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非洲猪瘟病毒单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立与初步应用
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作者 李平 王妍瑾 +9 位作者 姜春怡 王毅 焦丁兴 李封赛 王丽丽 侯桂芳 芮萍 宋涛 杨姗姗 马增军 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第11期1157-1164,共8页
为建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)的快速检测方法,本研究利用真核系统表达后纯化与浓缩的ASFV重组CD2v蛋白(r CD2v)免疫BALB/c小鼠4次,采用杂交瘤技术制备ASFV CD2v蛋白单克隆抗体(MAb)。结果显示,共获得5株稳定分泌ASFV rCD2v MAb的杂交... 为建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)的快速检测方法,本研究利用真核系统表达后纯化与浓缩的ASFV重组CD2v蛋白(r CD2v)免疫BALB/c小鼠4次,采用杂交瘤技术制备ASFV CD2v蛋白单克隆抗体(MAb)。结果显示,共获得5株稳定分泌ASFV rCD2v MAb的杂交瘤细胞株。制备小鼠腹水,利用Protein A/G亲和层析柱纯化制备的小鼠MAb腹水,经SDS-PAGE电泳检测MAb的纯化效果,使用分光光度计测定纯化MAb的浓度,利用间接ELISA方法检测不同浓度MAb的效价。结果显示,5株纯化的MAb均分别在约55 ku(重链)和25 ku(轻链)处分别出现单一目的条带,且MAb的浓度均值为1.02±0.15 mg/mL。效价检测结果显示,除最低浓度外,其余浓度的5株MAb的OD450nm值均大于0.2,其中MAb 11E2的OD450nm值最高。采用过碘酸钠法将5株MAb标记HRP(MAb-HRP),经ELISA法检测标记效果及效价,将5株MAb与5株MAb-HRP两两组合后经双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测,以确定最佳的配对抗体。结果显示,5株纯化的MAb均标记上HRP,当以MAb 6D9作为捕获抗体,MAb 11E2-HRP作为检测抗体时的P/N值最高,因此采用这两种MAb配对进行后续实验。采用棋盘滴定法优化DAS-ELISA的反应条件,优化结果显示,MAb 6D9的最佳浓度为2μg/mL、r CD2v的最佳包被浓度为2.5μg/mL、MAb 11E2-HRP的最佳稀释度为1:400,初步建立了检测ASFV的DAS-ELISA方法。利用建立的DAS-ELISA检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、伪狂犬病病毒和ASFV,评估本研究建立方法的特异性;利用该DAS-ELISA方法检测2倍倍比稀释的ASFV rCD2v(2μg/mL~0.004μg/mL),评估该方法的敏感性;采用同一批次和不同批次rCD2v包被的酶标板,经DAS-ELISA方法分别检测3份ASFV猪阳性血清和1份ASFV猪阴性血清,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能检测ASFV,其他常见的猪源病毒均为阴性结果,特异性强;该方法对rCD2v的检测限为0.0156μg/mL,敏感性高;批内和批间重复性试验的变异系数均在10%以下,重复性好。采用建立的DAS-ELISA与荧光定量PCR(q PCR)分别检测192份疑似ASFV感染的临床灭活猪血清样品。结果显示DAS-ELISA检出108份阳性样品,84份阴性样品;qPCR检出112份阳性样品,80份阴性样品。经计算两种方法的阳性符合率和总符合率分别为96.4%(108/112)与97.9%(188/192)。上述结果表明,本研究建立的DAS-ELISA方法适用于ASFV大规模临床猪血清样品的检测,为ASFV的检测及流行病学调查提供技术支撑。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 重组CD2v蛋白 真核表达 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA
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鹅源新型鸭呼肠孤病毒广西株G-NDRV-GX-2022全基因组分子特征的分析 被引量：2
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作者 谢守玉 魏园园 +10 位作者 熊陈勇 何梦薏 谢颖 郑敏 韦显凯 吕思明 赵子欣 苏文广 李军 黄张玲 熊毅 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期92-98,共7页
为研究鹅源新型鸭呼肠孤病毒的全基因组分子特征及其广西流行株的进化特点,本研究采集广西地区3份发病鹅的肝脏、脾脏、肺脏及肾脏病料样品,采用多重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(NDRV),并以NDR... 为研究鹅源新型鸭呼肠孤病毒的全基因组分子特征及其广西流行株的进化特点,本研究采集广西地区3份发病鹅的肝脏、脾脏、肺脏及肾脏病料样品,采用多重荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(NDRV),并以NDRV阳性样品的核酸为模板,采用RT-PCR分段扩增其全基因组并测序,采用BioEdit软件分析其全基因组序列的相似性;采用NetNGlyc 1.0软件预测NDRVσC蛋白N-糖基化位点;通过Mega 7.0软件绘制σ系列基因的系统发育树及RDP5和SimPlot软件分析NDRV全基因组的重组事件。RT-q PCR结果显示,检出1份NDRV阳性样品,经测序及序列拼接,获得一条鹅源NDRV广西流行株G-NDRV-GX-2022全基因组序列,全长23353 bp,分为L1~L3、M1~M3及S1~S4共10个基因;BlAST分析结果显示,G-NDRV-GX-2022株10个基因与GenBank中相应基因序列的相似性最高为91.2%~98.4%,对应的病毒株均源自中国广东、福建、山东、浙江及湖北等地的NDRV,宿主有野鸭、番鸭、绿头鸭等,表明G-NDRV-GX-2022株基因来源广泛且多样;σC蛋白N-糖基化位点预测结果显示,G-NDRV-GX-2022株与NDRV参考株均为^(121)NLTS^(124);σ系列基因遗传进化树显示,σB、σNS进化树中NDRV参考株均为连续不间断的进化分支,而σA、σC进化树中NDRV参考株为不连续间断的进化分支,且均未呈现流行时间与地域关联的进化特点,表现出生物遗传多样性的特征;全基因组重组分析结果显示,G-NDRV-GX-2022株的M3基因检测到重组信号,主要亲本为野鸭源NDRV SD-12株,二者相似性为95.4%,次要亲本为鹅呼肠孤病毒(GRV)GD2020株,二者相似性为94.3%,证实野鸟与水禽的呼肠孤病毒之间能够发生基因重组。本研究丰富了水禽呼肠孤病毒基因库信息,并为禽呼肠弧病毒分子遗传进化研究提供基础数据。 展开更多
关键词 鹅源 新型鸭呼肠孤病毒 遗传进化
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2015年~2020年江西地方鸡种禽圆环病毒2型流行病学调查与全基因组进化分析 被引量：3
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作者 张帆帆 傅金根 +7 位作者 黄奕雯 罗士仙 涂凌云 方绍培 吴玲 张危红 康冬柳 康昭风 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1332-1337,共6页
为了解江西地区禽圆环病毒2型(AGV2)的流行情况及基因组的遗传进化关系,本研究利用PCR方法对2015年~2020年间采自江西各地区的1 372份地方鸡血清、粪便及内脏组织样品进行AGV2检测。结果显示,江西地区AGV2的阳性率为13.99%(192/1 372),... 为了解江西地区禽圆环病毒2型(AGV2)的流行情况及基因组的遗传进化关系,本研究利用PCR方法对2015年~2020年间采自江西各地区的1 372份地方鸡血清、粪便及内脏组织样品进行AGV2检测。结果显示,江西地区AGV2的阳性率为13.99%(192/1 372),其中育成鸡阳性率最高,为17.16%(98/571),且各生长阶段鸡AGV2阳性率均有逐年升高的趋势。从中选取12份AGV2阳性样品进行全基因组扩增,并对其全基因组序列和VP1蛋白序列进行同源性及遗传进化关系分析,同时对VP1蛋白线性抗原表位进行预测分析。结果显示:选取的12个AGV2全基因组之间的同源性为96.8%~99.8%,其中VP1基因序列的同源性在96.5%~99.9%,氨基酸序列同源性在99.4%~100%;遗传进化分析显示,12个AGV2全基因组分布于进化树的各分支,具有遗传多样性的特征;进一步分析发现AGV2 VP1蛋白氨基酸序列的突变并未导致VP1蛋白疏水性的改变,仅JX201601 VP1出现G36S突变,JX201802 VP1出现Q^(222)R突变,致使VP1蛋白抗原性改变。本研究首次明确了江西地方鸡种中AGV2的流行状况和遗传演化特点,为江西地区AGV2感染的防控提供了重要数据支撑。 展开更多
关键词 禽圆环病毒2型 流行病学调查 进化分析
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猪伪狂犬病毒贵州分离株gE基因的克隆及遗传信息分析 被引量：2
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作者 敖清莹 曾智勇 +6 位作者 徐国 杨霞 何祥艳 何小莉 张爱琼 咸文 叶百川 《山地农业生物学报》 2018年第2期80-84,共5页
为了解贵州地区猪伪狂犬病毒的分子流行现状,本研究提取实验室分离并保存的PRV GZJS2017株病毒核酸作为PCR扩增模板,并对其进行TA克隆、序列测定和用生物学软件进行遗传信息分析。结果表明:本次分离得到的GZJS2017株gE基因所测长度1740 ... 为了解贵州地区猪伪狂犬病毒的分子流行现状,本研究提取实验室分离并保存的PRV GZJS2017株病毒核酸作为PCR扩增模板,并对其进行TA克隆、序列测定和用生物学软件进行遗传信息分析。结果表明:本次分离得到的GZJS2017株gE基因所测长度1740 bp,GC含量为73.97%,通过系统进化树分析结果显示PRV不同地域毒株之间同源率达98.8%~99.9%,说明该毒株gE基因具有高度的保守性。本研究可为今后深入开展PRV gE基因的功能研究提供一些依据。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 GE基因 克隆 序列分析
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疱疹病毒治疗性疫苗研究进展 被引量：5
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作者 刘占 马宁宁 +3 位作者 郭子仪 邓梦梦 史志斌 陈陆 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期133-137,共5页
疱疹病毒感染极为普遍,可表现为原发性、潜伏性或复发性感染,几乎能在所有的动物中建立潜伏感染,且潜伏感染期间病毒保持休眠状态,宿主不表现出任何临床症状,机体在受到一些应激后,潜伏的病毒被重新激活,使机体引起复发性感染。目前预... 疱疹病毒感染极为普遍,可表现为原发性、潜伏性或复发性感染,几乎能在所有的动物中建立潜伏感染,且潜伏感染期间病毒保持休眠状态,宿主不表现出任何临床症状,机体在受到一些应激后,潜伏的病毒被重新激活,使机体引起复发性感染。目前预防性疫苗免疫接种仍是预防疱疹病毒感染和控制其相应疾病流行的有效手段,然而免疫接种后机体免疫系统虽能够控制感染,但却未能防止机体发生复发性感染并不能提供全面的保护。治疗性疫苗能清除潜伏感染或阻止复发性感染,可以有效地控制此类疾病的复发。因此,接种治疗性疫苗是未来防控和净化疱疹病毒的一种可行策略。本文针对在研的疱疹病毒HSV、EBV治疗性疫苗的研究进展进行综述,旨在为其余疱疹病毒治疗性疫苗的研发拓展思路。 展开更多
关键词 疱疹病毒 潜伏感染 治疗性疫苗 防控和净化
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