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基于PRV-copGFP的伪狂犬病毒快速中和抗体效价检测方法的建立
1
作者 李晨雨 马琦 +7 位作者 王冰丹 王菲 冯霞 张晓光 李红霞 马晶 郝彦哲 李淑英 《病毒学报》 北大核心 2025年第3期825-834,共10页
本研究开发了一种高效且精准的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)中和抗体效价检测新方法。通过同源重组和CRISPR-Cas9技术,将桡足纲绿色荧光蛋白(copepod Pontellina plumata Green Fluorescent Protein,copGFP)基因表达盒精确嵌... 本研究开发了一种高效且精准的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)中和抗体效价检测新方法。通过同源重组和CRISPR-Cas9技术,将桡足纲绿色荧光蛋白(copepod Pontellina plumata Green Fluorescent Protein,copGFP)基因表达盒精确嵌入PRV基因组的UL40/41区域,经过多轮筛选与纯化,成功构建了重组病毒PRV-copGFP。生长特性对比实验表明,PRV-copGFP与野生型PRV-Bartha之间无显著差异(P>0.05)。借助CTL-ImmunoSpot?S6仪器计数表达copGFP的细胞数目,确定了最佳观测时间和最佳病毒滴度。该方法可精确计算中和抗体效价,并通过传统噬斑减少中和试验(Plaque reduction neutralization test, PRNT)进行验证。与传统方法相比,本检测方法将检测窗口缩短至10h,且通量显著提升。本方法在快速评估PRV中和抗体效价方面具有显著优势,可为PRV疫苗研发、疾病防控及相关研究提供有力的技术支持。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(prv) 中和抗体效价 桡足纲绿色荧光蛋白(copGFP) 重组病毒 快速检测
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PRV感染小鼠三叉神经节细胞后通过RIG-Ⅰ信号通路调控Ⅰ型干扰素分泌
2
作者 廖正波 汤德元 +7 位作者 曾智勇 王彬 黄涛 陈旭 袁盛林 何松 周飘 毛茵茗 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第2期255-265,共11页
为探究伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)感染小鼠三叉神经节(TG)细胞后对其抗病毒免疫信号通路及Ⅰ型干扰素因子(IFN-Ⅰ)的影响。本试验使用1 MOI PRV接种感染TG原代细胞,使用106.29TCID50PRV滴鼻感染小鼠,使用实时荧光定量PCR(qP... 为探究伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)感染小鼠三叉神经节(TG)细胞后对其抗病毒免疫信号通路及Ⅰ型干扰素因子(IFN-Ⅰ)的影响。本试验使用1 MOI PRV接种感染TG原代细胞,使用106.29TCID50PRV滴鼻感染小鼠,使用实时荧光定量PCR(qPCR)、Western blot和ELISA等技术检测小鼠TG原代细胞不同攻毒时间点及体内攻毒组和对照组的基因转录、蛋白表达及IFN-α和IFN-β的分泌情况。结果显示,PRV感染小鼠TG原代细胞后引起RIG-I、MAVS和IRF3的基因及蛋白表达变化,诱导了体内外IRF3和IκBα的磷酸化。ELISA结果显示,PRV感染后可调控小鼠TG原代细胞及小鼠TG内IFN-α和IFN-β的分泌。使用siRNA干扰TG细胞内RIG-Ⅰ表达后Western blot检测RIG-Ⅰ信号通路相关蛋白表达结果及IFN-α和IFN-β的分泌情况。结果显示,siRIG-Ⅰ成功干扰TG细胞内RIG-Ⅰ蛋白表达,并引起下游MAVS和IRF3等蛋白表达发生变化,同时调控TG细胞内IFN-α和IFN-β的分泌。研究结果表明,PRV感染可诱导小鼠TG原代细胞及小鼠TG内RIG-Ⅰ的表达,并通过RIG-Ⅰ-MAVS-IRF3信号轴调控TG细胞内IFN-Ⅰ的抗病毒免疫反应,以及PRV会抑制TG内IRF3表达,并在感染后期显著上调IFN-β的表达,这可能是PRV在感染后期导致小鼠快速死亡的重要原因。本试验揭示了PRV感染小鼠TG细胞后通过RIG-Ⅰ-MAVS-IRF3信号通路调控IFN-Ⅰ的部分抗病毒免疫机制,以及发现IRF3蛋白在体内外不同的变化趋势,为后续深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 prv RIG-Ⅰ IRF3 信号通路 Ⅰ型干扰素 小鼠
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伪狂犬病毒(PRV)GZ-JS2017株的分离鉴定及主要毒力基因分子特征分析 被引量：6
3
作者 徐国 梁海英 +7 位作者 曾智勇 汤德元 王彬 黄涛 叶百川 张爱琼 何小莉 咸文 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期209-216,共8页
为查明贵州省合肥地区某规模化养殖场猪只发生急性死亡的病因,以及明确病原主要毒力基因的分子特征。本试验采用PCR技术、细胞接种试验、动物试验及透射电子显微镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对该病原的主要毒力基因进行克隆、测... 为查明贵州省合肥地区某规模化养殖场猪只发生急性死亡的病因,以及明确病原主要毒力基因的分子特征。本试验采用PCR技术、细胞接种试验、动物试验及透射电子显微镜观察等方法进行病原的分离鉴定,并对该病原的主要毒力基因进行克隆、测序及生物信息学分析。结果显示：PCR检测可扩增出PRV特异性核酸阳性条带,接种Vero细胞后可见明显CPE现象,在透射电子显微镜下可见囊泡中呈圆形、160nm左右的成熟病毒粒子,胞核中可见病毒包涵体和实心、空心2种无囊膜病毒粒子;接种健康猪可引起神经症状,最后麻痹死亡;通过生物信息学分析显示该毒株的gE、gC、gD及TK基因序列均与参考毒株中湖北HNX株和河南HN1201株相对应的核苷酸同源性最高,且在gE基因的48位和496位都有1个天冬氨酸（Asp）的插入;根据gE、gC、gD及TK基因序列的遗传进化树结果显示本次分离毒株与2011年以后所分离鉴定的变异毒株属同一分支。说明本试验成功分离鉴定一株猪伪狂犬病病毒变异毒株,以期为贵州省猪伪狂犬病病毒的流行及变异提供一些参考。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(prv) 分离鉴定 gE、gC、gD及TK基因 分子特征
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应用多联PCR对引发猪繁殖障碍有关病毒的检测Ⅱ.JEV、PPV、PRRSV、PRV单项PCR检测方法的建立 被引量：15
4
作者 孙明 李红卫 +5 位作者 高显明 涂长春 何旭玉 白晓鸿 金宁一 殷震 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期10-13,共4页
在利用计算机设计出检测流行性乙型脑炎病毒 ( JEV)、猪细小病毒 ( PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)、猪伪狂犬病病毒 ( PRV)的多联 PCR引物的基础上 ,分别进行各单项 PCR检测相应病毒试验 ,确定了各单项 PCR反应条件范围 ,并对各... 在利用计算机设计出检测流行性乙型脑炎病毒 ( JEV)、猪细小病毒 ( PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)、猪伪狂犬病病毒 ( PRV)的多联 PCR引物的基础上 ,分别进行各单项 PCR检测相应病毒试验 ,确定了各单项 PCR反应条件范围 ,并对各 PCR扩增产物进行了点杂交和部分测序鉴定。用单项 PCR对感染猪相关病毒的检测证实 ,本试验已经建立了有效、特异、敏感的检测 JEV、PPV、PRRSV、PRV的单项 PCR技术 ,为进一步建立多联 展开更多
关键词 JEV PPV PRRSV prv PCR 猪 繁殖障碍 病毒 检测方法
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PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：29
5
作者 岳丰雄 崔尚金 +1 位作者 冉多良 张超范 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期691-696,共6页
参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段。通过对反应因素进行优化,建立... 参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段。通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性。表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 猪细小病毒 猪伪狂犬病病毒 猪生殖与呼吸综合征病毒 多重PCR
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2015-2017年山东地区CSFV、PRRSV和PRV的流行病学调查与分析 被引量：17
6
作者 张树金 曾昊 +10 位作者 于江 陈智 张玉玉 王鑫 陈蕾 唐融志 郭立辉 任素芳 邱文彬 李玉保 吴家强 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1064-1069,共6页
为了解山东地区生猪主要病毒性疾病的发生情况,掌握疫病发生及变化规律。本试验对2015-2017年山东省各生猪养殖场送检的病料和血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)3种病原抗原和抗体检测及遗... 为了解山东地区生猪主要病毒性疾病的发生情况,掌握疫病发生及变化规律。本试验对2015-2017年山东省各生猪养殖场送检的病料和血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)3种病原抗原和抗体检测及遗传演化分析。结果显示:2015-2017年CSFV平均抗原阳性率为9.99%,抗体水平逐年提高,平均抗体阳性率为79.38%;样品序列测定结果显示,目前CSFV的主要流行毒株为2.1d亚型。PRRSV平均抗原阳性率为41.44%,平均抗体阳性率为83.28%,2015-2017年PRRSV抗原和抗体水平均趋于平稳趋势。2017年PRV平均抗原阳性率12.30%,gE平均抗体阳性率为30.95%,gB平均抗体阳性率为74.70%,2017年PRV野毒感染的风险有所提高。结果表明,虽然部分病毒性传染病的发生发展出现一些变化及风险,但仍处于可防可控的范围。该调查分析结果可为山东地区CSFV、PRRSV和PRV的流行和防控提供参考。 展开更多
关键词 流行病学调查 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 伪狂犬病病毒
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PCV2、PRV和PRRSV多重PCR方法的建立及其应用 被引量：14
7
作者 耿庆华 彭永刚 +1 位作者 张波 裴程程 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期1393-1397,共5页
根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了PRV、PCV... 根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了PRV、PCV2、PRRSV的多重PCR(mPCR)检测方法。敏感性和特异性的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为32.5(PRV)、25.2(PCV2)、35.9pg(PRRSV)。该方法对猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、大肠杆菌、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(TGE)等病毒的检测结果均为阴性。200份临床样品的多重PCR结果表明,PCV2感染率为80%(160/200),PRV感染率为21%(42/200),PRRSV的感染率为78%(156/200)。200份临床样品主要为PCV2和PRRSV混合感染,阳性率达56.0%(112/200)。该方法的建立对这3种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。 展开更多
关键词 prv PCV2 PRRSV 多重PCR
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PRVLA株gD基因的序列测定及其重复高变区的发现 被引量：10
8
作者 范伟兴 魏荣 +2 位作者 张雪莲 陈溥言 赵宏坤 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期350-352,共3页
对猪伪狂犬病病毒鲁 A株 (PRV L A株 ) g D基因进行了克隆和序列测定 ,结果表明 :在测序的 14 5 3bp的 DNA序列中包括着 1个 12 0 3bp的 ORF(即 g D基因 ) ,它编码 4 0 0个氨基酸组成的多肽 ;在整个 g D基因的 ORF内 PRVL A株与 PRV Ea... 对猪伪狂犬病病毒鲁 A株 (PRV L A株 ) g D基因进行了克隆和序列测定 ,结果表明 :在测序的 14 5 3bp的 DNA序列中包括着 1个 12 0 3bp的 ORF(即 g D基因 ) ,它编码 4 0 0个氨基酸组成的多肽 ;在整个 g D基因的 ORF内 PRVL A株与 PRV Ea株、Hubei株、Rice株、NIA- 3株、Kaplan株的 g D基因比较 ,核苷酸的同源性分别为 98.3%、98.3%、98.0 %、98.1%、98.6 % ,氨基酸的同源性分别为 97.8%、97.8%、97.5 %、98.1%、98.6 % ;发现 PRV L A株 g D基因与Ea株、Hubei株、Rice株、NIA- 3株、Kaplan株的 g D基因均在 80 2～ 837nt处有 1个 C(A) GGCCC的重复高变区 ,其对应的是 g D2 6 7～ 2 79位氨基酸残基 Arg- Pro的重复高变区。正是该重复高变区的碱基缺失或插入使得 PRV g D的ORF在 1194～ 12 15 nt间变化 ,g D前体的氨基酸残基为 398～ 4 0 4个。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 prv LA株 GD基因 序列测定 重复高变区 伪狂犬病 同源性
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检测PCV_2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法 被引量：7
9
作者 潘群兴 陈德 +1 位作者 何孔旺 黄克和 《中国病毒学》 CSCD 2005年第6期603-606,共4页
本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)、及伪狂犬病毒(PRV)疫苗株与野毒株 的多重PCR方法。根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特 异性引物,用这四对引物对同一样品中的P... 本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)、及伪狂犬病毒(PRV)疫苗株与野毒株 的多重PCR方法。根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特 异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp(PCV2)、 581bp(PPV)、372bP(PRV gB)及147bp(PRV gE)四条特异性片段。对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR 扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为 106.2、103.8、10-5.8 TCID50的模板。该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要 意义。 展开更多
关键词 多重聚合酶链式反应 伪狂犬病毒(prv) 细小病毒(PPV) 猪圆环病毒2型(PCV2)
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检测PRV野毒株、PCV-2及PPV多重PCR方法的建立及初步应用 被引量：12
10
作者 余波 谭诗文 +4 位作者 冉懋韬 徐景峨 艾玉萍 魏赐开 刘兵 《畜牧与兽医》 北大核心 2010年第5期15-18,共4页
根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结... 根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 猪细小病毒 多重PCR
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PRV基因缺失株在体外细胞中增殖的超微结构 被引量：5
11
作者 徐志文 郭万柱 +3 位作者 朱玲 徐凯 王印 王小玉 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1008-1012,共5页
用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)Fa株和本实验室构建的系列PRV基因缺失株(PRV-TK-、PRV-gI\gE-、PRV-TK\gI\gE-株)感染不同的细胞系(IBRS-2、Marc145、ST、Vero、MDBK细胞),对感染细胞的形态学观察发现,受试各PRV毒株在以上细... 用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)Fa株和本实验室构建的系列PRV基因缺失株(PRV-TK-、PRV-gI\gE-、PRV-TK\gI\gE-株)感染不同的细胞系(IBRS-2、Marc145、ST、Vero、MDBK细胞),对感染细胞的形态学观察发现,受试各PRV毒株在以上细胞均能增殖并引起细胞病变,但对不同的细胞却表现差异,其中在ST细胞上增殖滴度最低,在MDBK上最高;同PRV Fa株相比,PRV-gI\gE-和PRV-TK\gI\gE-株的增殖力有所降低,而PRV-TK-则变化不明显;对细胞感染后的超微结构分析发现,基因缺失对该毒株在细胞上的吸附和穿入过程没有影响,但与Fa株相比,主要表现为增殖速度的减缓和病毒粒子数量的减少。 展开更多
关键词 prv基因缺失疫苗 细胞感染 形态学 超微结构
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猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV/TK^-的构建及其生物学特性 被引量：11
12
作者 陈瑞爱 邵定勇 韩静芳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期577-582,共6页
为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19... 为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研究及PRV基因缺失苗的研发提供了技术平台。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒容A株 TK缺失 生物学特性
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伪狂犬病病毒(PRV)不同毒株抗原相关性研究 被引量：1
13
作者 程晓霞 车勇良 +6 位作者 王劭 肖世峰 朱小丽 陈仕龙 林锋强 陈少莺 周伦江 《福建农业学报》 CAS 北大核心 2018年第4期337-340,共4页
为了解PRV不同毒株之间的抗原性差异,评价弱毒FB株预防新型PRV的潜力,以4株PRV(FA、FB、Bartha-K61和FJ2012)毒株及其高免血清为材料,应用交叉中和试验测定PRV不同毒株的抗原性差异,通过FB免疫猪攻毒试验评价弱毒FB株对新型PRV的保护潜... 为了解PRV不同毒株之间的抗原性差异,评价弱毒FB株预防新型PRV的潜力,以4株PRV(FA、FB、Bartha-K61和FJ2012)毒株及其高免血清为材料,应用交叉中和试验测定PRV不同毒株的抗原性差异,通过FB免疫猪攻毒试验评价弱毒FB株对新型PRV的保护潜力。结果表明:中和抗体测定表明兔抗FB株、FA株、Bartha-K61株和FJ2012株高免血清的中和效价分别为1∶54、1∶91、1∶91和1∶215。交叉中和试验显示FB株与FA株、FB株与FJ2012株、FA株与FJ2012株的抗原相关性(R值)均大于0.8,Bartha-K61株与FA株、FB株、FJ2012株的R值均小于0.4,表明FB株与FJ2012株的抗原相关性高于Bartha-K61株与FJ2012株。仔猪免疫攻毒试验显示FB免疫猪能抵抗新型PRV(FJ2012株)的攻毒,保护率100%。提示PRV弱毒FB株有望成为预防新型猪伪狂犬病毒(FJ2012株)的疫苗候选株。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(prv) FA株 FB株 Bartha-K61株 FJ2012株 抗原相关性 免疫保护
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PCV-2、PPV和PRV多重PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：6
14
作者 陈光达 许信刚 童德文 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2011年第11期1-6,共6页
【目的】建立可用于临床同时检测PCV-2、PPV和PRV 3种DNA病毒感染的多重PCR方法。【方法】根据GenBank中收录的PCV-2、PPV和PRV的基因组序列,选择3种病毒的特异性保守区设计3对引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测3种病... 【目的】建立可用于临床同时检测PCV-2、PPV和PRV 3种DNA病毒感染的多重PCR方法。【方法】根据GenBank中收录的PCV-2、PPV和PRV的基因组序列,选择3种病毒的特异性保守区设计3对引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重PCR方法,对该方法的特异性、敏感性、稳定性进行检测,并将其用于临床病料的检测。【结果】多重PCR方法中,当引物浓度均为1.0μmol/L,退火温度为57.2℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从PCV-2、PPV、PRV病毒DNA中分别扩增出长度为353,265和198bp的目的片段,从3种病毒DNA的混合物中也可扩增出上述目的片段,而其他对照组的扩增结果均呈阴性。敏感性试验结果表明,建立的多重PCR方法对PCV-2、PPV和PRV的最低检测量分别为26.88,25.34和24.9pg/μL。在不同时间对每份样品重复检测3次,结果一致,表明该方法具有良好的可重复性。临床应用结果表明,39份疑似病料中,PCV-2、PPV和PRV的阳性率分别为53.84%,17.95%和5.13%,PCV-2与PPV混合感染的阳性率为15.38%,PCV-2、PPV和PRV混合感染的阳性率为2.57%。【结论】建立的多重PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可以有效检测PCV-2、PPV和PRV的混合感染。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 猪细小病毒 猪伪狂犬病病毒 多重PCR
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云南地区部分猪场猪呼吸道疾病综合症(PRDC)患病猪群中PRRSV,PCV-2,CSFV,PRV混合感染调查 被引量：25
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作者 舒相华 尹革芬 +4 位作者 杨志雷 宋春莲 李文贵 潘伟荣 刘旭川 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期54-58,共5页
针对云南省不同地区不同季节猪呼吸道疾病综合征进行流行病学调查,根据其临床特征,在不同规模养殖场共采集1 164份血清样品,利用ELISA和RT-PCR方法检测其猪瘟抗原CSFV,猪繁殖与呼吸综合征抗原PRRSV,猪伪狂犬病PRV gE抗体及猪圆环病毒2型... 针对云南省不同地区不同季节猪呼吸道疾病综合征进行流行病学调查,根据其临床特征,在不同规模养殖场共采集1 164份血清样品,利用ELISA和RT-PCR方法检测其猪瘟抗原CSFV,猪繁殖与呼吸综合征抗原PRRSV,猪伪狂犬病PRV gE抗体及猪圆环病毒2型PCV-2特异抗体。结果表明:各季节和不同生长阶段猪群存在一种及两种以上的病毒混合感染,四重感染相对较少。从全年看单独感染占39.10%,PCV-2感染率最高,其次是PRV,PRRSV和CSFV;二重感染占26.13%,以PCV-2+PRV最常见,其次是PCV-2+PRRSV、PRV+PRRSV;三重感染占8.05%,PCV-2+PRRSV+PRV最常见;有四重感染出现,仅占1.57%。从季节来看,春季和夏季混合感染最高,分别为76.53%和60.74%,冬季和秋季的混合感染率分别为59.50%和53.55%。从年龄和性别看,育肥猪的混合感染率高于仔猪,分别为68.66%和61.11%,种公猪的感染率高于母猪,分别为70.00%和55.51%。说明4种病毒有单独感染或混合感染,推测其中PCV-2在混合感染中可能充当免疫抑制的角色,混合感染使PRDC症状更明显,死亡率增高。 展开更多
关键词 猪呼吸道疾病综合征 猪瘟病毒 猪圆环病毒2型 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪伪狂犬病病毒
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CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：3
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作者 李兆龙 黄梅清 +8 位作者 程晓霞 陈仕龙 郑敏 朱小丽 张世忠 王劭 林锋强 陈少莺 吴南洋 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2010年第23期18-21,共4页
参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条... 参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 猪流感病毒 猪瘟病毒 猪圆环病毒2型 猪伪狂犬病毒 猪生殖与呼吸综合征病毒 多重PCR
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CSFV、PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及其应用 被引量：9
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作者 顾文源 范京惠 +3 位作者 邸晶美 罗尚星 刘宝京 左玉柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期193-197,共5页
由猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的繁殖障碍性疫病在中国的不断暴发,增加了猪的发病率和死亡率。为了建立同时检测这3种病毒的多重PCR方法,本研究根据GenBank中这3种病毒的参考基因序列设计引... 由猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的繁殖障碍性疫病在中国的不断暴发,增加了猪的发病率和死亡率。为了建立同时检测这3种病毒的多重PCR方法,本研究根据GenBank中这3种病毒的参考基因序列设计引物,并对反应中的影响因素进行优化,建立了同时检测CSFV、PRV和PRRSV的多重PCR方法。该方法扩增的基因片段大小分别为570(CSFV),232 (PRRSV)和173bp(PRV)。敏感性和特异性试验结果显示,该方法对3种病毒的核酸最低检出量分别为23.88(CSFV),13.10(PRRSV)和14.60pg(PRV),对大肠杆菌(Ec.oli)、沙门菌(Salmonella)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。对2015年5月至2016年1月收集的168份临床样本检测结果显示,CSFV阳性率为24.4%,PRRSV阳性率为21.4%,提示河北省该段时间内引起猪繁殖障碍性疫病的主要病原为CSFV和PRRSV。经多重PCR检测为PRRSV、PRV或CSFV阳性的临床样本,再次使用商品化的试剂盒进行检测,符合率为100.0%。这些结果表明,本试验建立的多重PCR方法省时、高效,可用于PRRSV、PRV和CSFV感染的临床诊断。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 伪狂犬病病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 多重PCR
原文传递
重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化 被引量：2
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作者 付朋飞 乔涵 +5 位作者 杨兴武 张宇 王林青 郭晓庆 潘鑫龙 陈红英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1476-1483,共8页
参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本... 参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。 展开更多
关键词 prv 猪细小病毒 VP2基因 重组
原文传递
CSFV、PRRSV、PEDV和PRV四重荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量：2
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作者 王利丽 路超 +7 位作者 李富强 鄢明华 任卫科 江珊 池晶晶 张莉 李程 李秀丽 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1259-1267,共9页
为了快捷地进行规模化猪场疫病风险评估,建立了一种同时检测猪场环境中猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的荧光定量PCR方法。根据CSFV 5′UTR基因、PRRSV Nsp2基因、PEDV ... 为了快捷地进行规模化猪场疫病风险评估,建立了一种同时检测猪场环境中猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的荧光定量PCR方法。根据CSFV 5′UTR基因、PRRSV Nsp2基因、PEDV M基因和PRV g E基因保守区,设计特异性引物和探针,通过优化PCR反应条件,建立了四重荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可特异性扩增CSFV、PRRSV、PEDV和PRV,与TGEV、RV、PCV2、PPV、PRV Bartha-K61、JEV、E.coli、S.suis 2等病原体无交叉反应,四种病毒的最低检出值为4.62×10^(1)copies/μL,批内及批间变异系数为0.003~0.016。与国标方法相比,两种方法阳性符合率为83.33%~100.00%(182份组织样品)。运用该方法检测猪场采集的434份肛拭子、鼻拭子及环境样品,肛拭子和环境样品中PEDV检出率较高,分别为16.53%和11.90%;环境样品中PRV检出率较高,为8.28%。综上结果,此方法为规模化猪场进行疫病风险评估提供了一种有效的技术手段。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪流行性腹泻病毒 猪伪狂犬病病毒 荧光定量PCR方法 疫病风险评估
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胶体金免疫层析法检测猪PRV gE抗体方法的建立及应用 被引量：3
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作者 边传周 郑鸣 任敏 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期204-207,共4页
利用PCR技术从猪伪狂犬病毒基因组中克隆gE抗原表位基因,并将其插入到载体pET-22b(+)中,构建成原核表达质粒pET-22b(+)-gE,使其在E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经斑点杂交证实表达产物具有抗原性。表达产物纯化后作为抗原,结合胶体金标记... 利用PCR技术从猪伪狂犬病毒基因组中克隆gE抗原表位基因,并将其插入到载体pET-22b(+)中,构建成原核表达质粒pET-22b(+)-gE,使其在E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经斑点杂交证实表达产物具有抗原性。表达产物纯化后作为抗原,结合胶体金标记技术,运用双抗原夹心法于国内首先建立了猪PRVgE抗体检测的免疫层析试纸条。该方法操作简单灵敏度高、特异性好,适合猪伪狂犬病的临床诊断。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 基因表达 胶体金 免疫层析
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