白质量和基因拷贝数在传代后均无显著变化,表明磁场暴露环境中培养的重组CHO细胞具有稳定的性质。该研究结果有望为未来CHO细胞的大规模培养以及磁场暴露下的高效生产抗体研究提供参考。 展开更多
关键词 cho细胞 恒稳磁场 克隆表达 抗体表达 蛋白质特性
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重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析 被引量：1
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作者 千爱君 萧耿苗 +4 位作者 李壮 梁志成 穆云萍 赵子建 李芳红 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期390-396,共7页
目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,... 目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。 展开更多
关键词 重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白 真核表达 悬浮cho-S细胞 cAMP活性 基因工程 脂代谢
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