本研究构建了金针菇Flammulina filiformis苯丙氨酸解氨酶基因1(F.filiformis PAL gene1,Fvpal1)的RNAi载体,以黄色的单核体菌株0990-(5)为受体,通过遗传转化获得5个基因沉默的单核转化子(RNAi-Fvpal11–5)。5个单核转化子再分别与白色...本研究构建了金针菇Flammulina filiformis苯丙氨酸解氨酶基因1(F.filiformis PAL gene1,Fvpal1)的RNAi载体,以黄色的单核体菌株0990-(5)为受体,通过遗传转化获得5个基因沉默的单核转化子(RNAi-Fvpal11–5)。5个单核转化子再分别与白色的单核体菌株Dan3进行杂交,获得5个基因沉默的双核转化子(ZRNAi-Fvpal11–5)。考察并分析了单核转化子和双核转化子在PDA培养基上的菌丝生长速度、菌丝的PAL酶活、菌丝在培养基上的色素分泌及Fvpal1基因表达量情况,以验证Fvpal1基因具有调控金针菇颜色的功能。结果显示,10个转化子的Fvpal1基因表达较野生菌株相比都显著下调(P<0.05),其中转化子RNAi-Fvpal11–5分别下调83.41%、75.92%、79.69%、66.49%和43.22%,转化子ZRNAi-Fvpal11–5分别下调80.26%、45.24%、34.09%、84.05%和79.62%;除转化子ZRNAi-Fvpal14外的9个转化子的PAL酶活力都显著低于出发菌株(P<0.05)。10个转化子的菌丝在PDA培养基上的色素分泌都比出发菌株浅,双核转化子的菌丝在木屑培养基中的颜色也显著变浅,以及双核转化子的子实体颜色也比出发菌株浅。本研究构建了金针菇Fvpal1基因的RNAi体系,发现该基因对金针菇菌丝和子实体的颜色具有正调控作用,为进一步开展金针菇Fvpal1基因的功能基因研究提供了数据支撑。展开更多
【目的】目前国内外西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的核酸检测中缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,对检测结果的精确度和可信度造成一定的影响。本研究旨在研制一种安全稳定的WNV核酸检测质控品,为西尼罗热监测提供技术支持。【方法】...【目的】目前国内外西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的核酸检测中缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,对检测结果的精确度和可信度造成一定的影响。本研究旨在研制一种安全稳定的WNV核酸检测质控品,为西尼罗热监测提供技术支持。【方法】将WNV核酸检测靶基因、MS2噬菌体外壳蛋白CP及成熟酶蛋白A基因序列插入到表达载体得到重组质粒pET-CPA-WN,经转化、表达、纯化后,制备WNV装甲RNA质控品,并对其进行实时荧光定量PCR和数字PCR定量、均匀性及稳定性分析,评估其作为标准物质的可能性。【结果】PCR检测、双酶切和基因测序结果均显示已成功构建重组质粒pET-CPA-WN,表达纯化后得到了大小均一、直径为23~28 nm的病毒样颗粒。核酸酶消化后实时荧光定量PCR检测结果显示,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的装甲RNA;其定植结果为8.80×10~9拷贝/mL。稳定性试验结果表明,该装甲RNA可在37℃稳定保持20 d,随机抽取10个样本进行均匀性检验证明其均匀性良好。【结论】本研究基于MS2噬菌体制备的装甲RNA拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为WNV分子检测提供安全、稳定的参考样品。展开更多
文摘本研究构建了金针菇Flammulina filiformis苯丙氨酸解氨酶基因1(F.filiformis PAL gene1,Fvpal1)的RNAi载体,以黄色的单核体菌株0990-(5)为受体,通过遗传转化获得5个基因沉默的单核转化子(RNAi-Fvpal11–5)。5个单核转化子再分别与白色的单核体菌株Dan3进行杂交,获得5个基因沉默的双核转化子(ZRNAi-Fvpal11–5)。考察并分析了单核转化子和双核转化子在PDA培养基上的菌丝生长速度、菌丝的PAL酶活、菌丝在培养基上的色素分泌及Fvpal1基因表达量情况,以验证Fvpal1基因具有调控金针菇颜色的功能。结果显示,10个转化子的Fvpal1基因表达较野生菌株相比都显著下调(P<0.05),其中转化子RNAi-Fvpal11–5分别下调83.41%、75.92%、79.69%、66.49%和43.22%,转化子ZRNAi-Fvpal11–5分别下调80.26%、45.24%、34.09%、84.05%和79.62%;除转化子ZRNAi-Fvpal14外的9个转化子的PAL酶活力都显著低于出发菌株(P<0.05)。10个转化子的菌丝在PDA培养基上的色素分泌都比出发菌株浅,双核转化子的菌丝在木屑培养基中的颜色也显著变浅,以及双核转化子的子实体颜色也比出发菌株浅。本研究构建了金针菇Fvpal1基因的RNAi体系,发现该基因对金针菇菌丝和子实体的颜色具有正调控作用,为进一步开展金针菇Fvpal1基因的功能基因研究提供了数据支撑。
文摘【目的】目前国内外西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的核酸检测中缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,对检测结果的精确度和可信度造成一定的影响。本研究旨在研制一种安全稳定的WNV核酸检测质控品,为西尼罗热监测提供技术支持。【方法】将WNV核酸检测靶基因、MS2噬菌体外壳蛋白CP及成熟酶蛋白A基因序列插入到表达载体得到重组质粒pET-CPA-WN,经转化、表达、纯化后,制备WNV装甲RNA质控品,并对其进行实时荧光定量PCR和数字PCR定量、均匀性及稳定性分析,评估其作为标准物质的可能性。【结果】PCR检测、双酶切和基因测序结果均显示已成功构建重组质粒pET-CPA-WN,表达纯化后得到了大小均一、直径为23~28 nm的病毒样颗粒。核酸酶消化后实时荧光定量PCR检测结果显示,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的装甲RNA;其定植结果为8.80×10~9拷贝/mL。稳定性试验结果表明,该装甲RNA可在37℃稳定保持20 d,随机抽取10个样本进行均匀性检验证明其均匀性良好。【结论】本研究基于MS2噬菌体制备的装甲RNA拷贝数高,均匀性和稳定性良好,可为WNV分子检测提供安全、稳定的参考样品。
