目的:分析4例携带血管性血友病因子裂解酶13(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motifs 13,ADAMTS13)去整合素样结构域杂合突变的血栓患者其基因型和表型特征,探讨ADAMTS13功能缺陷与血栓形成之间的关联...目的:分析4例携带血管性血友病因子裂解酶13(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motifs 13,ADAMTS13)去整合素样结构域杂合突变的血栓患者其基因型和表型特征,探讨ADAMTS13功能缺陷与血栓形成之间的关联。方法:通过易栓症基因Panel检测筛查血栓患者的易栓症相关基因突变,纳入4个携带ADAMTS13去整合素样结构域突变的易栓症家系。采用凝固法检测患者的凝血功能,使用免疫比浊法测定血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)抗原和活性,酶联免疫吸附法检测vWF的胶原结合能力。通过十二烷基硫酸钠-琼脂糖凝胶电泳分析vWF多聚体的分布情况并进行灰度值半定量分析。采用荧光共振能量转移法测定血浆中ADAMTS13活性,酶联免疫吸附法检测ADAMTS13抗原水平。使用PyMOL软件对野生型及突变型ADAMTS13蛋白的三维结构进行对比分析。结果:4个家系的先证者均经历不同程度的血栓事件,包括脑静脉窦血栓、肺栓塞及下肢深静脉血栓。ADAMTS13蛋白去整合素样结构域突变约占ADAMTS13单杂合突变的4/87。遗传分析显示,4例先证者均携带ADAMTS13基因去整合素样结构域单杂合突变(p.Pro301Ala、p.Pro301Arg、p.Arg349Cys),其中p.Pro301Ala和p.Pro301Arg为首次报道突变。凝血功能检测结果表明,4例患者ADAMTS13活性和抗原水平显著降低(Act为57.42%~72.88%,Ag为66.94%~78.34%),vWF活性和抗原水平升高(Act为158.2%~213.7%,Ag为167.2%~216.6%)。vWF多聚体电泳分析显示,患者血浆中高分子量多聚体(high-molecular-weight multimers,HMWMs)比例显著增加(灰度值166.6~218.9比117.4),提示HMWMs较正常人明显增多。结构分析进一步表明,突变位点位于ADAMTS13蛋白去整合素样结构域的关键区域,可能破坏蛋白稳定性及与vWF的结合能力。结论:本研究首次报道了位于ADAMTS13蛋白去整合素样结构域上的2个新突变(Pro301Ala和Pro301Arg),并再次验证了已知突变Arg349Cys的致病特性。结果证实这些突变可导致ADAMTS13蛋白表达水平下降,并进一步引起其酶活性的显著降低,表现为对vWF高分子量多聚体的裂解能力减弱,功能试验证实患者体内存在异常增多的vWF多聚体,破坏了ADAMTS13-vWF轴的动态平衡,从而增加血栓形成的风险。展开更多
目的本研究旨在研究和探讨血管性血友病因子（von Willebrand factor，vwF）和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（A disintegrin—like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif，vWF裂解酶，ADAMTS13）...目的本研究旨在研究和探讨血管性血友病因子（von Willebrand factor，vwF）和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（A disintegrin—like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif，vWF裂解酶，ADAMTS13）的活性在感染性休克和脓毒症患者早期及预后评估方面的临床意义。方法选取2012—06—2013—06收住无锡市人民医院ICU的感染性休克或脓毒症患者40例，根据预后分为存活组20例和死亡组20例，记录其一般情况及入组时APACHE11评分，于发病第1、3、5、7天分别运用ELISA法检测其血浆vWF活性及ADAMTS13活性，各样本均数用方差分析、受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析、参数间进行Spearman相关分析，并绘制ROC曲线探讨vWF活性、ADAMTS13活性与APACHE Ⅱ评分之间的相关性。结果死亡组的vWF活性均明显高于存活组（P〈0．05），ADAMTS13活性明显低于存活组（P〈0．05）；同时死亡组APACHEⅡ评分明显高于存活组（P〈0．05）；存活组在第3天vwF活性升高、ADAMTS13活性下降、APACHEⅡ评分升高，而在第5天和第7天又出现vWF活性持续下降、ADAMTS13活性持续升高、APACHEⅡ评分持续下降，死亡组则呈现vWF活性持续上升、ADAMTS13活性持续下降、APACHEⅡ评分持续升高（P〈0．05）。40例患者的平均vWF活性与APACHEⅡ评分呈正相关（P〈0．01），而ADAMTS13活性与APACHEⅡ评分呈负相关（P〈0．01）：ROC曲线分析，vWF活性和ADAMTS13活性AUC均接近于1，提示能很好地预测患者的预后（P〈0．01）。结论vWF活性、ADAMTS13活性均是判断感染性休克和脓毒症患者预后的可靠指标。在脓毒症的病理过程中，此二者数值的变化与疾病严重程度密切相关，即vWF活性的升高、ADAMTS13活性的降低预示了患者预后差。展开更多
微循环障碍参与了多种疾病的进展,例如脓毒症、多器官衰竭等。血管性假性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）可使血小板粘附聚集于血管内皮细胞,导致血小板血栓形成;血管性血友病因子特异性裂解酶（a disintegrin-like and metall...微循环障碍参与了多种疾病的进展,例如脓毒症、多器官衰竭等。血管性假性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）可使血小板粘附聚集于血管内皮细胞,导致血小板血栓形成;血管性血友病因子特异性裂解酶（a disintegrin-like and metalloprotease with thrombo-spondin type I repeats 13,ADAMTSl3）可裂解vWF多聚体，预防血栓形成.展开更多
背景:血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1motif,member 13,ADAMTS13)可结合并酶切血管性血友病因子,在防止血小板过多聚集和血栓的形成中起到关键作用。重组ADAMTS13通常...背景:血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1motif,member 13,ADAMTS13)可结合并酶切血管性血友病因子,在防止血小板过多聚集和血栓的形成中起到关键作用。重组ADAMTS13通常选择在真核细胞中表达分泌,然而对于其表达纯化目前仍缺乏一个明确高效的途径。目的:寻找合适的宿主细胞,得到稳定表达野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的细胞株,建立高纯度ADAMTS13的纯化方法,进而研究其生物学功能。方法:以野生型ADAMTS13重组质粒为模板,利用位点突变试剂盒得到功能增强型ADAMTS13重组质粒。比较CHO-S细胞、CHO-K1细胞、293T细胞对ADAMTS13的表达效果,挑选出合适的宿主细胞。通过Ni柱亲和层析和分子筛纯化蛋白;采用7.5%SDS-PAGE、Western-blot鉴定野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的纯度及特异性;利用原子力显微镜技术检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用,鉴定两种蛋白的活性。结果与结论:相对于CHO-S和CHO-K1,293T细胞更适合作为野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的表达宿主;经Ni柱亲和层析和分子筛纯化后,所得到的野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13质量浓度分别为103.7,149.7 mg/L,且两种蛋白纯度均约90%;原子力显微镜检测结果显示,野生型ADAMTS13、功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的黏附频率分别为11.37%,14.70%,表明功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的结合亲和力更高,这与近期ADAMTS13构象研究一致。展开更多
文摘目的:分析4例携带血管性血友病因子裂解酶13(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motifs 13,ADAMTS13)去整合素样结构域杂合突变的血栓患者其基因型和表型特征,探讨ADAMTS13功能缺陷与血栓形成之间的关联。方法:通过易栓症基因Panel检测筛查血栓患者的易栓症相关基因突变,纳入4个携带ADAMTS13去整合素样结构域突变的易栓症家系。采用凝固法检测患者的凝血功能,使用免疫比浊法测定血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)抗原和活性,酶联免疫吸附法检测vWF的胶原结合能力。通过十二烷基硫酸钠-琼脂糖凝胶电泳分析vWF多聚体的分布情况并进行灰度值半定量分析。采用荧光共振能量转移法测定血浆中ADAMTS13活性,酶联免疫吸附法检测ADAMTS13抗原水平。使用PyMOL软件对野生型及突变型ADAMTS13蛋白的三维结构进行对比分析。结果:4个家系的先证者均经历不同程度的血栓事件,包括脑静脉窦血栓、肺栓塞及下肢深静脉血栓。ADAMTS13蛋白去整合素样结构域突变约占ADAMTS13单杂合突变的4/87。遗传分析显示,4例先证者均携带ADAMTS13基因去整合素样结构域单杂合突变(p.Pro301Ala、p.Pro301Arg、p.Arg349Cys),其中p.Pro301Ala和p.Pro301Arg为首次报道突变。凝血功能检测结果表明,4例患者ADAMTS13活性和抗原水平显著降低(Act为57.42%~72.88%,Ag为66.94%~78.34%),vWF活性和抗原水平升高(Act为158.2%~213.7%,Ag为167.2%~216.6%)。vWF多聚体电泳分析显示,患者血浆中高分子量多聚体(high-molecular-weight multimers,HMWMs)比例显著增加(灰度值166.6~218.9比117.4),提示HMWMs较正常人明显增多。结构分析进一步表明,突变位点位于ADAMTS13蛋白去整合素样结构域的关键区域,可能破坏蛋白稳定性及与vWF的结合能力。结论:本研究首次报道了位于ADAMTS13蛋白去整合素样结构域上的2个新突变(Pro301Ala和Pro301Arg),并再次验证了已知突变Arg349Cys的致病特性。结果证实这些突变可导致ADAMTS13蛋白表达水平下降,并进一步引起其酶活性的显著降低,表现为对vWF高分子量多聚体的裂解能力减弱,功能试验证实患者体内存在异常增多的vWF多聚体,破坏了ADAMTS13-vWF轴的动态平衡,从而增加血栓形成的风险。
文摘目的本研究旨在研究和探讨血管性血友病因子（von Willebrand factor，vwF）和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（A disintegrin—like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif，vWF裂解酶，ADAMTS13）的活性在感染性休克和脓毒症患者早期及预后评估方面的临床意义。方法选取2012—06—2013—06收住无锡市人民医院ICU的感染性休克或脓毒症患者40例，根据预后分为存活组20例和死亡组20例，记录其一般情况及入组时APACHE11评分，于发病第1、3、5、7天分别运用ELISA法检测其血浆vWF活性及ADAMTS13活性，各样本均数用方差分析、受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析、参数间进行Spearman相关分析，并绘制ROC曲线探讨vWF活性、ADAMTS13活性与APACHE Ⅱ评分之间的相关性。结果死亡组的vWF活性均明显高于存活组（P〈0．05），ADAMTS13活性明显低于存活组（P〈0．05）；同时死亡组APACHEⅡ评分明显高于存活组（P〈0．05）；存活组在第3天vwF活性升高、ADAMTS13活性下降、APACHEⅡ评分升高，而在第5天和第7天又出现vWF活性持续下降、ADAMTS13活性持续升高、APACHEⅡ评分持续下降，死亡组则呈现vWF活性持续上升、ADAMTS13活性持续下降、APACHEⅡ评分持续升高（P〈0．05）。40例患者的平均vWF活性与APACHEⅡ评分呈正相关（P〈0．01），而ADAMTS13活性与APACHEⅡ评分呈负相关（P〈0．01）：ROC曲线分析，vWF活性和ADAMTS13活性AUC均接近于1，提示能很好地预测患者的预后（P〈0．01）。结论vWF活性、ADAMTS13活性均是判断感染性休克和脓毒症患者预后的可靠指标。在脓毒症的病理过程中，此二者数值的变化与疾病严重程度密切相关，即vWF活性的升高、ADAMTS13活性的降低预示了患者预后差。
文摘微循环障碍参与了多种疾病的进展,例如脓毒症、多器官衰竭等。血管性假性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）可使血小板粘附聚集于血管内皮细胞,导致血小板血栓形成;血管性血友病因子特异性裂解酶（a disintegrin-like and metalloprotease with thrombo-spondin type I repeats 13,ADAMTSl3）可裂解vWF多聚体，预防血栓形成.
文摘背景:血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1motif,member 13,ADAMTS13)可结合并酶切血管性血友病因子,在防止血小板过多聚集和血栓的形成中起到关键作用。重组ADAMTS13通常选择在真核细胞中表达分泌,然而对于其表达纯化目前仍缺乏一个明确高效的途径。目的:寻找合适的宿主细胞,得到稳定表达野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的细胞株,建立高纯度ADAMTS13的纯化方法,进而研究其生物学功能。方法:以野生型ADAMTS13重组质粒为模板,利用位点突变试剂盒得到功能增强型ADAMTS13重组质粒。比较CHO-S细胞、CHO-K1细胞、293T细胞对ADAMTS13的表达效果,挑选出合适的宿主细胞。通过Ni柱亲和层析和分子筛纯化蛋白;采用7.5%SDS-PAGE、Western-blot鉴定野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的纯度及特异性;利用原子力显微镜技术检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用,鉴定两种蛋白的活性。结果与结论:相对于CHO-S和CHO-K1,293T细胞更适合作为野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的表达宿主;经Ni柱亲和层析和分子筛纯化后,所得到的野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13质量浓度分别为103.7,149.7 mg/L,且两种蛋白纯度均约90%;原子力显微镜检测结果显示,野生型ADAMTS13、功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的黏附频率分别为11.37%,14.70%,表明功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的结合亲和力更高,这与近期ADAMTS13构象研究一致。
