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草鱼GCRV-Ⅱ抗原检测胶体金试剂盒研发与应用
1
作者 吴海霞 冯建华 +8 位作者 芦雅南 高娃 闫慧 许丹 计晓花 吕利群 徐镇 王俊亚 邹钧 《水产学报》 北大核心 2026年第3期184-196,共13页
【目的】基于胶体金免疫层析方法研发草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型(GCRV-Ⅱ)快速检测技术。【方法】利用特异识别GCRV-Ⅱ外衣壳蛋白VP35的两株不同抗原表位单克隆抗体VP35#8和VP35#18,采用双抗体夹心法研发速测技术,通过20 nm胶体金颗粒标记VP35#... 【目的】基于胶体金免疫层析方法研发草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型(GCRV-Ⅱ)快速检测技术。【方法】利用特异识别GCRV-Ⅱ外衣壳蛋白VP35的两株不同抗原表位单克隆抗体VP35#8和VP35#18,采用双抗体夹心法研发速测技术,通过20 nm胶体金颗粒标记VP35#8抗体制备金标垫反应区,VP35#18抗体包被于硝酸纤维素膜(NC膜),T线作为检测区,C线标记羊抗鼠IgG作为质控区,各组分依次组装获得GCRV-Ⅱ胶体金免疫层析试纸条用于制备检测试剂盒。【结果】该试剂盒在10 min内可完成样本检测,且对鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒Ⅲ型(CyHV-3)及草鱼GCRV-Ⅰ均无交叉反应。使用本试剂盒随机检测10尾草鱼样本及感染GCRV-Ⅱ稀有鮈鲫的不同组织,其检测结果与GCRV-Ⅱ国标法(GB/T 36 190—2018)检测结果相符,进一步证实本试剂盒具有较好的检测准确性。灵敏度验证实验和稳定性验证实验结果显示,试剂盒检测灵敏度高达1.76×10^(2)拷贝/μL,4~25℃储存12个月后检测线与质控线仍正常显色,储存稳定性良好。【结论】本研究成功研制出GCRV-Ⅱ抗原检测试剂盒,且该试剂盒具备操作便捷、快速及高特异性等优点,对GCRV-Ⅱ快速诊断和草鱼出血病防控具有重要实践意义。本研究将进一步推动水生病毒性疾病快速检测技术的发展,从而为我国鱼类健康养殖和病毒性疾病的防控提供关键技术支撑。 展开更多
关键词 草鱼 GCRV-Ⅱ 出血病 胶体金检测试剂盒 快速检测 单克隆抗体
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鱼类虹彩病毒病的诊断及防治方法
2
作者 关丽 《养殖与饲料》 2026年第1期135-137,共3页
近年来,我国水产养殖规模逐步扩大,新的养殖技术及养殖模式也层出不穷,但水产养殖自身具有局限性,病害便是威胁渔业经济的重大因素。普通的细菌性疾病用药尚可控制,但是由病毒导致的疾病,都具有传染性强、死亡率高、发病快的特征,其中... 近年来,我国水产养殖规模逐步扩大,新的养殖技术及养殖模式也层出不穷,但水产养殖自身具有局限性,病害便是威胁渔业经济的重大因素。普通的细菌性疾病用药尚可控制,但是由病毒导致的疾病,都具有传染性强、死亡率高、发病快的特征,其中虹彩病毒特异性低,是一种危害水产动物种类较多的病毒。本文就虹彩病毒的特性及分类、传播途径、防治方法进行了综述,以期为生产实践提供参考。 展开更多
关键词 水产养殖 虹彩病毒 传播途径 防治方法
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鲤疱疹病毒2型和3型双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用
3
作者 陈永聪 方勤美 +1 位作者 柯翎 施少华 《海洋渔业》 北大核心 2025年第5期619-628,共10页
为快速、高效鉴别鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)和3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3),针对鲤疱疹病毒基因组的保守序列,设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测CyHV-2和CyHV-3的双重TaqMan qPCR方法,并对... 为快速、高效鉴别鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)和3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3),针对鲤疱疹病毒基因组的保守序列,设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测CyHV-2和CyHV-3的双重TaqMan qPCR方法,并对该方法特异性、灵敏度和重复性进行了评价。同时利用该方法对实验室保存的金鱼(Carassius auratus var.)和锦鲤(Cryprinus carpiod haematopterus)临床样品进行检测。结果显示,该方法能特异性检测CyHV-2和CyHV-3,而对水产养殖中其他常见DNA或RNA病毒无交叉反应;敏感性实验显示,该方法的最低检测量为10 copies·μL^(-1),表明该方法具有较高的灵敏度;测定结果在组内和组间重复变异系数均小于3%,重复性良好。使用该方法对实验室保存的37份金鱼和78份锦鲤临床样品进行检测,病毒检出结果与用国家标准(GB/T 36194-2018)和行业标准(SC/T 7212.1-2011)方法检测的结果一致。对5份CyHV-2(金鱼样品)和5份CyHV-3(锦鲤样品)阳性的临床样品进行混合后检测,结果均为CyHV-2和CyHV-3双阳性。研究表明,本研究建立的双重TaqMan qPCR检测方法具有特异性强、灵敏度高和重复性好等优点,可以为临床上CyHV-2和CyHV-3的快速定量检测和鉴别诊断提供新的工具和方法。 展开更多
关键词 鲤疱疹病毒2型 鲤疱疹病毒3型 双重TaqMan qPCR
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大口黑鲈蛙虹彩病毒的分离鉴定与病理学研究
4
作者 李佳宇 绳秀珍 +3 位作者 唐小千 邢婧 迟恒 战文斌 《中国海洋大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第3期184-192,共9页
为了丰富大口黑鲈病毒(Largemouth bass virus,LMBV)的流行病学资料,深入理解病毒的特性及致病机理,本文从山东省烟台市某养殖场采集了患病的大口黑鲈(Micropterus salmoides),采用细胞培养、PCR扩增及系统进化分析等方法进行病原的分... 为了丰富大口黑鲈病毒(Largemouth bass virus,LMBV)的流行病学资料,深入理解病毒的特性及致病机理,本文从山东省烟台市某养殖场采集了患病的大口黑鲈(Micropterus salmoides),采用细胞培养、PCR扩增及系统进化分析等方法进行病原的分离鉴定。肉眼可见患病大口黑鲈多处出现红肿出血的症状,显微镜检查未发现寄生虫和细菌感染。将病鱼组织匀浆液接种鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini,EPC),出现明显的细胞病变;对EPC细胞进行透射电镜观察,在细胞质内发现直径约为150 nm的成熟病毒粒子,病毒粒子呈现虹彩病毒典型的正六边形结构。根据NCBI公布的蛙病毒的主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因序列设计引物,经PCR扩增和测序后得到一段长度为1392 bp的基因序列。对获得的MCP序列进行系统进化分析,发现该病毒株与蛙病毒属的其他13种病毒聚成一支,与Santee-Cooper蛙病毒(SCRV)、鳜鱼虹彩病毒(MRV)、大口黑鲈溃疡综合征病毒(LBUSV)等7株病毒的MCP序列同源性高达100%。向健康大口黑鲈腹腔注射200μL的105 TCID 50/mL的病毒液,7 d的累计死亡率可达100%。研究结果表明,我们分离到的病毒为虹彩病毒科蛙病毒属成员,将该病毒株命名为大口黑鲈蛙虹彩病毒LMBV-CN2022株。对病鱼组织进行病理学观察,石蜡切片苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色结果显示肝、脾、肾组织中出现大量铁血黄素沉积,透射电镜结果显示脾和体肾中存在病毒粒子。 展开更多
关键词 大口黑鲈 蛙病毒 分离鉴定 组织病理
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大口黑鲈双RNA病毒VP2蛋白原核表达及多克隆抗体制备
5
作者 张秋爽 马宝福 +6 位作者 郑果 林强 梁红茹 牛银杰 罗霞 李宁求 付小哲 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第7期18-25,共8页
【目的】研究大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus,LBBV)VP2蛋白的抗原性,为后续LBBV疫苗研究提供基础材料。【方法】PCR扩增LBBV VP2基因,构建重组质粒pET-VP2,PCR和测序鉴定后转入大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。以纯化的重... 【目的】研究大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus,LBBV)VP2蛋白的抗原性,为后续LBBV疫苗研究提供基础材料。【方法】PCR扩增LBBV VP2基因,构建重组质粒pET-VP2,PCR和测序鉴定后转入大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。以纯化的重组VP2蛋白为抗原,皮下多点注射免疫新西兰大白兔,耳中央动脉采血并分离血清,通过间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;利用Ni-NTA镍离子亲和层析纯化抗体,用BCA法测定纯化后抗体的浓度。通过Western blot和间接免疫荧光鉴定VP2多克隆抗体特异性;采用固定病毒-稀释血清法测定血清的中和效价。【结果】PCR扩增获得了1266 bp的VP2基因片段。PCR和测序鉴定结果表明,重组质粒pET-VP2构建成功。VP2重组蛋白的诱导表达和纯化试验结果获得了64 ku的重组蛋白,符合预期大小。成功制备了VP2蛋白的多克隆抗体,其质量浓度为10 mg/mL,效价为1∶1024000,可特异性识别LBBV VP2蛋白;血清中和试验结果显示,VP2多抗中和抗体效价为1∶64。【结论】成功获得了大肠杆菌表达的LBBV重组VP2蛋白,制备了抗VP2蛋白的多克隆抗体,该多抗对LBBV具有中和作用。 展开更多
关键词 大口黑鲈 大口黑鲈双RNA病毒 VP2蛋白 多克隆抗体
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两种四氢异喹啉类药物体外抗大口黑鲈蛙虹彩病毒效果的研究
6
作者 王慧 袁雪梅 +3 位作者 陈静 焦锦彪 葛海霞 姚嘉赟 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期465-472,共8页
为探究四氢异喹啉类药物β-咔啉-3-羧酸乙酯(β-CCE)和Boc-D-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Boc-DTic-OH)对大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)的体外抗病毒效果,本研究利用显微观察法测定细胞病变(CPE)效应、荧光定量PCR(qPCR)法检测病毒拷贝数以及... 为探究四氢异喹啉类药物β-咔啉-3-羧酸乙酯(β-CCE)和Boc-D-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Boc-DTic-OH)对大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)的体外抗病毒效果,本研究利用显微观察法测定细胞病变(CPE)效应、荧光定量PCR(qPCR)法检测病毒拷贝数以及CCK-8法测定细胞活力,从阻断、抑制及直接杀灭3个方面,分析β-CCE和Boc-D-Tic-OH的体外抗LMBV的活性。结果显示,β-CCE和Boc-D-Tic-OH对胖头鱼肌肉细胞(FHM)的安全浓度分别为10μg/mL和100μg/mL,阻断结果显示两种药物均可显著降低FHM的CPE,其阻断率均在95%以上,药物处理组病毒拷贝数极显著低于LMBV对照组(P<0.01);抑制结果显示,两种药物可一定程度降低FHM的CPE,10μg/mLβ-CCE处理组对病毒的抑制率为76.86%,β-CCE处理组以及100μg/mL、10μg/mL Boc-D-Tic-OH处理组病毒拷贝数均极显著低于LMBV对照组(P<0.01),β-CCE、Boc-D-Tic-OH发挥最好阻断效果的作用时间分别为2 h和1 h;药物作用6 h抑制效果最好;直接杀灭结果显示,0.1μg/mLβ-CCE能一定程度降低FHM的CPE,0.1μg/mLβ-CCE和10μg/mL Boc-D-Tic-OH对病毒的直接杀灭率最高,分别为90.93%和102.21%,且可极显著降低病毒拷贝数(P<0.01),两种发挥最佳直接杀灭作用的时间为2 h。上述结果表明,两种四氢异喹啉类药物均具有较好的体外抗LMBV效果,本研究为抗LMBV药物的研制提供参考。 展开更多
关键词 大口黑鲈 蛙虹彩病毒 四氢异喹啉类药物 抗病毒活性
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酸枣仁醇提物及白桦脂酸抗神经坏死病毒的作用机制
7
作者 徐伟强 玉洁莹 +7 位作者 黄琳 余庆 刘明珠 王劭雯 孙云 韩书煜 秦启伟 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1787-1801,共15页
【目的】探究酸枣仁醇提物(SZSE)及其活性成分白桦脂酸(BA)抗鱼类神经坏死病毒(NNV)的作用机制,为研发绿色、高效、无污染的抗NNV渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光试验确定SZSE及其活性成分BA的... 【目的】探究酸枣仁醇提物(SZSE)及其活性成分白桦脂酸(BA)抗鱼类神经坏死病毒(NNV)的作用机制,为研发绿色、高效、无污染的抗NNV渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光试验确定SZSE及其活性成分BA的细胞安全工作浓度,再利用光学显微镜观察、结晶紫染色及实时荧光定量PCR检测SZSE及其活性成分BA的抗NNV效果,并以实时荧光定量PCR探析二者的抗NNV作用机制。【结果】SZSE及其活性成分BA的细胞安全工作浓度分别为:SZSE≤50μg/mL,BA≤6.25μg/mL,且50μg/mL SZSE或6.25μg/mL BA对卵形鲳鲹脾脏成纤维细胞(TOSF)无毒性作用。NNV与50、25、12.5μg/mL的SZSE或6.25、3.125、1.5625μg/mL的BA分别共孵育TOSF细胞,48 h后发现药物处理的TOSF细胞病变效应(CPEs)明显低于NNV组;结晶紫染色发现药物处理后活的TOSF细胞数量也明显多于NNV组;实时荧光定量PCR检测结果表明,经药物处理后TOSF细胞中NNV的CP基因相对表达量均极显著低于NNV组(P<0.01),且呈剂量依赖关系。SZSE及其活性成分BA在NNV感染前后2 h分别处理TOSF细胞均具有抗病毒效果,表明SZSE及其活性成分BA不仅具有预防病毒感染的作用,还能用于治疗病毒感染。此外,SZSE及其活性成分BA通过与NNV粒子相互作用、干扰NNV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制阶段,以及调控CAT、GSH-Px、HO-1、TGF、Keap1和Nrf2等免疫相关基因的表达,而发挥抗病毒作用。【结论】SZSE及其活性成分BA具有抑制NNV感染的功能,不仅能干扰NNV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制阶段,还通过调控免疫相关基因的表达而发挥抗病毒作用。可见,SZSE及其活性成分BA具有开发为绿色、高效抗NNV渔用药物的潜力。 展开更多
关键词 酸枣仁醇提物(SZSE) 白桦脂酸(BA) 神经坏死病毒(NNV) 抗病毒 安全工作浓度
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鲤春病毒血症的检测技术与防控研究进展 被引量：1
8
作者 葛明峰 徐胜威 +4 位作者 景宏丽 王建平 高隆英 付志明 王雯琼 《宁波大学学报(理工版)》 2025年第1期100-106,共7页
鲤春病毒血症(Spring Viremia of Carp,SVC)是由鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV)引起的一种急性、出血性的病毒性疾病.SVC是影响鲤科鱼类养殖产业及观赏鱼类贸易较为严重的疾病,目前尚无有效的治疗药物,只能通过... 鲤春病毒血症(Spring Viremia of Carp,SVC)是由鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV)引起的一种急性、出血性的病毒性疾病.SVC是影响鲤科鱼类养殖产业及观赏鱼类贸易较为严重的疾病,目前尚无有效的治疗药物,只能通过消毒、检验检疫、日常管理等方式进行预防.对该病的诊断主要以《鲤春病毒血症诊断规程》(GB/T15805.5—2018)为依据,同时基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)等快速检测技术和试剂盒的开发与应用为SVC防治提供新方法.为此,针对SVC的流行特点、临床症状、近几年监测情况、病原检测技术、致病机理、疫苗和药物防控等方面进行了梳理和总结,并展望了SVC的防治策略和方向,为今后更深入研究该疫病提供参考. 展开更多
关键词 鲤春病毒血症 鲤春病毒血症病毒 检测技术 防治方法
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养殖水体的核酸富集技术在鳜蛙虹彩病毒检测中的应用及其性能评价
9
作者 许童辉 任馨雨 +4 位作者 任弋林 张俊哲 翁少萍 许丹 王姝然 《上海海洋大学学报》 北大核心 2025年第6期1263-1269,共7页
旨在建立一种基于磁珠富集法的养殖水体中鳜蛙虹彩病毒的检测方法。结果显示,该方法能有效富集养殖水样中的鳜蛙虹彩病毒,通过常规PCR法扩增可获得特异性条带。定量分析显示,磁珠富集法结合实时荧光定量PCR技术,其灵敏度达到0.01 copies... 旨在建立一种基于磁珠富集法的养殖水体中鳜蛙虹彩病毒的检测方法。结果显示,该方法能有效富集养殖水样中的鳜蛙虹彩病毒,通过常规PCR法扩增可获得特异性条带。定量分析显示,磁珠富集法结合实时荧光定量PCR技术,其灵敏度达到0.01 copies/μL的检测限。可行性分析证明,磁珠富集法与qPCR检测结果具有90%的一致性,且适用于全自动核酸检测平台。与传统qPCR方法相比,该方法在保持高检测一致性的同时,具备更好的抗干扰能力和操作便捷性。本研究开发的检测技术具有操作简便、灵敏度高等特点,为养殖水体病原监测和早期预警提供了可靠的技术支持,对水产养殖病害防控具有重要实践意义。 展开更多
关键词 鳜蛙虹彩病毒 养殖水体 病毒检测 磁珠法
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基于核酸适体功能化纳米磁珠的石斑鱼虹彩病毒检测
10
作者 夏悦婷 余庆 +10 位作者 黄琳 黄静 覃向谋 赵明明 韦冬冬 王浩 凌飞 常彦磊 许伟江 刘明珠 李鹏飞 《广东海洋大学学报》 北大核心 2025年第3期21-27,共7页
【目的】开发一种基于核酸适体功能化纳米磁珠的石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)快速检测新方法,以解决传统病毒检测技术操作繁琐、耗时长、设备依赖性强等问题。【方法】将前期筛选获得的可特异性识别SGIV的核酸适... 【目的】开发一种基于核酸适体功能化纳米磁珠的石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)快速检测新方法,以解决传统病毒检测技术操作繁琐、耗时长、设备依赖性强等问题。【方法】将前期筛选获得的可特异性识别SGIV的核酸适配体进行优化及修饰,获得核酸适配体Q5c,并将其与纳米磁珠进行偶联,构建核酸适配体偶联磁性纳米探针(Aptamer magnetic nanobeads,Q5c-MNPs)。利用多病原交叉实验验证Q5c-MNPs对SGIV感染细胞的特异性靶向识别,采用流式细胞术、荧光定量PCR等技术系统评价探针的稳定性、灵敏度等关键性能指标。【结果】Q5c-MNPs可特异性识别SGIV感染的细胞,并在500 nmol/L浓度下孵育时间短至1 min,在4~37℃温度范围内检测性能稳定。检测灵敏度达1×10^(3)个/mL,与RT-qPCR检测灵敏度相当。而本方法检测周期仅需2h,较常规分子检测方法效率显著提升。【结论】成功构建Q5c-MNPs检测体系,该体系兼具高特异性、高灵敏度和快速响应等优势,为开发水产病害现场快速检测试剂盒奠定重要技术基础。 展开更多
关键词 石斑鱼虹彩病毒 核酸适配体Q5c 纳米磁珠 快速检测
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单宁酸抗大口黑鲈弹状病毒的作用机制
11
作者 玉洁莹 顾屹 +7 位作者 黄琳 王浩 余庆 刘明珠 韩书煜 秦启伟 凌飞 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1823-1833,共11页
【目的】从大口黑鲈弹状病毒(MSRV)感染细胞的生命周期探究单宁酸在MSRV感染过程中的潜在作用机制,为研发高效安全的抗MSRV渔用药物提供理论依据。【方法】以胖头鱥肌肉细胞系(FHM)为模型,通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光染色... 【目的】从大口黑鲈弹状病毒(MSRV)感染细胞的生命周期探究单宁酸在MSRV感染过程中的潜在作用机制,为研发高效安全的抗MSRV渔用药物提供理论依据。【方法】以胖头鱥肌肉细胞系(FHM)为模型,通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光染色分析单宁酸毒性,确定其安全工作浓度;然后使用结晶紫染色评估单宁酸对MSRV的抑制作用,利用实时荧光定量PCR检测单宁酸体外抗MSRV效果及探析其作用机制,包括单宁酸对MSRV粒子及MSRV吸附宿主细胞表面、侵入细胞与细胞内复制各阶段的影响。【结果】综合光学显微镜观察与CCK-8检测结果,确定单宁酸对FHM细胞的安全工作浓度为0.0125 mg/mL;以0.0125 mg/mL单宁酸孵育36 h后,FHM细胞的骨架结构仍然保持完整,未观察到核膜皱缩或染色质凝聚等异常现象。将0.0125、0.00625和0.003125 mg/mL的单宁酸分别与MSRV共孵育处理,能有效降低MSRV感染FHM细胞产生的病变效应,且FHM细胞中MSRV的N基因相对表达量极显著低于未经单宁酸处理的MSRV感染细胞(P<0.01,下同)。在经单宁酸处理的MSRV感染FHM细胞中,MSRV的N基因相对表达量和病毒滴度均极显著低于未经单宁酸处理的MSRV感染FHM细胞,即单宁酸可直接作用于MSRV粒子,致使其感染能力降低。此外,在MSRV感染的吸附、侵入和复制各阶段以单宁酸进行处理,FHM细胞中MSRV的N基因相对表达量均极显著低于未经单宁酸处理的MSRV感染细胞,即单宁酸通过干扰MSRV感染过程的吸附、侵入与复制而发挥抗病毒作用。【结论】单宁酸对MSRV具有良好的抗病毒作用,可直接作用于MSRV粒子,且对MSRV的吸附、侵入与复制各阶段均有抑制作用,具有开发成高效安全抗MSRV渔用药物的潜力。 展开更多
关键词 大口黑鲈弹状病毒(MSRV) 单宁酸 抗病毒机制 细胞病变效应
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激活式核酸适配体LYGV1c对石斑鱼虹彩病毒的特异性识别与检测 被引量：1
12
作者 刘明珠 谢瑾琨 +7 位作者 余庆 黄静 王一兵 徐继卫 常彦磊 黄广杰 韩书煜 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1704-1714,F0002,共12页
【目的】构建能特异性识别石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的激活式核酸适配体探针,为开发特异性识别SGIV的快速检测试剂盒提供技术支持,实现对SGIV感染的早期诊断及精准防控。【方法】基于可特异性识别SGIV感染宿主细胞的核酸适配体LYGV1,通过加... 【目的】构建能特异性识别石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的激活式核酸适配体探针,为开发特异性识别SGIV的快速检测试剂盒提供技术支持,实现对SGIV感染的早期诊断及精准防控。【方法】基于可特异性识别SGIV感染宿主细胞的核酸适配体LYGV1,通过加入T链、C链、荧光基团及淬灭基团等功能化修饰,成功构建获得靶标激活式核酸适配体TAA-LYGV1c;然后通过流式细胞仪分析、激光共聚焦显微镜观察及实时荧光定量PCR等技术系统验证TAALYGV1c对SGIV的特异性识别能力,并对其最适工作浓度、孵育时间、孵育温度及识别靶细胞检测限等条件进行优化,以评估TAA-LYGV1c的可操作性;最后构建SGIV感染模型,通过流式细胞仪检测分析和实时荧光定量PCR进一步探究TAA-LYGV1c在实际生产中的应用价值。【结果】加入TAA-LYGV1c后SGIV感染组石斑鱼脾脏(GS)细胞的荧光值极显著高于未加入TAA-LYGV1c的SGIV感染组(P<0.01,下同),同时极显著高于空白对照组和神经坏死病毒(NNV)感染组,说明TAA-LYGV1c可特异性识别SGIV感染。TAA-LYGV1c的最适工作浓度为500 nmol/L,最适孵育温度为28℃,最短孵育1 min即可检测到荧光。不同检测方法的最低检测限存在一定差异,其中,流式细胞仪检测分析TAA-LYGV1c识别靶细胞的检测限为5×10^(3)个/mL,荧光酶标仪检测分析的最低检测限与实时荧光定量PCR检测的最低检测限均为500个/mL,即检测灵敏度与仪器的检测原理存在一定关联。在活体检测中,基于TAA-LYGV1c的流式细胞仪检测分析结果与实时荧光定量PCR检测结果一致,进一步证实TAA-LYGV1c能特异性识别SGIV感染,也说明核酸适配体在水产养殖病原检测方面具有潜在的应用价值。【结论】开发的激活式核酸适配体TAA-LYGV1c具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势,可实现对SGIV感染的早期快速诊断,为开发特异性识别SGIV的快速检测试剂盒提供技术支持。 展开更多
关键词 石斑鱼虹彩病毒(SGIV) 核酸适配体 TAA-LYGV1c 快速检测
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鲈鳜主要病毒性病原三重荧光定量PCR检测方法的建立及应用
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作者 谭红连 韦剑成 +5 位作者 李莉萍 童桂香 苏美珍 韦信贤 杨明伟 陈静 《南方农业学报》 北大核心 2025年第8期2651-2661,共11页
【目的】建立能同时检测鲈鳜虹彩病毒(RanaV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和鲈形目鱼类弹状病毒(PFRV)的三重荧光定量PCR,为鲈鳜养殖过程中的RanaV、ISKNV、PFRV检疫、监测及临床诊断等提供简便且高效的检测方法。【方法】分别根据RanaV... 【目的】建立能同时检测鲈鳜虹彩病毒(RanaV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和鲈形目鱼类弹状病毒(PFRV)的三重荧光定量PCR,为鲈鳜养殖过程中的RanaV、ISKNV、PFRV检疫、监测及临床诊断等提供简便且高效的检测方法。【方法】分别根据RanaV-MCP基因、ISKNV-MCP基因、PFRV-G基因的保守序列设计特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段克隆至pGM-T载体上构建重组质粒pGM-T-MCP^(RanaV)、pGM-T-MCP^(ISKNV)和pGM-T-G^(PFRV),其中,pGM-T-MCP^(RanaV)、pGM-T-MCP^(ISKNV)分别作为RanaV和ISKNV的标准品DNA,pGM-T-G^(PFRV)则以SalⅠ酶切后经体外转录获得PFRV标准品RNA;以标准品为模板进行三重荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线制定,并分别进行敏感性、特异性、重复性及临床应用试验。【结果】优化后的三重荧光定量PCR反应体系30.0μL:2×Fast One Step Probe RT-qPCR Mix 15.0μL,引物RanaV-qF/RanaV-qR(10μmol/L)、ISKNV-qF/ISKNV-qR(10μmol/L)、PFRV-qF/PFRV-qR(10μmol/L)各0.6μL,探针RanaV-qP(5μmol/L)0.9μL,探针ISKNV-qP(5μmol/L)0.9μL,探针PFRV-qP(5μmol/L)1.2μL,核酸模板3.0μL,灭菌DEPC水补足至30.0μL。建立的三重荧光定量PCR对RanaV、ISKNV和PFRV标准品均具有较高的扩增效率(Eff.>95.0%),其标准曲线线性关系良好(RSq≥0.999),可实现对RanaV、ISKNV和PFRV的同步定量分析;对RanaV、ISKNV、PFRV标准品的检测灵敏度可达10 copies/反应,对鲈鳜组织样品的检测灵敏度为10 copies/mg;与草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)等鱼类常见病原均无交叉反应;检测RanaV、ISKNV、PFRV的组内及组间重复试验的C_t值变异系数均低于2.00%。采用建立的三重荧光定量PCR对采自广西各地养殖场的鲈鳜样品(大口黑鲈95份,鳜68份)进行检测,结果发现,RanaV阳性检出率为19.0%,ISKNV阳性检出率为14.7%,PFRV阳性检出率为4.3%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的三重荧光定量PCR能同时检测RanaV、ISKNV和PFRV,具有灵敏度高、特异性强、准确可靠、操作简单、快速高效的特点,可为鲈鳜的苗种检疫、疫情监测及临床诊断提供更简便、更高效的技术手段。RanaV、ISKNV和PFRV感染在广西鲈鳜养殖中已流行,大口黑鲈以RanaV感染为主,鳜则以ISKNV感染为主,且存在混合感染及无临床症状的潜伏感染。 展开更多
关键词 大口黑鲈 鳜 虹彩病毒(RanaV) 传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 鲈形目鱼类弹状病毒(PFRV) 三重荧光定量PCR
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传染性造血器官坏死病毒和传染性胰脏坏死病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 张文 徐立蒲 +7 位作者 吕晓楠 潘勇 王小亮 曹欢 王静波 王姝 阴鸿达 王澎 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期494-500,共7页
为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经... 为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经FAM标记的Taq Man探针;根据本研究室建立的6种基因型IPNV(VP2基因)RT-qPCR方法合成1对特异性引物和1条经VIC标记的Taq Man探针。经优化各反应条件,初步建立了IHNV的和IPNV双重RT-qPCR检测方法。分别以IHNV、IPNV、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的cDNA以及病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的重组质粒作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR检测,评估该方法的特异性;以终浓度分别为1.0×10^(1)拷贝/μL~1.0×10^(9)拷贝/μL pIHNV和p IPNV质粒标准品的混合物作为模板,采用建立的双重RT-qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3个不同终浓度的质粒标准品混合物作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR分别于同一时间和不同时间检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增IHNV和IPNV及二者的质粒标准品混合物,其他相关水生动物病毒均无扩增曲线,特异性较强;对pIHNV和pIPNV质粒标准品的检测限均为1.25拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。将本实验室保存的45份虹鳟组织上清液传1~2代后,取出现典型CPE的细胞培养物,采用本实验建立的双重RT-qPCR方法和国标中的IHNV RT-PCR及已报道的IPNV RT-PCR方法同时检测。结果显示,3种方法均检出35份阳性样品,其中,IHNV的阳性检出率均为33.3%(15/45),IPNV的阳性检出率均为44.4%(20/45),3种方法的符合率均达100%。本研究首次建立了同时鉴别检测IHNV和IPNV的双重RT-qPCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好,可为IHNV和IPNV的鉴别检测及流行病学调查提供新的技术手段。 展开更多
关键词 传染性造血器官坏死病毒 传染性胰脏坏死病毒 双重荧光定量RT-PCR
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第四代凡纳滨对虾抗WSSV选育家系的抗病及免疫特性研究 被引量：35
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作者 黄永春 艾华水 +4 位作者 殷志新 黄仙德 李色东 翁少萍 何建国 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期1549-1558,共10页
35个第四代凡纳滨对虾抗WSSV选育家系和未选育对虾按每克体重注射103拷贝WSSV病毒量,根据选育家系的抗病性能分3个类群:高抗性类群,成活率达24.45%±6.56%;中抗性类群,成活率为10.70%±1.41%;敏感类群,成活率为2.72%±2.76%... 35个第四代凡纳滨对虾抗WSSV选育家系和未选育对虾按每克体重注射103拷贝WSSV病毒量,根据选育家系的抗病性能分3个类群:高抗性类群,成活率达24.45%±6.56%;中抗性类群,成活率为10.70%±1.41%;敏感类群,成活率为2.72%±2.76%,各类群间差异显著(P<0.01)。对分别代表高抗、中抗和敏感类群的12、7和3号家系以及未选育对虾按每克体重注射102、103、104和105拷贝WSSV,高抗性对虾在102、103、104及105感染水平下的存活率分别为100%、23.3%±3.5%、7.8%±1.9%和0%;中抗对虾分别为87.7%±3.9%、12.2%±1.9%、0%和0%;敏感对虾分别为54.4%±3.9%、2.2%±1.9%、0%和0%;未选育对虾分别为51.1%±5.1%、0%、0%和0%。在103拷贝组感染过程中免疫相关因子的变化表明,高抗对虾血液中血细胞数分别比中抗、敏感和未选育对虾提高20.7%(P>0.05),36.7%(P<0.05)和34.4%(P<0.05);PO活力上述三类对虾提高40.0%(P<0.05),76.3%(P<0.05)和63.4%(P<0.05);SOD活力分别比上述三类对虾提高31.1%(P>0.05),58.8%(P<0.05)和32.0%(P>0.05);POD活力分别比上述三类对虾提高29.6%(P>0.05),44.9%(P<0.05)和43.3%(P<0.05);血清蛋白含量分别比分别比上述三类对虾提高31.2%(P>0.05),38.7%(P<0.05)和39.3%(P<0.05),而敏感对虾和未选育对虾之间则无显著差异。结果表明,经四代选育后的高抗对虾免疫性能明显高于其他对虾,表现出良好的抗WSSV性能。 展开更多
关键词 凡纳滨对虾 白斑综合征病毒 人工感染 家系选育 免疫相关因子
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鳜暴发流行病病毒性病原研究 被引量：54
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作者 何建国 翁少萍 +1 位作者 黄志坚 曾慷 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1998年第5期74-77,共4页
患病鳜肾脏、脾脏、肝脏、心脏、鳃中发现二十面体病毒粒子，肾脏和脾脏是其感染主要器官．成熟病毒粒子直径１５０ｎｍ，核心球状，直径１０５ｎｍ．受感染细胞肿大，直径为正常细胞３～４倍，细胞核萎缩，为正常细胞核直径１／３．病... 患病鳜肾脏、脾脏、肝脏、心脏、鳃中发现二十面体病毒粒子，肾脏和脾脏是其感染主要器官．成熟病毒粒子直径１５０ｎｍ，核心球状，直径１０５ｎｍ．受感染细胞肿大，直径为正常细胞３～４倍，细胞核萎缩，为正常细胞核直径１／３．病毒粒子部分纯化后，经腹腔人工感染，第７天开始死亡，１０ｄ内死亡率为１００％，表现与池塘养殖状态相同症状，并在人工感染鳜肾和脾中电镜观察发现大量相同病毒粒子，命名为传染性脾肾坏死病毒（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｓｐｌｅｅｎａｎｄｋｉｄｎｅｙｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＩＳＫＮＶ）． 展开更多
关键词 鳜 病毒 传染性 脾肾坏死病毒 ISKNV
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栉孔扇贝大规模死亡致病病原的研究 被引量：24
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作者 王崇明 王秀华 +4 位作者 艾海新 李赟 贺桂珍 黄剑宇 宋微波 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期547-553,共7页
对2000-2002年山东沿海6个疫区患病栉孔扇贝进行电镜观察,在消化腺、外套膜、肾和肠的结缔组织细胞和间质细胞中发现一种球形病毒,并引起相应的病理学变化。该病毒具囊膜,直径为130～170nm,核衣壳直径为90～140nm。病毒分离纯化后,观察... 对2000-2002年山东沿海6个疫区患病栉孔扇贝进行电镜观察,在消化腺、外套膜、肾和肠的结缔组织细胞和间质细胞中发现一种球形病毒,并引起相应的病理学变化。该病毒具囊膜,直径为130～170nm,核衣壳直径为90～140nm。病毒分离纯化后,观察到的病毒囊膜表面覆有长20nm的纤突。病毒在细胞质中的囊泡样结构内完成装配,其内未发现包涵体存在。从发病疫区栉孔扇贝组织中分离出病毒毒种对健康扇贝进行人工感染。结果显示,各感染实验组发病扇贝表现出与自然海区发病扇贝相同的临床症状。病毒注射组死亡率为75%,病毒浸浴组死亡率为68.7%,灭活病毒注射组和空白对照组死亡率皆为12.5%。病毒注射、浸浴组与灭活病毒注射组、空白对照组死亡率差异显著。电镜复检结果显示,各感染实验组发病扇贝组织中分布有大量病毒粒子,与自然海区发病扇贝组织所观察到的病毒粒子在形态特征和病理学特征上完全一致。以上结果证明,病毒是导致栉孔扇贝大规模死亡的直接病原。 展开更多
关键词 栉孔扇贝 大规模死亡 球形病毒 病理学观察 人工感染实验 病原
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一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析 被引量：32
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作者 曾伟伟 王庆 +4 位作者 刘永奎 张乐生 刘宝芹 石存斌 吴淑勤 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期790-795,共6页
从江西南昌患出血病草鱼体内分离出的草鱼病毒(暂命名为JX09-01)能使草鱼肾脏细胞(CIK)、草鱼肝细胞(L8824)、草鱼吻端成纤维细胞(PSF)产生明显的细胞病变效应(CPE)。感染CIK细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量病毒聚集,形态和排... 从江西南昌患出血病草鱼体内分离出的草鱼病毒(暂命名为JX09-01)能使草鱼肾脏细胞(CIK)、草鱼肝细胞(L8824)、草鱼吻端成纤维细胞(PSF)产生明显的细胞病变效应(CPE)。感染CIK细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量病毒聚集,形态和排列方式与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)相似。针对GCRV 873株S6基因设计的简并引物可以从病料组织和感染细胞中扩增出目的条带,而针对GCRV HZ08株S6基因设计特异性引物未能扩增出目的条带。对JX09-01株的S6全基因进行序列分析表明,其核苷酸序列同GCRV 873株和HZ08株的同源性分别是99.3%和30.4%,推导出的氨基酸序列同源性分别是98.6%和30%,说明草鱼病毒JX09-01株为草鱼呼肠孤病毒。用JX09-01株接种当年8—10 cm左右的草鱼,没有明显的临床症状,不能致草鱼死亡。用传代至15代的CIK细胞病毒液进行免疫保护试验,结果显示其对强毒株的免疫保护率达到86.7%。实验结果初步显示,新分离到的JX09-01为草鱼呼肠孤病毒弱毒株,可作为弱毒疫苗的候选毒株。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 分离 鉴定 序列分析 免疫原性
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蚯蚓与蝇蛆对中国对虾生长及抗白斑综合征病毒感染的研究 被引量：18
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作者 张洪玉 张天时 +2 位作者 孔杰 罗坤 常亚青 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期503-510,共8页
以中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)为实验材料,分别投喂配合饲料、蚯蚓、蛤蜊、蝇蛆等四种饵料,利用生长和抗病性指标综合评价蚯蚓和蝇蛆作为中国对虾饵料的可行性。生长实验前测定每个实验组的初始体长和体重,养殖40 d后再次测定... 以中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)为实验材料,分别投喂配合饲料、蚯蚓、蛤蜊、蝇蛆等四种饵料,利用生长和抗病性指标综合评价蚯蚓和蝇蛆作为中国对虾饵料的可行性。生长实验前测定每个实验组的初始体长和体重,养殖40 d后再次测定生长指标,之后,分别投喂不同毒饵量进行人工感染实验。方差分析表明:投喂4种饵料后,蛤蜊组生长最快,其次是蚯蚓,再次是蝇蛆,最后是配合饲料,各组之间对虾体长增长差异显著(P<0.05),体重增长差异极显著(P<0.01)。利用线性固定模型分析不同饵料及不同病毒量感染下对中国对虾存活率的影响,其中蚯蚓组存活率最高,配合饲料组存活率最低,并且蚯蚓组存活率显著高于蛤蜊组和配合饲料组(P<0.05),蝇蛆组显著高于配合饲料组(P<0.05)。研究结果表明:蚯蚓和蝇蛆可显著提高中国对虾的生长速度,明显提高中国对虾的抗病性,是很好的对虾饵料。 展开更多
关键词 中国对虾 蚯蚓 蝇蛆 白斑综合征病毒 人工感染
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草鱼呼肠孤病毒湖州分离株的分离及鉴定 被引量：21
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作者 郝贵杰 沈锦玉 +3 位作者 潘晓艺 徐洋 姚嘉赟 尹文林 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2011年第1期47-52,共6页
2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8~10 cm的草鱼鱼种。5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡。将无菌处理的病样滤液接种草鱼... 2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8~10 cm的草鱼鱼种。5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡。将无菌处理的病样滤液接种草鱼肾细胞（CIK）,连续接5代均出现明显的细胞病变（CPE）,并与草鱼呼肠孤病毒参考株所产生的CPE一致。该株病毒的TCID50为10-8/0.1ml。内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察,发现组织内有大量的病毒颗粒,大小均一,近似球形,直径约70~75 nm。理化鉴定表明,氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比并没有多大变化,说明该株病毒对氯仿和乙醚有一定的抗性。经草鱼呼肠孤病毒特异性的RT-PCR检测,获得阳性的目的片段,测序的结果与草鱼呼肠孤病毒相应序列的同源性达99%以上。上述鉴定结果表明所分离的病毒为草鱼呼肠孤病毒,将其命名为HZ2008。 展开更多
关键词 草鱼 草鱼呼肠孤病毒 草鱼肾细胞 分离 鉴定
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