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鲤疱疹病毒2型和3型双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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作者 陈永聪 方勤美 +1 位作者 柯翎 施少华 《海洋渔业》 北大核心 2025年第5期619-628,共10页
为快速、高效鉴别鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)和3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3),针对鲤疱疹病毒基因组的保守序列,设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测CyHV-2和CyHV-3的双重TaqMan qPCR方法,并对... 为快速、高效鉴别鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)和3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3),针对鲤疱疹病毒基因组的保守序列,设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测CyHV-2和CyHV-3的双重TaqMan qPCR方法,并对该方法特异性、灵敏度和重复性进行了评价。同时利用该方法对实验室保存的金鱼(Carassius auratus var.)和锦鲤(Cryprinus carpiod haematopterus)临床样品进行检测。结果显示,该方法能特异性检测CyHV-2和CyHV-3,而对水产养殖中其他常见DNA或RNA病毒无交叉反应;敏感性实验显示,该方法的最低检测量为10 copies·μL^(-1),表明该方法具有较高的灵敏度;测定结果在组内和组间重复变异系数均小于3%,重复性良好。使用该方法对实验室保存的37份金鱼和78份锦鲤临床样品进行检测,病毒检出结果与用国家标准(GB/T 36194-2018)和行业标准(SC/T 7212.1-2011)方法检测的结果一致。对5份CyHV-2(金鱼样品)和5份CyHV-3(锦鲤样品)阳性的临床样品进行混合后检测,结果均为CyHV-2和CyHV-3双阳性。研究表明,本研究建立的双重TaqMan qPCR检测方法具有特异性强、灵敏度高和重复性好等优点,可以为临床上CyHV-2和CyHV-3的快速定量检测和鉴别诊断提供新的工具和方法。 展开更多
关键词 鲤疱疹病毒2型 鲤疱疹病毒3型 双重TaqMan qPCR
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大口黑鲈蛙虹彩病毒的分离鉴定与病理学研究
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作者 李佳宇 绳秀珍 +3 位作者 唐小千 邢婧 迟恒 战文斌 《中国海洋大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第3期184-192,共9页
为了丰富大口黑鲈病毒(Largemouth bass virus,LMBV)的流行病学资料,深入理解病毒的特性及致病机理,本文从山东省烟台市某养殖场采集了患病的大口黑鲈(Micropterus salmoides),采用细胞培养、PCR扩增及系统进化分析等方法进行病原的分... 为了丰富大口黑鲈病毒(Largemouth bass virus,LMBV)的流行病学资料,深入理解病毒的特性及致病机理,本文从山东省烟台市某养殖场采集了患病的大口黑鲈(Micropterus salmoides),采用细胞培养、PCR扩增及系统进化分析等方法进行病原的分离鉴定。肉眼可见患病大口黑鲈多处出现红肿出血的症状,显微镜检查未发现寄生虫和细菌感染。将病鱼组织匀浆液接种鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini,EPC),出现明显的细胞病变;对EPC细胞进行透射电镜观察,在细胞质内发现直径约为150 nm的成熟病毒粒子,病毒粒子呈现虹彩病毒典型的正六边形结构。根据NCBI公布的蛙病毒的主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因序列设计引物,经PCR扩增和测序后得到一段长度为1392 bp的基因序列。对获得的MCP序列进行系统进化分析,发现该病毒株与蛙病毒属的其他13种病毒聚成一支,与Santee-Cooper蛙病毒(SCRV)、鳜鱼虹彩病毒(MRV)、大口黑鲈溃疡综合征病毒(LBUSV)等7株病毒的MCP序列同源性高达100%。向健康大口黑鲈腹腔注射200μL的105 TCID 50/mL的病毒液,7 d的累计死亡率可达100%。研究结果表明,我们分离到的病毒为虹彩病毒科蛙病毒属成员,将该病毒株命名为大口黑鲈蛙虹彩病毒LMBV-CN2022株。对病鱼组织进行病理学观察,石蜡切片苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色结果显示肝、脾、肾组织中出现大量铁血黄素沉积,透射电镜结果显示脾和体肾中存在病毒粒子。 展开更多
关键词 大口黑鲈 蛙病毒 分离鉴定 组织病理
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大口黑鲈双RNA病毒VP2蛋白原核表达及多克隆抗体制备
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作者 张秋爽 马宝福 +6 位作者 郑果 林强 梁红茹 牛银杰 罗霞 李宁求 付小哲 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第7期18-25,共8页
【目的】研究大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus,LBBV)VP2蛋白的抗原性,为后续LBBV疫苗研究提供基础材料。【方法】PCR扩增LBBV VP2基因,构建重组质粒pET-VP2,PCR和测序鉴定后转入大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。以纯化的重... 【目的】研究大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus,LBBV)VP2蛋白的抗原性,为后续LBBV疫苗研究提供基础材料。【方法】PCR扩增LBBV VP2基因,构建重组质粒pET-VP2,PCR和测序鉴定后转入大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。以纯化的重组VP2蛋白为抗原,皮下多点注射免疫新西兰大白兔,耳中央动脉采血并分离血清,通过间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;利用Ni-NTA镍离子亲和层析纯化抗体,用BCA法测定纯化后抗体的浓度。通过Western blot和间接免疫荧光鉴定VP2多克隆抗体特异性;采用固定病毒-稀释血清法测定血清的中和效价。【结果】PCR扩增获得了1266 bp的VP2基因片段。PCR和测序鉴定结果表明,重组质粒pET-VP2构建成功。VP2重组蛋白的诱导表达和纯化试验结果获得了64 ku的重组蛋白,符合预期大小。成功制备了VP2蛋白的多克隆抗体,其质量浓度为10 mg/mL,效价为1∶1024000,可特异性识别LBBV VP2蛋白;血清中和试验结果显示,VP2多抗中和抗体效价为1∶64。【结论】成功获得了大肠杆菌表达的LBBV重组VP2蛋白,制备了抗VP2蛋白的多克隆抗体,该多抗对LBBV具有中和作用。 展开更多
关键词 大口黑鲈 大口黑鲈双RNA病毒 VP2蛋白 多克隆抗体
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两种四氢异喹啉类药物体外抗大口黑鲈蛙虹彩病毒效果的研究
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作者 王慧 袁雪梅 +3 位作者 陈静 焦锦彪 葛海霞 姚嘉赟 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期465-472,共8页
为探究四氢异喹啉类药物β-咔啉-3-羧酸乙酯(β-CCE)和Boc-D-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Boc-DTic-OH)对大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)的体外抗病毒效果,本研究利用显微观察法测定细胞病变(CPE)效应、荧光定量PCR(qPCR)法检测病毒拷贝数以及... 为探究四氢异喹啉类药物β-咔啉-3-羧酸乙酯(β-CCE)和Boc-D-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Boc-DTic-OH)对大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)的体外抗病毒效果,本研究利用显微观察法测定细胞病变(CPE)效应、荧光定量PCR(qPCR)法检测病毒拷贝数以及CCK-8法测定细胞活力,从阻断、抑制及直接杀灭3个方面,分析β-CCE和Boc-D-Tic-OH的体外抗LMBV的活性。结果显示,β-CCE和Boc-D-Tic-OH对胖头鱼肌肉细胞(FHM)的安全浓度分别为10μg/mL和100μg/mL,阻断结果显示两种药物均可显著降低FHM的CPE,其阻断率均在95%以上,药物处理组病毒拷贝数极显著低于LMBV对照组(P<0.01);抑制结果显示,两种药物可一定程度降低FHM的CPE,10μg/mLβ-CCE处理组对病毒的抑制率为76.86%,β-CCE处理组以及100μg/mL、10μg/mL Boc-D-Tic-OH处理组病毒拷贝数均极显著低于LMBV对照组(P<0.01),β-CCE、Boc-D-Tic-OH发挥最好阻断效果的作用时间分别为2 h和1 h;药物作用6 h抑制效果最好;直接杀灭结果显示,0.1μg/mLβ-CCE能一定程度降低FHM的CPE,0.1μg/mLβ-CCE和10μg/mL Boc-D-Tic-OH对病毒的直接杀灭率最高,分别为90.93%和102.21%,且可极显著降低病毒拷贝数(P<0.01),两种发挥最佳直接杀灭作用的时间为2 h。上述结果表明,两种四氢异喹啉类药物均具有较好的体外抗LMBV效果,本研究为抗LMBV药物的研制提供参考。 展开更多
关键词 大口黑鲈 蛙虹彩病毒 四氢异喹啉类药物 抗病毒活性
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酸枣仁醇提物及白桦脂酸抗神经坏死病毒的作用机制
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作者 徐伟强 玉洁莹 +7 位作者 黄琳 余庆 刘明珠 王劭雯 孙云 韩书煜 秦启伟 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1787-1801,共15页
【目的】探究酸枣仁醇提物(SZSE)及其活性成分白桦脂酸(BA)抗鱼类神经坏死病毒(NNV)的作用机制,为研发绿色、高效、无污染的抗NNV渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光试验确定SZSE及其活性成分BA的... 【目的】探究酸枣仁醇提物(SZSE)及其活性成分白桦脂酸(BA)抗鱼类神经坏死病毒(NNV)的作用机制,为研发绿色、高效、无污染的抗NNV渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光试验确定SZSE及其活性成分BA的细胞安全工作浓度,再利用光学显微镜观察、结晶紫染色及实时荧光定量PCR检测SZSE及其活性成分BA的抗NNV效果,并以实时荧光定量PCR探析二者的抗NNV作用机制。【结果】SZSE及其活性成分BA的细胞安全工作浓度分别为:SZSE≤50μg/mL,BA≤6.25μg/mL,且50μg/mL SZSE或6.25μg/mL BA对卵形鲳鲹脾脏成纤维细胞(TOSF)无毒性作用。NNV与50、25、12.5μg/mL的SZSE或6.25、3.125、1.5625μg/mL的BA分别共孵育TOSF细胞,48 h后发现药物处理的TOSF细胞病变效应(CPEs)明显低于NNV组;结晶紫染色发现药物处理后活的TOSF细胞数量也明显多于NNV组;实时荧光定量PCR检测结果表明,经药物处理后TOSF细胞中NNV的CP基因相对表达量均极显著低于NNV组(P<0.01),且呈剂量依赖关系。SZSE及其活性成分BA在NNV感染前后2 h分别处理TOSF细胞均具有抗病毒效果,表明SZSE及其活性成分BA不仅具有预防病毒感染的作用,还能用于治疗病毒感染。此外,SZSE及其活性成分BA通过与NNV粒子相互作用、干扰NNV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制阶段,以及调控CAT、GSH-Px、HO-1、TGF、Keap1和Nrf2等免疫相关基因的表达,而发挥抗病毒作用。【结论】SZSE及其活性成分BA具有抑制NNV感染的功能,不仅能干扰NNV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制阶段,还通过调控免疫相关基因的表达而发挥抗病毒作用。可见,SZSE及其活性成分BA具有开发为绿色、高效抗NNV渔用药物的潜力。 展开更多
关键词 酸枣仁醇提物(SZSE) 白桦脂酸(BA) 神经坏死病毒(NNV) 抗病毒 安全工作浓度
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鲤春病毒血症的检测技术与防控研究进展 被引量:1
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作者 葛明峰 徐胜威 +4 位作者 景宏丽 王建平 高隆英 付志明 王雯琼 《宁波大学学报(理工版)》 2025年第1期100-106,共7页
鲤春病毒血症(Spring Viremia of Carp,SVC)是由鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV)引起的一种急性、出血性的病毒性疾病.SVC是影响鲤科鱼类养殖产业及观赏鱼类贸易较为严重的疾病,目前尚无有效的治疗药物,只能通过... 鲤春病毒血症(Spring Viremia of Carp,SVC)是由鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV)引起的一种急性、出血性的病毒性疾病.SVC是影响鲤科鱼类养殖产业及观赏鱼类贸易较为严重的疾病,目前尚无有效的治疗药物,只能通过消毒、检验检疫、日常管理等方式进行预防.对该病的诊断主要以《鲤春病毒血症诊断规程》(GB/T15805.5—2018)为依据,同时基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)等快速检测技术和试剂盒的开发与应用为SVC防治提供新方法.为此,针对SVC的流行特点、临床症状、近几年监测情况、病原检测技术、致病机理、疫苗和药物防控等方面进行了梳理和总结,并展望了SVC的防治策略和方向,为今后更深入研究该疫病提供参考. 展开更多
关键词 鲤春病毒血症 鲤春病毒血症病毒 检测技术 防治方法
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基于核酸适体功能化纳米磁珠的石斑鱼虹彩病毒检测
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作者 夏悦婷 余庆 +10 位作者 黄琳 黄静 覃向谋 赵明明 韦冬冬 王浩 凌飞 常彦磊 许伟江 刘明珠 李鹏飞 《广东海洋大学学报》 北大核心 2025年第3期21-27,共7页
【目的】开发一种基于核酸适体功能化纳米磁珠的石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)快速检测新方法,以解决传统病毒检测技术操作繁琐、耗时长、设备依赖性强等问题。【方法】将前期筛选获得的可特异性识别SGIV的核酸适... 【目的】开发一种基于核酸适体功能化纳米磁珠的石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)快速检测新方法,以解决传统病毒检测技术操作繁琐、耗时长、设备依赖性强等问题。【方法】将前期筛选获得的可特异性识别SGIV的核酸适配体进行优化及修饰,获得核酸适配体Q5c,并将其与纳米磁珠进行偶联,构建核酸适配体偶联磁性纳米探针(Aptamer magnetic nanobeads,Q5c-MNPs)。利用多病原交叉实验验证Q5c-MNPs对SGIV感染细胞的特异性靶向识别,采用流式细胞术、荧光定量PCR等技术系统评价探针的稳定性、灵敏度等关键性能指标。【结果】Q5c-MNPs可特异性识别SGIV感染的细胞,并在500 nmol/L浓度下孵育时间短至1 min,在4~37℃温度范围内检测性能稳定。检测灵敏度达1×10^(3)个/mL,与RT-qPCR检测灵敏度相当。而本方法检测周期仅需2h,较常规分子检测方法效率显著提升。【结论】成功构建Q5c-MNPs检测体系,该体系兼具高特异性、高灵敏度和快速响应等优势,为开发水产病害现场快速检测试剂盒奠定重要技术基础。 展开更多
关键词 石斑鱼虹彩病毒 核酸适配体Q5c 纳米磁珠 快速检测
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单宁酸抗大口黑鲈弹状病毒的作用机制
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作者 玉洁莹 顾屹 +7 位作者 黄琳 王浩 余庆 刘明珠 韩书煜 秦启伟 凌飞 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1823-1833,共11页
【目的】从大口黑鲈弹状病毒(MSRV)感染细胞的生命周期探究单宁酸在MSRV感染过程中的潜在作用机制,为研发高效安全的抗MSRV渔用药物提供理论依据。【方法】以胖头鱥肌肉细胞系(FHM)为模型,通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光染色... 【目的】从大口黑鲈弹状病毒(MSRV)感染细胞的生命周期探究单宁酸在MSRV感染过程中的潜在作用机制,为研发高效安全的抗MSRV渔用药物提供理论依据。【方法】以胖头鱥肌肉细胞系(FHM)为模型,通过光学显微镜观察、CCK-8检测及免疫荧光染色分析单宁酸毒性,确定其安全工作浓度;然后使用结晶紫染色评估单宁酸对MSRV的抑制作用,利用实时荧光定量PCR检测单宁酸体外抗MSRV效果及探析其作用机制,包括单宁酸对MSRV粒子及MSRV吸附宿主细胞表面、侵入细胞与细胞内复制各阶段的影响。【结果】综合光学显微镜观察与CCK-8检测结果,确定单宁酸对FHM细胞的安全工作浓度为0.0125 mg/mL;以0.0125 mg/mL单宁酸孵育36 h后,FHM细胞的骨架结构仍然保持完整,未观察到核膜皱缩或染色质凝聚等异常现象。将0.0125、0.00625和0.003125 mg/mL的单宁酸分别与MSRV共孵育处理,能有效降低MSRV感染FHM细胞产生的病变效应,且FHM细胞中MSRV的N基因相对表达量极显著低于未经单宁酸处理的MSRV感染细胞(P<0.01,下同)。在经单宁酸处理的MSRV感染FHM细胞中,MSRV的N基因相对表达量和病毒滴度均极显著低于未经单宁酸处理的MSRV感染FHM细胞,即单宁酸可直接作用于MSRV粒子,致使其感染能力降低。此外,在MSRV感染的吸附、侵入和复制各阶段以单宁酸进行处理,FHM细胞中MSRV的N基因相对表达量均极显著低于未经单宁酸处理的MSRV感染细胞,即单宁酸通过干扰MSRV感染过程的吸附、侵入与复制而发挥抗病毒作用。【结论】单宁酸对MSRV具有良好的抗病毒作用,可直接作用于MSRV粒子,且对MSRV的吸附、侵入与复制各阶段均有抑制作用,具有开发成高效安全抗MSRV渔用药物的潜力。 展开更多
关键词 大口黑鲈弹状病毒(MSRV) 单宁酸 抗病毒机制 细胞病变效应
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激活式核酸适配体LYGV1c对石斑鱼虹彩病毒的特异性识别与检测 被引量:1
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作者 刘明珠 谢瑾琨 +7 位作者 余庆 黄静 王一兵 徐继卫 常彦磊 黄广杰 韩书煜 李鹏飞 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1704-1714,F0002,共12页
【目的】构建能特异性识别石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的激活式核酸适配体探针,为开发特异性识别SGIV的快速检测试剂盒提供技术支持,实现对SGIV感染的早期诊断及精准防控。【方法】基于可特异性识别SGIV感染宿主细胞的核酸适配体LYGV1,通过加... 【目的】构建能特异性识别石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的激活式核酸适配体探针,为开发特异性识别SGIV的快速检测试剂盒提供技术支持,实现对SGIV感染的早期诊断及精准防控。【方法】基于可特异性识别SGIV感染宿主细胞的核酸适配体LYGV1,通过加入T链、C链、荧光基团及淬灭基团等功能化修饰,成功构建获得靶标激活式核酸适配体TAA-LYGV1c;然后通过流式细胞仪分析、激光共聚焦显微镜观察及实时荧光定量PCR等技术系统验证TAALYGV1c对SGIV的特异性识别能力,并对其最适工作浓度、孵育时间、孵育温度及识别靶细胞检测限等条件进行优化,以评估TAA-LYGV1c的可操作性;最后构建SGIV感染模型,通过流式细胞仪检测分析和实时荧光定量PCR进一步探究TAA-LYGV1c在实际生产中的应用价值。【结果】加入TAA-LYGV1c后SGIV感染组石斑鱼脾脏(GS)细胞的荧光值极显著高于未加入TAA-LYGV1c的SGIV感染组(P<0.01,下同),同时极显著高于空白对照组和神经坏死病毒(NNV)感染组,说明TAA-LYGV1c可特异性识别SGIV感染。TAA-LYGV1c的最适工作浓度为500 nmol/L,最适孵育温度为28℃,最短孵育1 min即可检测到荧光。不同检测方法的最低检测限存在一定差异,其中,流式细胞仪检测分析TAA-LYGV1c识别靶细胞的检测限为5×10^(3)个/mL,荧光酶标仪检测分析的最低检测限与实时荧光定量PCR检测的最低检测限均为500个/mL,即检测灵敏度与仪器的检测原理存在一定关联。在活体检测中,基于TAA-LYGV1c的流式细胞仪检测分析结果与实时荧光定量PCR检测结果一致,进一步证实TAA-LYGV1c能特异性识别SGIV感染,也说明核酸适配体在水产养殖病原检测方面具有潜在的应用价值。【结论】开发的激活式核酸适配体TAA-LYGV1c具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势,可实现对SGIV感染的早期快速诊断,为开发特异性识别SGIV的快速检测试剂盒提供技术支持。 展开更多
关键词 石斑鱼虹彩病毒(SGIV) 核酸适配体 TAA-LYGV1c 快速检测
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鲈鳜主要病毒性病原三重荧光定量PCR检测方法的建立及应用
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作者 谭红连 韦剑成 +5 位作者 李莉萍 童桂香 苏美珍 韦信贤 杨明伟 陈静 《南方农业学报》 北大核心 2025年第8期2651-2661,共11页
【目的】建立能同时检测鲈鳜虹彩病毒(RanaV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和鲈形目鱼类弹状病毒(PFRV)的三重荧光定量PCR,为鲈鳜养殖过程中的RanaV、ISKNV、PFRV检疫、监测及临床诊断等提供简便且高效的检测方法。【方法】分别根据RanaV... 【目的】建立能同时检测鲈鳜虹彩病毒(RanaV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和鲈形目鱼类弹状病毒(PFRV)的三重荧光定量PCR,为鲈鳜养殖过程中的RanaV、ISKNV、PFRV检疫、监测及临床诊断等提供简便且高效的检测方法。【方法】分别根据RanaV-MCP基因、ISKNV-MCP基因、PFRV-G基因的保守序列设计特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段克隆至pGM-T载体上构建重组质粒pGM-T-MCP^(RanaV)、pGM-T-MCP^(ISKNV)和pGM-T-G^(PFRV),其中,pGM-T-MCP^(RanaV)、pGM-T-MCP^(ISKNV)分别作为RanaV和ISKNV的标准品DNA,pGM-T-G^(PFRV)则以SalⅠ酶切后经体外转录获得PFRV标准品RNA;以标准品为模板进行三重荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线制定,并分别进行敏感性、特异性、重复性及临床应用试验。【结果】优化后的三重荧光定量PCR反应体系30.0μL:2×Fast One Step Probe RT-qPCR Mix 15.0μL,引物RanaV-qF/RanaV-qR(10μmol/L)、ISKNV-qF/ISKNV-qR(10μmol/L)、PFRV-qF/PFRV-qR(10μmol/L)各0.6μL,探针RanaV-qP(5μmol/L)0.9μL,探针ISKNV-qP(5μmol/L)0.9μL,探针PFRV-qP(5μmol/L)1.2μL,核酸模板3.0μL,灭菌DEPC水补足至30.0μL。建立的三重荧光定量PCR对RanaV、ISKNV和PFRV标准品均具有较高的扩增效率(Eff.>95.0%),其标准曲线线性关系良好(RSq≥0.999),可实现对RanaV、ISKNV和PFRV的同步定量分析;对RanaV、ISKNV、PFRV标准品的检测灵敏度可达10 copies/反应,对鲈鳜组织样品的检测灵敏度为10 copies/mg;与草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)等鱼类常见病原均无交叉反应;检测RanaV、ISKNV、PFRV的组内及组间重复试验的C_t值变异系数均低于2.00%。采用建立的三重荧光定量PCR对采自广西各地养殖场的鲈鳜样品(大口黑鲈95份,鳜68份)进行检测,结果发现,RanaV阳性检出率为19.0%,ISKNV阳性检出率为14.7%,PFRV阳性检出率为4.3%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的三重荧光定量PCR能同时检测RanaV、ISKNV和PFRV,具有灵敏度高、特异性强、准确可靠、操作简单、快速高效的特点,可为鲈鳜的苗种检疫、疫情监测及临床诊断提供更简便、更高效的技术手段。RanaV、ISKNV和PFRV感染在广西鲈鳜养殖中已流行,大口黑鲈以RanaV感染为主,鳜则以ISKNV感染为主,且存在混合感染及无临床症状的潜伏感染。 展开更多
关键词 大口黑鲈 虹彩病毒(RanaV) 传染性脾肾坏死病毒(ISKNV) 鲈形目鱼类弹状病毒(PFRV) 三重荧光定量PCR
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传染性造血器官坏死病毒和传染性胰脏坏死病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 张文 徐立蒲 +7 位作者 吕晓楠 潘勇 王小亮 曹欢 王静波 王姝 阴鸿达 王澎 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期494-500,共7页
为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经... 为建立一种快速、高效、敏感的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的双重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参照世界动物卫生组织(WOAH)最新推荐的IHNV RT-qPCR方法,根据IHNV N基因合成1对特异性引物和1条经FAM标记的Taq Man探针;根据本研究室建立的6种基因型IPNV(VP2基因)RT-qPCR方法合成1对特异性引物和1条经VIC标记的Taq Man探针。经优化各反应条件,初步建立了IHNV的和IPNV双重RT-qPCR检测方法。分别以IHNV、IPNV、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的cDNA以及病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的重组质粒作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR检测,评估该方法的特异性;以终浓度分别为1.0×10^(1)拷贝/μL~1.0×10^(9)拷贝/μL pIHNV和p IPNV质粒标准品的混合物作为模板,采用建立的双重RT-qPCR方法扩增,评估该方法的敏感性;以3个不同终浓度的质粒标准品混合物作为模板,采用本研究建立的双重RT-qPCR分别于同一时间和不同时间检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增IHNV和IPNV及二者的质粒标准品混合物,其他相关水生动物病毒均无扩增曲线,特异性较强;对pIHNV和pIPNV质粒标准品的检测限均为1.25拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。将本实验室保存的45份虹鳟组织上清液传1~2代后,取出现典型CPE的细胞培养物,采用本实验建立的双重RT-qPCR方法和国标中的IHNV RT-PCR及已报道的IPNV RT-PCR方法同时检测。结果显示,3种方法均检出35份阳性样品,其中,IHNV的阳性检出率均为33.3%(15/45),IPNV的阳性检出率均为44.4%(20/45),3种方法的符合率均达100%。本研究首次建立了同时鉴别检测IHNV和IPNV的双重RT-qPCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好,可为IHNV和IPNV的鉴别检测及流行病学调查提供新的技术手段。 展开更多
关键词 传染性造血器官坏死病毒 传染性胰脏坏死病毒 双重荧光定量RT-PCR
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四川地区1株鲤春病毒血症病毒的分离鉴定与全基因组分析
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作者 祁英吉 刘舒亚 +8 位作者 兰寒韵 王雪梅 孙甜甜 李书含 黎秋男 黄小丽 耿毅 陈德芳 欧阳萍 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第7期1430-1440,共11页
2022年3月四川省乐山市某养殖场的鲤出现大面积死亡,累计死亡率80%。为研究此次疾病的病因和流行规律,将病料解剖,进行病理学检查、细菌学检查、PCR鉴定,以及病毒分离鉴定与系统进化分析。结果显示,病理学病变主要在鳃和肠道,肠道充血... 2022年3月四川省乐山市某养殖场的鲤出现大面积死亡,累计死亡率80%。为研究此次疾病的病因和流行规律,将病料解剖,进行病理学检查、细菌学检查、PCR鉴定,以及病毒分离鉴定与系统进化分析。结果显示,病理学病变主要在鳃和肠道,肠道充血、出血,上皮细胞坏死脱落;鳃小片上皮细胞增生、坏死、脱落。根据病理学诊断初步判断患病鱼为鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)感染。RT-PCR检测结果显示,在自然发病鲤、人工感染发病鲤的内脏组织和细胞培养病毒液中均扩增出SVCV的G蛋白基因序列。细胞培养病毒液的超薄切片电镜观察结果显示,病毒粒子长80~150 nm,宽40~60 nm,呈子弹状。人工感染细胞培养病毒液的健康鲤出现与自然发病鲤相似的临床症状,感染组累计死亡率为65%。通过鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprini cell,EPC细胞)培养分离得到1株病毒,全基因组测序与系统进化分析结果表明,该分离株与SVCV的同源性最高,将该分离株命名为SVCV-2022。结合本次疾病的流行特点与病理诊断、病毒分离鉴定和人工感染试验,确定此次传染病的病原为SVCV。 展开更多
关键词 鲤春病毒血症病毒 累计死亡率 系统进化分析
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RNF122 targets STING for ubiquitination at residues K95,K117,and K155 to regulate antiviral responses in a teleost fish
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作者 Xiao-Wei Qin Chuan-Rui Li +5 位作者 Min-Cong Liang Tian-Hao Li Yan-Lin You Shao-Ping Weng Chang-Jun Guo Jian-Guo He 《Zoological Research》 2025年第4期750-760,共11页
Ring finger protein 122(RNF122),an E3 ubiquitin ligase,orchestrates antiviral immune responses in mammals by targeting retinoic acid-inducible gene 1 and melanoma differentiation-associated gene 5 for ubiquitination.H... Ring finger protein 122(RNF122),an E3 ubiquitin ligase,orchestrates antiviral immune responses in mammals by targeting retinoic acid-inducible gene 1 and melanoma differentiation-associated gene 5 for ubiquitination.However,its functional relevance in teleosts has yet to be clearly defined,particularly regarding the identification of substrate-specific regulatory sites.This study characterized RNF122 from mandarin fish(Siniperca chuatsi),termed scRNF122,and investigated its regulatory impact on stimulator of interferon genes(STING)-mediated antiviral signaling.Results showed that scRNF122 expression was up-regulated in response to mandarin fish ranavirus(MRV)infection,and its overexpression suppressed scSTING-mediated interferon(IFN)production and enhanced MRV replication.Co-immunoprecipitation confirmed a direct interaction between scRNF122 and scSTING.Functional assays demonstrated that scRNF122 facilitated scSTING degradation through the ubiquitin-proteasome pathway,a process impeded by MG132 treatment.Ubiquitination analyses of various scSTING mutants revealed that scRNF122 catalyzed scSTING ubiquitination at K95,K117,and K155 residues.Moreover,scRNF122 significantly impaired scSTING-dependent antiviral responses by engaging negative regulatory elements within the signaling cascade.Overall,scRNF122 was identified as a negative modulator of STING-mediated IFN signaling in mandarin fish,diminishing STING-dependent antiviral activity and promoting its degradation via the ubiquitin-proteasome pathway at lysine residues K95,K117,and K155.These findings provide mechanistic insight into the post-translational control of STING in teleosts and establish a foundation for future investigations into antiviral immune regulation. 展开更多
关键词 RNF122 STING UBIQUITINATION INTERFERON Innate immunity
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一株半滑舌鳎源鳗弧菌的分离鉴定及药敏试验
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作者 顾颖 梁晨 +5 位作者 李长剑 伏光辉 卢璐 王超 叶仁智 孙苗苗 《河北渔业》 2025年第6期37-41,共5页
从患病半滑舌鳎体内分离获得一株优势菌株ST7,通过形态特征、生理生化以及16s rRNA分子方法鉴定为鳗弧菌。此外,对分离菌进行了30种抗生素的药敏试验,结果显示分离菌ST7对哌拉西林、麦迪霉素、多黏菌素B、复方新诺明(TMP/SMZ)、环丙沙... 从患病半滑舌鳎体内分离获得一株优势菌株ST7,通过形态特征、生理生化以及16s rRNA分子方法鉴定为鳗弧菌。此外,对分离菌进行了30种抗生素的药敏试验,结果显示分离菌ST7对哌拉西林、麦迪霉素、多黏菌素B、复方新诺明(TMP/SMZ)、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、多西环素、米诺环素、四环素、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶、氯霉素和呋喃唑酮等抗生素高度敏感。 展开更多
关键词 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) 鳗弧菌(Vibrio anguillarum) 分离鉴定 药敏试验
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鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)检测方法的建立及应用 被引量:1
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作者 陈曦 杨金先 葛均青 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期234-240,共7页
为建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的实时荧光重组酶辅助扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法,根据AngHV的ORF 95基因序列设计引物和探针,优化反应温度,确定反应时间,并应用该方法对采集的临床样品进行... 为建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的实时荧光重组酶辅助扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法,根据AngHV的ORF 95基因序列设计引物和探针,优化反应温度,确定反应时间,并应用该方法对采集的临床样品进行检测。结果表明:本研究中建立的实时荧光RAA检测方法的最佳反应温度为39℃,反应时间为20 min;实时荧光RAA检测方法的灵敏度、特异性及重复性评价显示,RAA检测AngHV的最低检测量为1×10^(2)copies/μL,可特异性地检测AngHV,与美洲鳗鲡腺瘤病毒(American eel adomavirus,AEAdoV)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)、鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)和对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)均无交叉反应;实时荧光RAA检测方法的组内和组间变异系数均小于5%,表明实时荧光RAA检测方法灵敏度高、特异性强和重复性好;应用该方法对采集的25份临床样品进行检测显示,实时荧光RAA检测方法与qPCR方法的检出率一致,均为92%,高于普通PCR的检出率(76%)。研究表明,本研究中所建立的鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增RAA检测方法快速、灵敏、可靠、准确,可用于AngHV的临床快速检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 鳗鲡疱疹病毒(AngHV) 实时荧光RAA 快速检测
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免疫磁珠富集水中鲤春病毒血症病毒的初步研究
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作者 景宏丽 孔玉方 +7 位作者 斯烈钢 王建平 葛明峰 徐胜威 黄呈炜 高隆英 张旻 吴绍强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期641-644,共4页
为建立一种富集水中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的技术,本研究利用SVCV多克隆抗体制备免疫磁珠,通过对磁珠耦联抗体量的优化,确定该免疫磁珠有效富集SVCV的最低浓度,建立一种富集SVCV的免疫磁珠分离技术,并联合荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)技术... 为建立一种富集水中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的技术,本研究利用SVCV多克隆抗体制备免疫磁珠,通过对磁珠耦联抗体量的优化,确定该免疫磁珠有效富集SVCV的最低浓度,建立一种富集SVCV的免疫磁珠分离技术,并联合荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)技术对水中SVCV进行检测。结果显示,1 mg磁珠与75μg SVCV多克隆抗体耦联时,耦联的抗体量最大,耦联率为98.48%;耦联后的免疫磁珠对SVCV(200μL,浓度为1.54×10^(6)拷贝/μL)的富集效率最高为91.56%。以该多克隆抗体量制备的免疫磁珠富集10倍倍比稀释的SVCV(3.54×10^(6)拷贝/μL~3.54×10^(3)拷贝/μL),以确定其有效富集SVCV的最低浓度。结果显示,1 mg免疫磁珠能够使200μL病毒液(3.54×10^(3)拷贝/μL)富集率达到61.58%。表明该免疫磁珠能够有效富集SVCV。在免疫磁珠分离技术联合RT-qPCR技术检测水样品中SVCV(浓度约为1.16×10^(4)拷贝/μL)的结果显示,免疫磁珠组富集SVCV核酸量是裸磁珠组富集SVCV核酸量的1.77×10^(3)倍,是未处理组富集SVCV核酸量的1.68×10^(3)倍,免疫磁珠组富集SVCV均极显著高于裸磁珠组和未处理组(P<0.01),裸磁珠组富集的SVCV与未处理组则无显著差异(P>0.05)。本研究首次建立了一种能够有效富集水中SVCV的方法,为SVCV的监测提供了技术手段。 展开更多
关键词 免疫磁珠 鲤春病毒血症病毒 水样品
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从患病的大口黑鲈检出疱疹病毒
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作者 卓玉琛 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1047-1053,共7页
采用超微病理学电镜观察和PCR检测等方法,首次从患病的养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)检出疱疹病毒。病鱼组织超薄切片透射电镜观察结果显示,鳃组织细胞内存在直径约70 nm-80 nm的圆形或双环状核衣壳,空心或小部分核心致密;肝组... 采用超微病理学电镜观察和PCR检测等方法,首次从患病的养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)检出疱疹病毒。病鱼组织超薄切片透射电镜观察结果显示,鳃组织细胞内存在直径约70 nm-80 nm的圆形或双环状核衣壳,空心或小部分核心致密;肝组织细胞内质网所查见部分核衣壳有纤突。所检出病毒的形态学和形态发生学特征符合疱疹病毒目(Order Herpesvirales)的病毒形态。采用鳗鲡疱疹病毒的特异性引物对病毒进行PCR方法检测,从24份患病大口黑鲈的鳃、肝、脾、肾组织混样中检出13份阳性结果。基于大口黑鲈疱疹病毒毒株DNA聚合酶基因片段序列的系统进化树分析,进一步证明该病毒可能是鳗鲡疱疹病毒的成员。 展开更多
关键词 疱疹病毒 大口黑鲈 超微病理学 PCR检测
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美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量:2
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作者 孔文迪 陈曦 +1 位作者 杨金先 葛均青 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期358-365,共8页
为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出... 为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。 展开更多
关键词 美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV) 普通PCR 荧光定量PCR SYBR GreenⅠ 检测方法
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基于核酸适体LYGV1c的酶联吸附法检测石斑鱼虹彩病毒感染 被引量:2
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作者 刘明珠 黄静 +9 位作者 程远 韦云依 牟容丽 黄琳 竺利波 陆兰天 柯珂 陈嘉 余庆 李鹏飞 《广东海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1-8,共8页
【目的】利用核酸适体LYGV1c构建可快速、准确识别石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus Guangxi strain,SGIV-Gx)感染的酶联吸附法(Aptamer LYGV1c-based enzyme-linked apta-sorbent assay,LYGV1c-ELASA),为提高水产疫病检测及防控效率... 【目的】利用核酸适体LYGV1c构建可快速、准确识别石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus Guangxi strain,SGIV-Gx)感染的酶联吸附法(Aptamer LYGV1c-based enzyme-linked apta-sorbent assay,LYGV1c-ELASA),为提高水产疫病检测及防控效率提供理论支持。【方法】基于生物素标记的LYGV1c(Bio-LYGV1c)开发核酸适体酶联吸附法(LYGV1c-ELASA)检测SGIV-Gx,通过对Bio-LYGV1c特异性、灵敏性、稳定性等实验评估其检测性能。通过珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂)SGIV-Gx感染试验进行活体验证,同时用荧光定量PCR(qPCR)测定衣壳蛋白基因(MCP)的表达,与LYGV1c-ELASA进行比较,验证该酶联吸附法检测的可信度。【结果】LYGV1c-ELASA的方法可特异性地识别SGIV的感染,Bio-LYGV1c识别SGIV感染的最适工作浓度为500 nmol/L,最适孵育时间为20 min,最适结合温度为4~28℃,LYGV1c-ELASA最低检测限为5×103 mL-1。活体验证结果表明,随着注射的SGIV-Gx浓度的升高,LYGV1c-ELASA检测出的石斑鱼体内病毒450 nm处的光密度(OD450)的值升高;qPCR结果表明,SGIV-Gx的MCP的表达量升高,与LYGV1c-ELASA检测结果相一致。【结论】建立的LYGV1c-ELASA技术不仅可用于体外检测,同时也适用于活体检测。LYGV1c-ELASA技术可实现对石斑鱼养殖过程中石斑鱼虹彩病毒病的快速诊断、实时监控。 展开更多
关键词 石斑鱼虹彩病毒 检测 核酸适体 酶联吸附法
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基于核酸适体的高通量模型筛选抗大口黑鲈虹彩病毒药物
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作者 张帅帅 刘明珠 +10 位作者 黄静 师德强 陈嘉 柯珂 竺利波 韦云依 牟容丽 陆兰天 杨辉 余庆 李鹏飞 《广东海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期9-16,共8页
【目的】利用可特异性识别大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Largemouth bass virus,LMBV)的核酸适体LBVA1建立药物高通量筛选技术(Aptamer LBVA1-based high-throughput screening,LBVA1-AHTS),以快速筛选有效抗LMBV药物。【... 【目的】利用可特异性识别大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Largemouth bass virus,LMBV)的核酸适体LBVA1建立药物高通量筛选技术(Aptamer LBVA1-based high-throughput screening,LBVA1-AHTS),以快速筛选有效抗LMBV药物。【方法】用探针FAM-LBVA1检测感染不同浓度[感染复数(MOI)分别为0、0.05、0.10、0.20]LMBV 48 h,以及感染LMBV 0、6、12、24和48 h的胖头鱥(Pimephales promelas)肌肉细胞(Fathead minnow cells,FHM)荧光值,并用激光共聚焦及荧光定量PCR(RT-qPCR)验证LMBV感染情况;将利巴韦林、阿昔洛韦、加巴喷丁、茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯等9种药物分别以安全工作浓度与LMBV混匀,加入FHM细胞共孵育,运用探针FAM-LBVA1及RT-qPCR技术检测各组LMBV感染情况,比较两种方法检测的药物抗LMBV感染效果,筛选出有效抗LMBV药物。【结果】探针FAM-LBVA1检测及RT-qPCR技术验证结果均表明,在感染复数(MOI)为0.20、感染时间为48 h时,对LMBV感染的检测效果最佳。9种药物抗LMBV效果筛选结果表明,LBVA1-AHTS技术与RT-qPCR技术两种筛药方法筛选出利巴韦林、加巴喷丁、金刚烷胺、卡马西平、茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯7种药物的抗病毒效果一致,其中茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯3种药物具有抗LMBV的效果,其余4种药物无明显抗病毒效果,两种方法一致率近80%。【结论】建立的LBVA1-AHTS模型可快速、准确、高效筛选出抗LMBV病毒药物,为快速筛选抗病毒药物提供理论和技术基础。 展开更多
关键词 大口黑鲈虹彩病毒 核酸适体 高通量筛选 抗病毒药物
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