针对传统TUNEL联合普通多重荧光染色法存在的信号弱、多重染色效果差及抗体种属限制等问题,本研究采用酪酰胺信号放大技术(tyramide signal amplification,TSA),对大鼠心肌梗死模型的TUNEL联合免疫荧光多重染色方法进行了改良优化。系...针对传统TUNEL联合普通多重荧光染色法存在的信号弱、多重染色效果差及抗体种属限制等问题,本研究采用酪酰胺信号放大技术(tyramide signal amplification,TSA),对大鼠心肌梗死模型的TUNEL联合免疫荧光多重染色方法进行了改良优化。系统优化TUNEL染色中的关键参数(蛋白酶K浓度:8~15μg/mL;孵育条件:37℃、15 min)及染色顺序,研究结果显示:对比普通荧光染色与TSA荧光染色的性能差异,TSA技术荧光信号强度明显提升,同时保留更完整的细胞形态结构,且突破抗体种属限制;在多重染色流程中,“抗原修复→TSA荧光染色→蛋白酶K消化→TUNEL染色”的顺序方案显著优于另外2种染色流程,其有效性在小鼠结肠肿瘤及皮下瘤模型中均得到验证;优化后的TUNEL-TSA多重荧光标记方法具有信号增强显著、结构完整性高、检测灵敏度与特异性优异和抗体兼容性强等优势。我们的研究为建立标准化原位细胞凋亡相关免疫因子检测体系提供了技术支撑,并具备广阔的临床应用前景。展开更多
橡胶树乳管分化过程中差异表达基因的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是进行基因表达分析的常用技术手段,合适内参基因的选择是准确进行基因表达定量的前提。以组蛋白去乙酰化抑制剂曲...橡胶树乳管分化过程中差异表达基因的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是进行基因表达分析的常用技术手段,合适内参基因的选择是准确进行基因表达定量的前提。以组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)诱导橡胶树次生乳管分化的实验系统,采用qRT-PCR技术分析TSA处理橡胶树萌条及对照内层树皮中22个候选内参基因的表达情况。结果显示:TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,稳定性最高的3个基因分别为UBC3、UBC4和eIF1Aa,而稳定性最差的3个基因分别为ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因为内参,分析组蛋白去乙酰化酶基因HDA1和HDA2在TSA处理下树皮中表达量相对于对照的变化,结果初步证实TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,UBC3是最佳的内参基因,ROC3不适合作为内参基因。展开更多
文摘针对传统TUNEL联合普通多重荧光染色法存在的信号弱、多重染色效果差及抗体种属限制等问题,本研究采用酪酰胺信号放大技术(tyramide signal amplification,TSA),对大鼠心肌梗死模型的TUNEL联合免疫荧光多重染色方法进行了改良优化。系统优化TUNEL染色中的关键参数(蛋白酶K浓度:8~15μg/mL;孵育条件:37℃、15 min)及染色顺序,研究结果显示:对比普通荧光染色与TSA荧光染色的性能差异,TSA技术荧光信号强度明显提升,同时保留更完整的细胞形态结构,且突破抗体种属限制;在多重染色流程中,“抗原修复→TSA荧光染色→蛋白酶K消化→TUNEL染色”的顺序方案显著优于另外2种染色流程,其有效性在小鼠结肠肿瘤及皮下瘤模型中均得到验证;优化后的TUNEL-TSA多重荧光标记方法具有信号增强显著、结构完整性高、检测灵敏度与特异性优异和抗体兼容性强等优势。我们的研究为建立标准化原位细胞凋亡相关免疫因子检测体系提供了技术支撑,并具备广阔的临床应用前景。
文摘橡胶树乳管分化过程中差异表达基因的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是进行基因表达分析的常用技术手段,合适内参基因的选择是准确进行基因表达定量的前提。以组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)诱导橡胶树次生乳管分化的实验系统,采用qRT-PCR技术分析TSA处理橡胶树萌条及对照内层树皮中22个候选内参基因的表达情况。结果显示:TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,稳定性最高的3个基因分别为UBC3、UBC4和eIF1Aa,而稳定性最差的3个基因分别为ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因为内参,分析组蛋白去乙酰化酶基因HDA1和HDA2在TSA处理下树皮中表达量相对于对照的变化,结果初步证实TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,UBC3是最佳的内参基因,ROC3不适合作为内参基因。
