VI型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)是迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的一种新型毒力因子。迟缓爱德华氏菌毒力蛋白P(E.tarda virulence protein P,EvpP)是T6SS的效应蛋白,但目前对EvpP功能机制的研究仍十分有限。【目...VI型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)是迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的一种新型毒力因子。迟缓爱德华氏菌毒力蛋白P(E.tarda virulence protein P,EvpP)是T6SS的效应蛋白,但目前对EvpP功能机制的研究仍十分有限。【目的】解析EvpP的生物学功能,深入探究T6SS在E.tarda致病过程中的作用。【方法】构建E.tarda的evpP基因缺失株(ΔevpP)和回补株(ΔevpP-C),在此基础上开展evpP基因缺失对E.tarda生物学特性以及巨噬细胞感染影响的研究。【结果】E.tarda野生株、ΔevpP和ΔevpP-C在生长曲线和生理生化特性方面并无显著差异。相较于野生株,ΔevpP的运动性、生物被膜生成能力以及感染RAW264.7巨噬细胞的黏附率、胞内增殖率和触发细胞自噬的能力均显著下降,但能诱发巨噬细胞分泌更多的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。ΔevpP-C的胞内增殖能力未完全恢复至野生株水平,但其他表型均得到完全恢复。【结论】EvpP不影响E.tarda的生长和生理生化特性,但能不同程度地增强该菌的运动性、生物膜形成能力以及对巨噬细胞的黏附、胞内增殖能力和自噬活性,且能抑制E.tarda感染的巨噬细胞分泌更多TNF-α。研究结果进一步证实EvpP参与E.tarda的致病过程,并在其中发挥重要作用。展开更多
为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombina...为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。展开更多
文摘VI型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)是迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的一种新型毒力因子。迟缓爱德华氏菌毒力蛋白P(E.tarda virulence protein P,EvpP)是T6SS的效应蛋白,但目前对EvpP功能机制的研究仍十分有限。【目的】解析EvpP的生物学功能,深入探究T6SS在E.tarda致病过程中的作用。【方法】构建E.tarda的evpP基因缺失株(ΔevpP)和回补株(ΔevpP-C),在此基础上开展evpP基因缺失对E.tarda生物学特性以及巨噬细胞感染影响的研究。【结果】E.tarda野生株、ΔevpP和ΔevpP-C在生长曲线和生理生化特性方面并无显著差异。相较于野生株,ΔevpP的运动性、生物被膜生成能力以及感染RAW264.7巨噬细胞的黏附率、胞内增殖率和触发细胞自噬的能力均显著下降,但能诱发巨噬细胞分泌更多的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。ΔevpP-C的胞内增殖能力未完全恢复至野生株水平,但其他表型均得到完全恢复。【结论】EvpP不影响E.tarda的生长和生理生化特性,但能不同程度地增强该菌的运动性、生物膜形成能力以及对巨噬细胞的黏附、胞内增殖能力和自噬活性,且能抑制E.tarda感染的巨噬细胞分泌更多TNF-α。研究结果进一步证实EvpP参与E.tarda的致病过程,并在其中发挥重要作用。
文摘为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。
