根据GenBank中鸭IFN-α基因（GenBank登录号：JF894229）序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因（GenBank登录号：GU564232）为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法（RT-PCR）。将IFN-...根据GenBank中鸭IFN-α基因（GenBank登录号：JF894229）序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因（GenBank登录号：GU564232）为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法（RT-PCR）。将IFN-α和β-actin基因分别克隆至pMD18-T载体上,鉴定出阳性重组质粒为标准品（p-IFN-α和p-β-actin）,分别建立番鸭IFN-α和β-actin实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,Ct值在13.27~27.54与11.86~25.32范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99（r〉0.99）,扩增产物的熔解曲线分析均各自只出现1个特异性单峰,无引物二聚体,Tm值分别为（93.6±0.26）℃和（85.3±0.15）℃,最低检测限分别为9.37×102copies/μL和3.71×101copies/μL,检测周期从样品的处理到荧光定量PCR结束仅需4 h左右。本研究建立的鸭IFN-α基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为番鸭IFN-αmRNA的定量分析奠定了基础。展开更多
文摘根据GenBank中鸭IFN-α基因（GenBank登录号：JF894229）序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因（GenBank登录号：GU564232）为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法（RT-PCR）。将IFN-α和β-actin基因分别克隆至pMD18-T载体上,鉴定出阳性重组质粒为标准品（p-IFN-α和p-β-actin）,分别建立番鸭IFN-α和β-actin实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,Ct值在13.27~27.54与11.86~25.32范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99（r〉0.99）,扩增产物的熔解曲线分析均各自只出现1个特异性单峰,无引物二聚体,Tm值分别为（93.6±0.26）℃和（85.3±0.15）℃,最低检测限分别为9.37×102copies/μL和3.71×101copies/μL,检测周期从样品的处理到荧光定量PCR结束仅需4 h左右。本研究建立的鸭IFN-α基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为番鸭IFN-αmRNA的定量分析奠定了基础。
