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基于酶催化的新型L-丝氨酸检测方法的开发与优化
1
作者 孙慕娇 鞠建松 +1 位作者 刘君 魏亮 《食品与发酵工业》 北大核心 2026年第4期353-360,共8页
L-丝氨酸是一种重要的非必需氨基酸,具有重要的生理功能,在食品、化妆品和医药等领域具有广泛的应用。微生物发酵法具有环境友好,条件温和,底物可再生等优势,是生产L-丝氨酸的理想方法,受到研究者的广泛关注。在L-丝氨酸工程菌种的选育... L-丝氨酸是一种重要的非必需氨基酸,具有重要的生理功能,在食品、化妆品和医药等领域具有广泛的应用。微生物发酵法具有环境友好,条件温和,底物可再生等优势,是生产L-丝氨酸的理想方法,受到研究者的广泛关注。在L-丝氨酸工程菌种的选育和改造过程中,需要对大量的菌种进行评估,存在大量的L-丝氨酸分析和检测工作,但是目前L-丝氨酸检测方法存在灵敏度差、准确度低、步骤繁琐等问题,严重限制了L-丝氨酸样品的高通量快速评估和检测。针对上述问题,该研究利用L-丝氨酸-3-脱氢酶的催化特性,建立了一种简单快速、特异性高的L-丝氨酸检测方法。通过对L-丝氨酸-3-脱氢酶挖掘和酶学性质分析,建立了L-丝氨酸最佳的酶法检测体系,该体系包括50 mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠(pH=9.5),3 mmol/L NADP^(+),来源于蚕豆农杆菌(Agrobacterium fabrum)的丝氨酸脱氢酶(L-serine dehydrogenase,SerDH)2 U/mL,检测温度为40℃。该研究建立的L-丝氨酸酶法检测方法具有简单快速、检测效率高等特点,在1~10 mmol/L L-丝氨酸的浓度范围具有良好的线性关系,R^(2)达到0.9965。该研究建立的L-丝氨酸酶法检测方法能够实现L-丝氨酸样品的高通量检测和评估,为L-丝氨酸工业菌种的高通量选育提供了重要的技术支撑。 展开更多
关键词 L-丝氨酸 L-丝氨酸-3-脱氢酶 酶学性质分析 高通量检测方法
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谷氨酸棒杆菌表面展示与代谢工程生产γ-氨基丁酸
2
作者 李豪倩 史锋 《食品与发酵工业》 北大核心 2026年第3期65-74,共10页
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)在医药、食品、饲料等领域应用广泛。谷氨酸棒杆菌中GABA的生产依赖外源谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸脱羧,但一般GAD的最适pH值为4.0~5.0,与细胞内偏中性环境不符,限... γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)在医药、食品、饲料等领域应用广泛。谷氨酸棒杆菌中GABA的生产依赖外源谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸脱羧,但一般GAD的最适pH值为4.0~5.0,与细胞内偏中性环境不符,限制了其活性。该研究采用细胞表面展示技术,将GAD展示在谷氨酸棒杆菌细胞表面,以解决上述问题。结果表明锚定基序PorH对于表面展示GAD是有效的,产生了1.7 g/L GABA。通过延长PorH与GAD之间接头序列至(G_(4)S)_(3),GABA的产量提高至2.1 g/L。进一步优化发酵方式,在10~24 h阶段添加尿素调控pH,使GABA产量显著增加至9.9 g/L。最后,通过敲除GABA渗透酶编码基因gabP阻断谷氨酸棒杆菌中的GABA摄取途径,最终将GABA产量提高至10.9 g/L。该研究为在谷氨酸棒杆菌中生产GABA提供了新的思路和策略。 展开更多
关键词 Γ-氨基丁酸 谷氨酸脱羧酶 细胞表面展示 代谢工程 谷氨酸棒杆菌
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高效合成5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌的构建与发酵优化
3
作者 刘丽静 辛瑜 +4 位作者 顾正华 李默影 朱瑞 郭忠鹏 张梁 《食品与发酵工业》 北大核心 2026年第2期10-18,共9页
非蛋白质氨基酸5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)是血红素、叶绿素、维生素B12等四吡咯化合物合成的前体物质,在医药和农业等领域具有广泛的应用价值。该研究是旨在无需添加甘氨酸的条件下高效生产5-ALA。为此,在大肠杆菌... 非蛋白质氨基酸5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)是血红素、叶绿素、维生素B12等四吡咯化合物合成的前体物质,在医药和农业等领域具有广泛的应用价值。该研究是旨在无需添加甘氨酸的条件下高效生产5-ALA。为此,在大肠杆菌中引入异源谷氨酸乙醛酸氨基转移酶和5-氨基乙酰丙酸合酶,构建一条非自然C4代谢途径。通过过表达异柠檬酸裂解酶、敲除苹果酸合酶,强化乙醛酸途径,使5-ALA产量提升至577.3 mg/L。随后,通过敲除琥珀酸辅酶A合成酶增加前体物质积累,敲除原卟啉原Ⅲ氧化酶抑制5-ALA的下游代谢,并过表达磷酸烯醇式丙酮酸激酶补充草酰乙酸、加强三羧酸循环。最终,优化菌株ALA-6的5-ALA产量达到1.74 g/L。在进一步优化异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导浓度和筛选最适培养基后,在乳糖自诱导培养基中实现了1.9 g/L的5-ALA产量。该研究为无需外源添加甘氨酸高效生产5-ALA提供参考。 展开更多
关键词 大肠杆菌 5-氨基乙酰丙酸 C4途径 谷氨酸乙醛酸转氨酶
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流加培养与氧调控协同提高大肠杆菌产L⁃苏氨酸
4
作者 王泽建 银肖剑 +4 位作者 郭文慧 吕莹 范晓光 栗波 梁剑光 《食品研究与开发》 2025年第5期160-166,共7页
以实验室1株大肠杆菌为出发菌株,首先将活化后的大肠杆菌菌液按照5%接种量接种至优化后的发酵罐培养基中进行培养,调节控制溶解量不低于15%,并实时流加葡萄糖酸钠、磷酸甜菜碱和玉米浆干粉混合溶液,控制细胞的氧消耗速率(oxygen uptake ... 以实验室1株大肠杆菌为出发菌株,首先将活化后的大肠杆菌菌液按照5%接种量接种至优化后的发酵罐培养基中进行培养,调节控制溶解量不低于15%,并实时流加葡萄糖酸钠、磷酸甜菜碱和玉米浆干粉混合溶液,控制细胞的氧消耗速率(oxygen uptake rate,OUR)为215 mmol/(L·h),通过在线氧消耗速率控制系统、补料控制与OUR调节的作用关系,获得最优流加补料方案:流加25%氨水控制pH值,调整转速和通气控制溶氧15%以上,当溶氧开始回升时流加质量浓度为65%的葡萄糖,起始流加速度1 g(/L·h),控制残糖浓度不超过1.0 g/L。结果表明:L⁃苏氨酸产量提高了35%,达到155 g/L。 展开更多
关键词 L⁃苏氨酸 氧消耗速率 优化调控 流加培养 大肠杆菌
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代谢工程改造大肠杆菌从头合成L-茶氨酸 被引量：2
5
作者 周思全 张迪 +3 位作者 徐美娟 张显 杨套伟 饶志明 《生物工程学报》 北大核心 2025年第9期3459-3472,共14页
L-茶氨酸是一种重要的天然非蛋白质氨基酸,广泛应用于食品和医药领域。虽然目前已有不添加乙胺的L-茶氨酸微生物发酵法,但糖酸转化率较低。本研究构建了一条以葡萄糖为底物的L-茶氨酸从头合成途径。首先,设计并优化了一条包含多胺-丙酮... L-茶氨酸是一种重要的天然非蛋白质氨基酸,广泛应用于食品和医药领域。虽然目前已有不添加乙胺的L-茶氨酸微生物发酵法,但糖酸转化率较低。本研究构建了一条以葡萄糖为底物的L-茶氨酸从头合成途径。首先,设计并优化了一条包含多胺-丙酮酸转氨酶(ω-transaminase, TA)和γ-谷氨酰甲胺合成酶(γ-glutamylmethylamide synthetase, GMAS)的体外转化途径,并引入底盘细胞大肠杆菌(Escherichia coli) K12 W3110,实现了L-茶氨酸的从头合成。进一步通过代谢工程提高合成效率,增加γ-谷氨酰甲胺合成酶编码基因gams和多胺-丙酮酸转氨酶编码基因spuC的拷贝数,增强醛脱氢酶基因eutE表达提供充足乙醛底物,敲除乳酸脱氢酶基因ldhA和丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB阻断旁路代谢,引入丙氨酸脱氢酶基因alD回补丙氨酸;过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因ppc增强三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)碳通量,敲除琥珀酰CoA合成酶基因sucCD来降低TCA下游通量损失,整合表达谷氨酸脱氢酶基因gdh,增强L-谷氨酸供应;最后引入多聚磷酸盐激酶编码基因ppk增强了L-茶氨酸生产中的能量供应。最终,重组菌Tea11在5 L发酵罐中28 h L-茶氨酸产量达到22.60 g/L,糖酸转化率41.71%。本研究中的合成路径平衡了乙胺的供应和茶氨酸生产的关系,为代谢工程改造微生物生产L-茶氨酸提供了新的思路。 展开更多
关键词 大肠杆菌 L-茶氨酸 代谢工程 路径优化
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代谢改造谷氨酸棒杆菌高效发酵生产L-高丝氨酸 被引量：1
6
作者 钟兆月 马振平 +5 位作者 祁玉婷 张霞 徐宁 刘君 邵丽 姜巨全 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第10期1-8,共8页
L-高丝氨酸是一种非蛋白质手性氨基酸,在食品、饲料、医药和农业等领域中具有广阔的应用潜力。但目前改造食品安全微生物谷氨酸棒杆菌发酵生产L-高丝氨酸的实例仍然较少。该研究以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌,通过敲除thrB、alaT和ddh弱... L-高丝氨酸是一种非蛋白质手性氨基酸,在食品、饲料、医药和农业等领域中具有广阔的应用潜力。但目前改造食品安全微生物谷氨酸棒杆菌发酵生产L-高丝氨酸的实例仍然较少。该研究以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌,通过敲除thrB、alaT和ddh弱化L-高丝氨酸竞争途径,并过表达lysC、hom和ppc强化L-高丝氨酸合成代谢流,实现了L-高丝氨酸的有效积累。随后,通过增强胞内NADPH供应以及促进L-高丝氨酸外排效率,进一步提升L-高丝氨酸生产。最后,通过改造和重塑葡萄糖摄取和利用系统,在谷氨酸棒杆菌中实现了L-高丝氨酸的高效合成。最优基因工程菌在摇瓶条件下可积累9.29 g/L L-高丝氨酸,在5 L发酵罐条件下可积累77.53 g/L L-高丝氨酸,生产强度达到1.29 g/(L·h),是已报道谷氨酸棒杆菌生产L-高丝氨酸的最高水平。该研究将为构建L-高丝氨酸高产菌株提供一定参考依据。 展开更多
关键词 L-高丝氨酸 谷氨酸棒杆菌 代谢工程 细胞工厂 发酵
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代谢工程改造大肠杆菌高效生产L-苏氨酸 被引量：1
7
作者 牛思琦 刘建行 +2 位作者 刘佳 李晓敏 刘立明 《生物工程学报》 北大核心 2025年第12期4777-4793,共17页
L-苏氨酸属于L-天冬氨酸族氨基酸,是哺乳动物无法自身合成的氨基酸之一,广泛应用于饲料、医药和食品领域。L-苏氨酸发酵生产中存在底物利用谱窄、菌株生长迟缓以及转化率低等问题。本研究以实验室保藏的大肠杆菌(Escherichia coli)THRN... L-苏氨酸属于L-天冬氨酸族氨基酸,是哺乳动物无法自身合成的氨基酸之一,广泛应用于饲料、医药和食品领域。L-苏氨酸发酵生产中存在底物利用谱窄、菌株生长迟缓以及转化率低等问题。本研究以实验室保藏的大肠杆菌(Escherichia coli)THRN1为出发菌株进行代谢工程改造,构建能够高效、稳定持续生产L-苏氨酸的工业生产菌株。首先,针对诱变而来的出发菌株THRN1和FMME1进行比较基因组分析,揭示L-苏氨酸过量积累的潜在代谢机制,确定下一步代谢改造靶点;随后,通过体内定向进化MutaT7系统获得了3个未报道过的thrA有效突变体,进一步提高L-苏氨酸合成通量,获得了THRN2菌株;另外,为了提高菌株的工业适用性,敲除mlc并引入来源于盐田慢生芽孢杆菌(Lentibacillus salicampi)的Glv AV,强化菌株对于工业用淀粉水解糖中的葡萄糖和麦芽糖的利用,获得了THRN7菌株,该菌株在5 L发酵罐发酵34 h,L-苏氨酸产量达到121.26 g/L,糖酸转化率为60.47%;最后,通过发酵工艺的优化,菌株THRN7在50 L发酵罐发酵32 h,能够生产120.42 g/L的L-苏氨酸,糖酸转化率和生产强度分别达到60.88%和3.76 g/(L·h)。本研究构建了一株无抗不携带质粒的L-苏氨酸高产菌株,为L-苏氨酸工业化生产奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 L-苏氨酸 大肠杆菌 代谢工程 组学数据分析 麦芽糖利用
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定向进化产琥珀酸放线杆菌高产丁二酸 被引量：1
8
作者 孙文清 赵运英 +1 位作者 周胜虎 邓禹 《生物工程学报》 北大核心 2025年第5期1994-2009,共16页
丁二酸是一种重要的高值平台化合物,广泛应用于化工、食品、医药等多个领域。化学法生产丁二酸具有高污染、高碳排放等缺陷,因此发酵法成为目前丁二酸生产的主要方法。天然可产丁二酸的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)... 丁二酸是一种重要的高值平台化合物,广泛应用于化工、食品、医药等多个领域。化学法生产丁二酸具有高污染、高碳排放等缺陷,因此发酵法成为目前丁二酸生产的主要方法。天然可产丁二酸的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)具有丁二酸产量高、耐高渗、发酵时间短等优势,是一种重要的工业生产菌株。为了进一步提高A.succinogenes的丁二酸产量,降低生产成本,本研究建立了一种基于溴百里酚蓝的简便高通量筛选方法,结合常压室温等离子体诱变的方法对野生菌A.succinogenes进行了定向进化,筛选得到了高产诱变菌株A4-K74。此菌株在摇瓶中厌氧发酵72 h后最高积累56.3 g/L丁二酸,比野生菌株提高了40.8%,且具有良好的遗传稳定性。转录组分析揭示了硫代谢途径以及半胱氨酸等氨基酸合成途径的增强是丁二酸产量提高的潜在原因,为未来代谢工程改造A.succinogenes提供了参考,有利于进一步推进丁二酸的生物法工业化生产。 展开更多
关键词 产琥珀酸放线杆菌 丁二酸 常压室温等离子体诱变 高通量筛选 转录组分析
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代谢工程改造马克斯克鲁维酵母生产L-乳酸 被引量：1
9
作者 王雨欣 李晓敏 +2 位作者 刘佳 高聪 刘立明 《生物工程学报》 北大核心 2025年第5期2010-2025,共16页
L-乳酸作为一种重要的有机酸,在食品、医药和生物塑料等领域广泛应用。传统的L-乳酸生产主要依赖乳酸菌,但由于乳酸菌对底物要求高且对酸性环境的耐受性差,导致其工业化应用面临一定挑战。相比之下,马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marx... L-乳酸作为一种重要的有机酸,在食品、医药和生物塑料等领域广泛应用。传统的L-乳酸生产主要依赖乳酸菌,但由于乳酸菌对底物要求高且对酸性环境的耐受性差,导致其工业化应用面临一定挑战。相比之下,马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)因其快速生长、耐高温、底物利用广泛等优势,成为了乳酸生产的潜在宿主。为了优化马克斯克鲁维酵母的L-乳酸生产能力,本研究对其进行了代谢工程改造。首先,筛选并表征了高效的乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH),然后利用CRISPR基因编辑技术在不同基因位点过表达LDH并敲除编码丙酮酸脱羧酶的基因PDC1,构建了菌株LA2.1,其L-乳酸产量达到72.55 g/L。通过筛选并组合耐酸靶点,进一步提升了菌株的耐酸性和乳酸产量。最终,通过工艺优化,菌株LA4.3发酵72 h积累了112.41 g/L的L-乳酸,得率为84.00%。在降低CaCO_(3)使用量的条件下,L-乳酸产量达到101.50 g/L,发酵结束后的pH值为3.52。本研究为L-乳酸的高效生产提供了理论基础和技术支持。 展开更多
关键词 L-乳酸 马克斯克鲁维酵母 耐酸性 代谢工程
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代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸 被引量：1
10
作者 于海浪 刘佳 +1 位作者 李晓敏 刘立明 《生物工程学报》 北大核心 2025年第9期3504-3520,共17页
L-缬氨酸是重要的必需支链氨基酸,广泛应用于饲料、医药、食品等领域。目前相对较低的生产强度和转化率依然是限制L-缬氨酸大规模生产的关键因素。为提高L-缬氨酸的生产性能,本研究以实验室保藏的能够生产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌(Coryne... L-缬氨酸是重要的必需支链氨基酸,广泛应用于饲料、医药、食品等领域。目前相对较低的生产强度和转化率依然是限制L-缬氨酸大规模生产的关键因素。为提高L-缬氨酸的生产性能,本研究以实验室保藏的能够生产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为出发菌株进行系统代谢工程改造。首先,通过强化L-缬氨酸的前体供应、合成途径和转运系统获得菌株VH-9,在5 L发酵罐上L-缬氨酸产量、产率和生产强度分别为76.6 g/L、0.45 g/g和2.39 g/(L·h)。进一步通过增强底物葡萄糖的摄取、平衡能量供给以降低琥珀酸的积累,获得菌株VH-18,L-缬氨酸产量、产率和生产强度分别提高到82.7 g/L、0.52 g/g和2.58 g/(L·h);经过发酵工艺条件优化,使菌株VH-18的L-缬氨酸产量、转化率和生产强度进一步提高到88.7 g/L、0.54 g/g和2.77 g/(L·h)。本研究通过系统代谢工程策略,实现了L-缬氨酸的高效生产。 展开更多
关键词 L-缬氨酸 代谢工程 谷氨酸棒杆菌 发酵优化
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系统代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌CP提高L-亮氨酸生产 被引量：3
11
作者 吴开水 刘韪玮 +1 位作者 马零 徐庆阳 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第7期48-57,共10页
L-亮氨酸是一种重要的支链氨基酸,在医药、食品、饲料、化妆品等多领域中具有重要价值。目前,工业上用于生产L-亮氨酸的菌株存在转化率低、副产物多、结晶后产率大幅下降等问题。为获得一株性能优越的L-亮氨酸生产菌株,该研究对L-亮氨... L-亮氨酸是一种重要的支链氨基酸,在医药、食品、饲料、化妆品等多领域中具有重要价值。目前,工业上用于生产L-亮氨酸的菌株存在转化率低、副产物多、结晶后产率大幅下降等问题。为获得一株性能优越的L-亮氨酸生产菌株,该研究对L-亮氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌CP进行系统代谢工程改造。首先,敲除竞争途径并引入外源磷酸酮醇酶(由fxpk编码)加强前体物(丙酮酸和乙酰辅酶A)供应;其次,加强主代谢流(亮氨酸途径和支链氨基酸共同途径)提高L-亮氨酸产量;随后,加强胞内NADPH的供应;最后,敲除L-亮氨酸内转运蛋白BrnQ,最终获得的可高效生产L-亮氨酸的工程菌株CP06-1在5 L生物反应器中经50 h发酵后L-亮氨酸产量达65.3 g/L,糖酸转化率25.1%。此外,为解决L-亮氨酸结晶后产生的泡沫影响菌体吸收营养和溶氧的问题,该研究采取了半连续发酵的方式在L-亮氨酸结晶前通过放液-补液来延长菌株产酸高峰期,最终5 L生物反应器发酵50 h共生产L-亮氨酸228.8 g,糖酸转化率达27.9%,较分批补料提高了11.2%。该研究为L-亮氨酸生产菌株的改造和应用提供了一定的指导价值。 展开更多
关键词 L-亮氨酸 系统代谢工程 谷氨酸棒状杆菌 乙酰辅酶A NADPH 半连续发酵
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代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产L-缬氨酸研究进展 被引量：3
12
作者 王梦蓉 黄明珠 +1 位作者 刘斌 陈雪岚 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第7期343-350,共8页
L-缬氨酸作为一种人体必需的支链氨基酸,因其具有多种生理功能被广泛应用于食品、医药、饲料及化妆品等行业。目前,微生物代谢工程技术的进步及用其构建的工程菌发酵生产具备环保、高效、无污染的特点,使微生物发酵法成为生产L-缬氨酸... L-缬氨酸作为一种人体必需的支链氨基酸,因其具有多种生理功能被广泛应用于食品、医药、饲料及化妆品等行业。目前,微生物代谢工程技术的进步及用其构建的工程菌发酵生产具备环保、高效、无污染的特点,使微生物发酵法成为生产L-缬氨酸的首选方法。该文主要阐述了谷氨酸棒杆菌中L-缬氨酸生物合成途径,并对构建L-缬氨酸高产菌株的代谢工程技术及策略进行了综述,以期为进一步提高L-缬氨酸产量提供一定的参考。 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 L-缬氨酸 生物合成途径 代谢工程
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代谢工程改造大肠杆菌高效合成L-缬氨酸 被引量：2
13
作者 李国民 闫思翰 +1 位作者 尤甲甲 饶志明 《生物工程学报》 北大核心 2025年第9期3473-3486,共14页
L-缬氨酸(L-valine)是一种重要的支链氨基酸,广泛应用于食品、医药和饲料行业,微生物发酵法已成为其主要的生产方式。然而,当前工业化生产中,L-缬氨酸工程菌株仍存在碳代谢流利用不足、辅因子供需失衡及发酵工艺优化不足等问题,限制了L... L-缬氨酸(L-valine)是一种重要的支链氨基酸,广泛应用于食品、医药和饲料行业,微生物发酵法已成为其主要的生产方式。然而,当前工业化生产中,L-缬氨酸工程菌株仍存在碳代谢流利用不足、辅因子供需失衡及发酵工艺优化不足等问题,限制了L-缬氨酸的高效合成。为进一步提升L-缬氨酸的生产性能,本研究基于实验室前期构建的一株高产L-缬氨酸大肠杆菌菌株,采用代谢工程策略优化碳流分配、平衡辅因子消耗,并结合双阶段溶氧控制发酵工艺,进一步提升了L-缬氨酸的生产性能。首先,针对丙酮酸流失问题,敲除了ldhA、poxB、pflB、frdA和pta等多个竞争途径基因,所获得的菌株VL-04在摇瓶水平产量较起始菌株提升了48%;接着进一步优化辅因子供需平衡,将ilvE基因替换为来源于枯草芽胞杆菌、具有NADH偏好的bcd基因,所得菌株VL-06摇瓶产量提高了25.8%,达到22.80 g/L;5 L生物反应器中,对VL-06菌株实施双阶段溶氧控制发酵优化,优化后在26 h内L-缬氨酸产量达到86.44 g/L,糖酸转化率为44.08%,生产强度达到3.32 g/(L·h)。本研究不仅有效缩短了L-缬氨酸发酵生产周期,降低了生产成本,也为类似采用双阶段溶氧控制的发酵生产提供了参考。 展开更多
关键词 大肠杆菌 L-缬氨酸 代谢工程 双阶段发酵优化
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利用大肠杆菌高效合成L-异亮氨酸的系统代谢工程研究 被引量：1
14
作者 魏敏华 李晓童 +5 位作者 姜亚文 周飘飘 汪凯 孙浩 芦楠 张成林 《生物技术通报》 北大核心 2025年第11期110-120,共11页
【目的】L-异亮氨酸属于必需氨基酸,在医药、食品、农业等领域应用广泛。针对现有L-异亮氨酸生产菌株存在的合成效率偏低、发酵周期长、不稳定等不足,利用系统代谢工程构建L-异亮氨酸高效合成菌株。【方法】以前期构建的L-异亮氨酸合成... 【目的】L-异亮氨酸属于必需氨基酸,在医药、食品、农业等领域应用广泛。针对现有L-异亮氨酸生产菌株存在的合成效率偏低、发酵周期长、不稳定等不足,利用系统代谢工程构建L-异亮氨酸高效合成菌株。【方法】以前期构建的L-异亮氨酸合成菌株ISO-2为研究对象,通过提高草酰乙酸和L-天冬氨酸供应、解除L-异亮氨酸的反馈抑制作用、增强L-异亮氨酸合成代谢流、平衡辅酶水平、构建柠苹酸途径以及强化输出等策略提升L-异亮氨酸合成效率。【结果】过表达ppc、pycA、aspC和aspA有效提升了草酰乙酸和L-天冬氨酸供应,菌株YL-4的L-异亮氨酸产量达到6.98 g/L。过表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA_(YI)和ilvD以及NADH依赖的二羟酸还原异构酶和亮氨酸脱氢酶编码基因ilvC_(EM)和bcd,菌株YL-8的L-异亮氨酸产量提升35.4%。过表达cimA和leuBCD构建柠苹酸途径,菌株YL-12的L-异亮氨酸产量提高至11.03 g/L,其副产物L-缬氨酸积累量降低至0.10 g/L。敲除iclR激活乙醛酸循环并利用自调节启动子PfliA动态调控α-脱氢酶编码基因sucAB转录,菌株YL-14的L-异亮氨酸产量提高至11.93 g/L。在此基础上,敲除L-异亮氨酸摄入蛋白编码基因brnQ、过表达其输出载体编码基因ygaZH,菌株YL-16经发酵44 h,L-异亮氨酸产量和转化率分别达到49.73 g/L和0.33 g/g葡萄糖。【结论】利用系统代谢工程选育出一株合成效率高、发酵周期短且稳定的L-异亮氨酸生产菌株。所用策略可为天冬氨酸族氨基酸及分支链氨基酸菌株的构建提供参考。 展开更多
关键词 L-异亮氨酸 大肠杆菌 代谢工程 代谢流 动态调控
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基于常压室温等离子体诱变和高通量筛选选育L-半胱氨酸高产菌株
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作者 洪娟 张琳培 +1 位作者 杨套伟 饶志明 《微生物学通报》 北大核心 2025年第10期4765-4780,共16页
【背景】L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用于食品、医药和化工等领域。微生物发酵法合成L-半胱氨酸已成为当前研究的热点。【目的】筛选优质L-半胱氨酸生产底盘细胞,并挖掘新的代谢靶点。【方法】通过常压室温等离子体诱变技... 【背景】L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用于食品、医药和化工等领域。微生物发酵法合成L-半胱氨酸已成为当前研究的热点。【目的】筛选优质L-半胱氨酸生产底盘细胞,并挖掘新的代谢靶点。【方法】通过常压室温等离子体诱变技术对大肠杆菌代谢改造菌株AR-0进行诱变,基于L-半胱氨酸响应型生物传感构建高通量筛选平台,最后通过全基因组测序和比较基因组学进一步对关键突变基因功能进行分析。【结果】通过诱变筛选,从4.5×10^(5)个细胞中筛选获得突变株AR3-7,产量相比出发菌株提高了2.7倍。通过全基因组测序和关键突变基因功能分析发现了crp、rpoS、dauA 3个与代谢和运输途径相关的非同义基因突变,可能是使突变菌株产量提高的原因。敲除dauA可以减少H2S产生,同时L-半胱氨酸产量比出发菌株AR-0提高了约23%。【结论】基于常压室温等离子体诱变和高通量筛选策略,成功筛选出L-半胱氨酸高产菌株,并首次报道了大肠杆菌中dauA与L-半胱氨酸合成的相关性,为后续进一步选育和开发相关优质的L-半胱氨酸生产菌株资源提供了研究基础。 展开更多
关键词 L-半胱氨酸 大肠杆菌 常压室温等离子体诱变 生物传感器 高通量筛选 CRISPR/Cas9
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λ-Red重组技术结合复合诱变提高大肠杆菌L-异亮氨酸合成能力
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作者 汪吉鹏 朱滕滕 +4 位作者 刘璐 马铖 魏晓博 刘慧燕 方海田 《食品工业科技》 北大核心 2025年第2期167-174,共8页
本研究旨在通过λ-Red重组技术结合复合诱变方法提高大肠杆菌L-异亮氨酸合成能力。以E. coli NXA为出发菌株,首先采用λ-Red同源重组敲除编码支链氨基酸转运蛋白基因brnQ,获得突变菌株E. coli NXA1。然后将E. coli NXA1经常温常压等离子... 本研究旨在通过λ-Red重组技术结合复合诱变方法提高大肠杆菌L-异亮氨酸合成能力。以E. coli NXA为出发菌株,首先采用λ-Red同源重组敲除编码支链氨基酸转运蛋白基因brnQ,获得突变菌株E. coli NXA1。然后将E. coli NXA1经常温常压等离子体(ARTP)、紫外(UV)与亚硝基胍(NTG)多轮复合诱变,以α-氨基丁酸(α-AB)为结构类似物进行筛选,筛选得到突变菌株E. coli NXA2。摇瓶发酵结果表明,在37℃、200 r/min条件下发酵40 h后,E. coli NXA1的L-异亮氨酸滴度为2.76 g/L,较E. coli NXA提高了33.98%;E. coli NXA2的L-异亮氨酸滴度为3.22 g/L,较E. coli NXA1提高了16.67%,较E. coli NXA提高了56.31%。对菌株E. coli NXA2经连续传代20代后,表现出较好的遗传稳定性。λ-Red重组技术结合复合诱变对大肠杆菌提高L-异亮氨酸合成能力有明显效果,为选育L-异亮氨酸高产菌株奠定理论基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌 λ-Red重组技术 brnQ基因 复合诱变 发酵 L-异亮氨酸
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谷氨酸棒杆菌诱导型CRISPR-Cpf1/dsDNA双质粒基因编辑系统的建立及应用
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作者 王婷 石佳宝 +1 位作者 高印 陈宁 《中国酿造》 北大核心 2025年第8期35-41,共7页
针对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因编辑效率较低和操作耗时长等问题,该研究采用诱导型启动子PrpR-PrpD2表达Cpf1,将重组和切割事件分离,建立了一种高效的诱导型CRISPR-Cpf1/dsDNA双质粒基因编辑系统,并通过比较组成型... 针对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因编辑效率较低和操作耗时长等问题,该研究采用诱导型启动子PrpR-PrpD2表达Cpf1,将重组和切割事件分离,建立了一种高效的诱导型CRISPR-Cpf1/dsDNA双质粒基因编辑系统,并通过比较组成型和诱导型启动子表达Cpf1蛋白的效果,统计该基因编辑系统的基因编辑效率。最后以不产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株,采用该系统构建高产L-丝氨酸重组菌株。结果表明,诱导型CRISPR-Cpf1/dsDNA双质粒基因编辑系统的基因敲除效率为(66.67±1.53)%,基因整合效率为(14.29±1.50)%,均显著高于组成型启动子组(P<0.05)。此外,利用诱导型CRISPR-Cpf1/dsDNA双质粒基因编辑系统成功构建了一株高产L-丝氨酸重组菌株SW-3,其L-丝氨酸产量为10.51 mg/L,说明诱导型CRISPR-Cpf1/dsDNA双质粒基因编辑系统在谷氨酸棒杆菌代谢工程改造中具有可行性,对加速谷氨酸棒杆菌代谢工程改造进程及推动其在氨基酸等高附加值产品研发上的应用将产生深远意义。 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 CRISPR-Cpf1基因编辑系统 PrpR-PrpD2诱导型启动子 L-丝氨酸
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大肠杆菌利用不同碳源生产N-乙酰神经氨酸的研究
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作者 伊进行 宗媛 +8 位作者 孙超 张晓雨 耿自豪 孙文超 张春月 刘政凯 熊雯雯 唐宇琳 马倩 《食品与发酵工业》 CAS 北大核心 2025年第1期18-25,共8页
N-乙酰神经氨酸是最常见的一种唾液酸,通常位于细胞膜表面糖蛋白和糖脂的末端,具有多种生物学功能。由于其独特的生理和生化性质,N-乙酰神经氨酸在制药、化妆品和食品行业的应用越来越广泛,需求量不断增加。N-乙酰神经氨酸在大肠杆菌中... N-乙酰神经氨酸是最常见的一种唾液酸,通常位于细胞膜表面糖蛋白和糖脂的末端,具有多种生物学功能。由于其独特的生理和生化性质,N-乙酰神经氨酸在制药、化妆品和食品行业的应用越来越广泛,需求量不断增加。N-乙酰神经氨酸在大肠杆菌中的异源生物合成需要与中心碳代谢过程竞争前体物,因此,碳源利用效率,以及碳代谢流在细胞生长与N-乙酰神经氨酸合成中的分配,直接影响N-乙酰神经氨酸的合成效率。该研究从碳源利用调控角度,比较了葡萄糖、甘油,以及两者混合利用对N-乙酰神经氨酸合成的影响。在单一葡萄糖碳源条件下,菌株NEU5AC-2中pfkA的敲除减弱了中心碳代谢的强度,减少了副产物乙酸的积累,协调了前体物N-乙酰甘露糖胺与磷酸烯醇式丙酮酸的供应,5 L发酵罐分批补料发酵38 h产生23.8 g/L N-乙酰神经氨酸,获得了较高的发酵生产水平,具有较强的工业应用潜力。该研究可以为其他以糖酵解途径的中间代谢物为前体物的异源产物合成提供借鉴。 展开更多
关键词 大肠杆菌 N-乙酰神经氨酸 混合碳源 代谢工程
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代谢工程改造大肠杆菌生产O-乙酰-L-高丝氨酸 被引量：2
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作者 黄良刚 高峰 +5 位作者 许诺然 周俊平 牛坤 张博 柳志强 郑裕国 《生物工程学报》 北大核心 2025年第1期256-270,共15页
O-乙酰-L-高丝氨酸(O-acetyl-L-homoserine,OAH)是一种平台化合物,可用于生产L-蛋氨酸和其他有价值的化合物,但产量低和转化率低等问题限制了其工业化生产和应用。为了解决这一问题,本研究以前期构建的L-高丝氨酸宿主大肠杆菌HS33为底盘... O-乙酰-L-高丝氨酸(O-acetyl-L-homoserine,OAH)是一种平台化合物,可用于生产L-蛋氨酸和其他有价值的化合物,但产量低和转化率低等问题限制了其工业化生产和应用。为了解决这一问题,本研究以前期构建的L-高丝氨酸宿主大肠杆菌HS33为底盘,采用系统代谢工程策略构建了一株高产OAH的菌株。首先,强化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)积累、丙酮酸利用以及OAH合成途径(过表达aspB、aspA、thrAC1034T),获得积累13.37 g/L OAH的初始菌株;随后,整合筛选的辅因子供应基因解决还原力和能量供应问题,将产量提升至15.79 g/L;之后,进一步强化乙酸回用途径,改善乙酰辅酶A供应,结合多源乙酰基转移酶MetX表达使得改造获得的工程菌株OAH28的OAH产量提升至17.49 g/L。最终,在5 L发酵罐中进行生产性能测试,工程菌株OAH产量达到47.12 g/L,葡萄糖转化率为32%,生产强度为0.59 g/(L·h)。上述研究结果为OAH的代谢工程改造实现产量提升提供了一定的理论基础,也为工业化生产提供了有效的借鉴和参考。 展开更多
关键词 大肠杆菌 O-乙酰-L-高丝氨酸 代谢工程 乙酸回用 辅因子工程
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代谢工程改造大肠杆菌高效合成L-瓜氨酸 被引量：2
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作者 胥琳峰 于文文 +7 位作者 朱学文 张权威 武耀康 李江华 堵国成 吕雪芹 陈坚 刘龙 《生物工程学报》 北大核心 2025年第1期242-255,共14页
L-瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸,在人体健康方面发挥着重要作用,具有很大的市场需求。尽管微生物细胞工厂已被广泛用于生物合成,但在L-瓜氨酸生物合成方面仍存在着遗传不稳定和效率低等挑战。本研究以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株构建了... L-瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸,在人体健康方面发挥着重要作用,具有很大的市场需求。尽管微生物细胞工厂已被广泛用于生物合成,但在L-瓜氨酸生物合成方面仍存在着遗传不稳定和效率低等挑战。本研究以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株构建了一株高效、无质粒、无需诱导的L-瓜氨酸生产菌株。首先阻断L-瓜氨酸降解并解除反馈抑制,构建出L-瓜氨酸合成底盘菌株,其产量达到0.43 g/L。随后采用推拉抑制策略增强了L-瓜氨酸生物合成,使产量提高到6.0 g/L。接着,强化了NADPH合成和L-瓜氨酸转运系统以提高合成效率,最终L-瓜氨酸产量达到11.6 g/L。最后,在3 L发酵罐中进行分批补料发酵,L-瓜氨酸产量达到44.9 g/L。本研究为L-瓜氨酸的工业化生产奠定了基础,为其他氨基酸代谢网络的改造提供了思路。 展开更多
关键词 L-瓜氨酸 大肠杆菌 代谢工程 L-脯氨酸 反馈抑制
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